ヒト胚形成期における栄養芽細胞の単一細胞回収

ヒト移植と初期胎盤の出現は、妊娠が臨床的に検出できないこの段階ではヒト組織にアクセスできないため、歴史的に調査することは困難であり、ほとんど知られていない。ヒトの胎盤は他のユーテリア哺乳類と比較して独自の特徴を持つため、動物モデルは不十分です。例えば、ヒト胎盤は、いくつかの栄養芽細胞が子宮筋膜の少なくとも3分の1に達し、他の細胞が子宮渦巻動脈を改造しながら、デシドゥアに深く侵入する。私たちの最も近い進化の祖先、非ヒト霊長類でさえ、胎盤形態と栄養芽細胞の相互作用の違いを母体の異形組織^11、2、32,と示^す。インビトロで移植前ヒト胚を得る術体は、臨床ヒト体外受精(IVF)が不妊治療のための日常的な診療として始まった1980年代まで不可能であった^4。現在、ヒト胚盤胞をインビトロで増殖させて、より実行可能な胚を移動可能にし、安全な遺伝子検査を可能にすることができる。胚培養技術の改善、ならびにIVFの使用の増加は、患者の治療サイクルが完了した後も残っている多くの余剰胚盤胞を生み出した。患者の同意、IRBの承認、および一定の制限により、これらの胚盤胞は研究研究のために利用することができる。それらはヒト胚性幹細胞⁵の誘導に用いられた貴重な資源となっており、胚性幹細胞^6、77への内細胞塊の転移を理解し、さらに最近⁶では、ヒト移植^88,99を改造するために日(D)13まで培養に成功している。最近開発された単一細胞オミクスアプローチを利用することにより、ヒト胚組織の移植段階へのアクセスは、この非常に動的な細胞分化プロセスを調節する分子メカニズムを記述するユニークな機会を提供^{10,11,12,してきた。}

ここでは、ヒト移植時の栄養芽細胞分化のダイナミクスを特徴づける最近の刊行物で用いる方法^{を説明する12.}このプロトコルには、ガラス化胚盤胞の温暖化、D12ポストIVFまでの拡張胚培養、胚を単一細胞に酵素的に消化すること、および下流アッセイ用の細胞採取が含まれる(図1)。この拡張培養システムは、母親の入力なしにヒト胚発生期の培養期をサポート^,し^{、14年前、15年、16,16}年^、17年前の組織学的標本からの観察と一致して出現する栄養芽細胞分化を再現する。移植中、栄養芽細胞集団は、少なくとも2つの細胞タイプで構成される:単核化前駆細胞様細胞栄養芽細胞(CTB)および末端分化された多核同期栄養芽細胞(STB)。トリプシン消化の際、CTBは、形態学的に他の細胞系語と区別がつかない小さな丸い細胞である(図2A、左パネル)。エピブラストや原始の内胚葉などの他の細胞系統からのCTBの分離は、単一細胞RNAシーケンシングによって明らかにされるそれらの明確なトランスクリプトミックプロファイルによって達成することができる。同期性TROPhoblast細胞は、他の細胞型よりも著しく大きく、主に胚の周囲に位置する不規則な形状の構造として容易に同定することができる(図2A、中間パネル;図2B、左パネル)。回遊性栄養芽細胞(MTB)は、胚拡張培養中に見られるもう一つの栄養芽細胞サブリリネージであり、胚の本体から離れて移動しているように見える(図2A、右パネル、図2B、右パネル)。遊覧栄養芽球は、余分な絨毛性トロホブラスト(EVT)と同じマーカーの多くを表現するが、胎盤の絨毛構造が開発のこの非常に初期の段階で出現していないので、EVTと呼ばれるべきではない。

実験的に、胚がD8、D10、およびD12で単一細胞に消化された後に容易に識別可能な小さなCTBおよび大きなSTBを収集することができた(図2A、B)。渡り性栄養芽細胞は、拡張胚培養の後期段階で生じ、胚全体の酵素消化の前にD12で収集することができる(図2A,B)。単一細胞解析の前にこれら3つの栄養芽細胞副系統を分けることによって、我々は特定の転写マーカーを同定し、各細胞タイプの生物学的役割を定義することができる。細胞トトロホブラストは増殖性が高く、STBおよびMTB分化系統^{10、11、12、13,12,}を供給する前駆細胞として作用する。^10,13シンクジオトロフォブラストは、妊娠を維持するために胎盤ホルモンの産生に関与し、子宮内膜^{10、11、12、13,11,12}に巣を掘る胚の原因でもある。^,13回遊性栄養芽球は、侵襲的な、回遊性表現型のさらに強い特徴を有し、子宮内膜^{10、11、12、13,11,12}のより深く、より広範なコロニー形成を担う可能性が高い。^,13各細胞型の転写シグネチャを定義した後、クラスタリング分析はまた、CTBと形態学的に区別がつかない細胞の2つの追加サブセットを明らかにし、それぞれSTBおよびMTBの特徴を有する転写体を有していた¹²を有する。これらの中間段階の細胞は、CTBからMTBまたはSTBのサブリニアのいずれかに分化する過程にある可能性が高く、胚が盲目的に消化され、細胞がトランスクリプトームだけで分離された場合、見落とされていたであろう。

ここで説明するプロトコルは、2次元(2D)培養系を利用しており、3次元(3D)構造開発を支持するのに最適でない可能性があり、新開発された3D培養システム¹³を記述する最近の刊行物で示唆されている。それにもかかわらず、この2D系では、初期の栄養芽細胞の分化は、生体内試料^{14、15、16、1715,16,17}からの観測と一致しているようです。¹⁴このプロトコルはまた、最近説明した3D培養システム¹³における使用に対して、最小限の変更で容易に適応され得る。すべてのステップは、市販の使い捨てチップを備えたハンドヘルドマイクロマニピュレーションピペット、またはゴムチューブ、フィルター、マウスピースに取り付けられた細かく引っ張られたガラスピペットからの口ピペットで行われます。

すべてのヒト胚は、研究に使用するための同意を得て寄付されています。拡張ヒト胚培養の議定書は、西洋制度審査委員会(研究第1179872)によって承認され、国際的なガイドラインに従っている。ヒト胚の使用は、このプロトコルを使用して研究機関に関連する適切な倫理および統治機関によって見直されなければならない。

1. 準備

1. 無菌層流れフードで胚の温暖化の1日前に培地と回収プレートを準備します。
   1. 10%v/v血清タンパク質代替(SPS)で2mLの胚盤胞培養培地(BM)を調製します。
      注:胚盤胞培養培地は、タンパク質を添加して含有する場合と含まない場合があります。ここでは、示されたアルブミンタンパク質の10%を補わなければならない培地を用いた。この補給のバリエーションについては、製造元のガイダンスを確認してください。すべてのメディアは、平衡化前に滅菌シリンジに取り付けられた無菌0.22 μMフィルタを使用してフィルタリングする必要があります。
   2. 500 μL の胚培養グレードオイルで覆われた 10% v/v SPS で、2 つのセンターウェル臓器培養洗浄皿に BM 500 μL を充填します。
   3. 60mmの組織培養皿では、胚培養油の層8 mLを、培養プレートの底に10%v/v SPSでBMの20μL滴を固定する。温めた胚ごとに1滴を作ります。
      メモ:必要に応じて、メディア、ドロップ、洗い物を増やしてください。油を重ねる前に、滴を皿に加えてもよい。油の下に滴を固定することは蒸発およびオスモルのそれ以降の変化を減らすのに役立つ。
   4. BMを37°Cのインキュベーターで10%v/v SPS洗浄皿と回収プレートと平衡化_{し、6%CO2、5%O2}を少なくとも4時間分のインキュベーターで洗浄します。₂
   5. 拡張培養培地(IVC1)の第1工程のバイアルを4°Cまたはベンチトップに解凍します。
   6. オイルオーバーレイなしでIVC1の500 μLの1つの洗浄皿を準備します。アリコート約4 mLのIVC1を5mLスナップキャップチューブにします。
   7. IVC1洗浄皿とIVC1の小型スナップキャップチューブを37°C、6%CO2、大気_O2を少なくとも4₂時間平衡化する。
2. 無菌層流れフードで胚の温暖化の1日前に拡張培養プレートを準備します。
   1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でヒト血清から30μg/mLにシブロネクチンを希釈。250 μL の 30 μg/mL フィブロネクチン 1 胚あたりは、チャンバーをコーティングする必要があります。
   2. 井戸に触れないように気をつきながら、ボンネットの下に8ウェルチャンバーカバースリップパッケージを開きます。ピペット250μLの30μg/mLフィブロネクチンを各ウェルにそっと入れ込みます。
   3. 蓋をチャンバーカバースリップに戻し、4°Cに20〜24時間置きます。
3. 胚の温暖化の朝に拡張培養プレートを準備します。
   1. フィブロネクチンでチャンバーカバースリップを取り出し、ラミナーフローフードに入れます。フィブロネクチン混合物を1 mLピペットで取り除き、廃液容器に捨てます。
   2. 小さい5 mLのスナップキャップの管から温め、平衡化されたIVC1メディアを取り出す。
   3. 平衡化されたIVC1のピペット300 μLを各ウェルに入れます。汚れのリスクが高まるので、液体が蓋に触れないように注意してください。
   4. IVC1でチャンバーカバースリップを戻し、ステップ4で透明帯を除去するまで37°C、6%CO2、大気_O2でインキュベートします。_2,

2. ガラス化D5ヒト胚の温暖化

注: 他のメーカーは、独自のガラス化技術に応じて、わずかに異なるプロトコルを持っている可能性があります。該当する場合は、製造元のマニュアルを参照してください。

1. 35mm皿で3.0mLの解凍液(TS)を37°Cに温めます。 300 μL の希釈液 (DS) と 300 μL の洗浄液 (WS) 2 つのウェルを 6 ウェルプレートに室温に入れます。
2. 鉗子を使用して、慎重に凍結装置の袖を取り外し、ガラス化胚が常に液体窒素の下に残っていることを確認する。
3. 液体窒素から迅速にクライオ装置を移動し、37°CでTSでクライオデバイスの先端を突き落とします。 1分間タイマーを設定し、胚がTSに切り離されるまでクライオデバイスを水没させ続けます。
   注:温かい胚は、下流の分析における患者の人口統計情報に関連する可能性があるため、胚の同一性を追跡するために一度に1つずつ。
4. TSの1分インキュベーション中に、慎重にクライオデバイスを取り外し、胚をそっと拾い、TS皿の反対側に移動します。
   注:複数の胚を培養する場合は、適切なアイデンティティが維持されるように胚を別々に保つために勤勉である。
5. 1分後、少量のTS(約2μL)でゆっくりと胚を拾います。胚をピペットからTSの薄い層で覆いながら、胚を300μL DSの底によく動かします。タイマーを3分間セットし、6ウェルプレートを室温でベンチトップに置きます。
6. 3分後、少量のDS(約2μL)で胚をピックアップし、300μLのWSを含む次のウェルの底に胚を移動します。繰り返しますが、胚の上にピペットから少量のDSを穏やかに重ねます。5分間タイマーを設定し、ベンチトップに戻ります。
7. 5分後、最小量のWSで胚を拾い上げ、300 μL WSの最終ウェルの一番上に移動します。胚はゆっくりと落下し、WSを通って底まで洗います。保持された WS をピペットから空の井戸に排出します。
8. 最小の容積で胚を拾い、WSの同じ300 μLの井戸の上に戻る。胚は再び井戸の底に落ちるでしょう。タイマーを1分間セットし、6ウェルプレートをベンチトップに戻します。

3. 温められた胚の回復

1. 温めた胚を、500μLの平衡型胚培養グレードオイルの500μL下に10%v/v SPSで平衡型のBMの500 μLを含む中ウェル臓器組織皿に移動させます。
2. 各胚を拾い、移動の間に古い媒体を吹き飛ばしながら、皿の中のいくつかの領域にそれらを移動することによって胚を洗います。胚をピックアップし、油の下で10%のv /v SPSと平衡化されたBMの個々の20 μL培養液の低下に移動させる。
3. 温めた胚を37°Cのインキュベーターで2時間回収させ_{、6%CO2、5%O2} を得た_。

4. ゾナ除去

1. 2時間の回復後、胚の再拡張を評価し、各胚の写真を撮る。
2. 3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)緩衝用培地の500 μLで胚を個別に移動させ、酸性タイローデの溶液で処理する前に5%(v/v)胎児子牛血清(FCS)を用いた。
3. 顕微鏡を積極的に見ながら、300μLの温めた酸性タイローデの溶液を通して1つの胚を素早く動かします。透明帯は視覚的に溶解し始めます。これには約5sかかります。
4. すぐに溶解したソナを含む胚を300 μLの温められたMOPS緩衝媒体に移し、酸タイローデの溶液を急いで止めます。
5. MOPS緩衝培地の最小体積で胚を、500μL以下の平衡胚培養グレードオイルの500μL以下の10%v/v SPSを有する平衡型BMの500μLを含むセンターウェル臓器組織皿に移して洗浄する。
6. ステップ3.2から20μLの回収降下に胚を戻します。
   注:ゾナ除去後の目視検査の際、透明帯を保持している胚は、必要に応じて酸性タイローデの溶液でさらに処理され、ステップ4.2〜4.6を繰り返す。タイローデの溶液への暴露を最小限に抑えるのが望ましい。

5. 胚盤胞拡張培養

1. ステップ1.1.6から平衡化されたIVC1培地で、胚を洗い皿に個別に移動します。1つの胚を平衡化されたIVC1でチャンバーカバースリップの1つの井戸に慎重に移動し、胚の識別を維持する。
   注: この手順は、中程度の蒸発を最小限に抑えるために、できるだけ早く完了する必要があります。
2. チャンバーカバースリップを37°C、6%CO2、大気中_O2に2日間セットしたインキュ₂ベーターに戻します。
   注:37°C、6%CO2、大気中_O2でメディア交換4時間前に解凍して平衡₂化してください。
3. 成長D2(受精後D7)では、顕微鏡下で胚の付着を注意深く調べ、培地交換を行う。
   1. メディアを交換する前に、どの胚が皿に取り付けられているかをメモします。プレートを軽くタップし、胚が顕微鏡下のプレートにしっかりと付着しているかどうかを調べます。
   2. 蓋を外し、IVC1の150μLを慎重に取り除き、取り付けられた胚を邪魔することなく廃棄します。胚がまだプレートに付着していない場合は、IVC1の血清が胚の付着に役立つため、培地を交換しないでください。
   3. 平衡化された拡張培養培地のピペット150μL、IVC2は、各ウェルにゆっくりと入り、蓋をチャンバーカバースリップに戻す。
      注:チャンバーカバースリップから蓋を取り外して、中程度の蒸発を避けるようにしてください。
4. 蓋にメディアをはねずにチャンバーカバースリップを慎重に戻します。胚が固定または単一細胞消化の準備が整うまで、拡張培養の毎日のメディア交換と添付ファイルチェックを繰り返します。

6. 使用済みメディアのコレクション (オプション)

1. 必要に応じて、D7後またはその日の後に培養メディアの交換中に使用済みメディアを収集します。ステップ5.3.2の間に、除去されたIVC1の150 μLを無菌、低結合の0.5 mLチューブに廃棄して将来の分析を行う代わりに。

7. 免疫蛍光の任意固定

1. 200 μL ピペットを使用して、細胞外の破片を除去するために、3x の PBS の 1/2 メディア交換で胚を洗浄します。過剰な破片やタンパク質を洗い流すと、蛍光を用いて得られた画像の明瞭度を最適化し、背景を減らすことができます。
2. すべての媒体を取り出し、PBS内の200μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)をウェルにゆっくりと加えます。胚は流体の表面に固執したいと思うでしょう。すべての流体を除去する前に4%PFAで150 μLの複数の150 μLのスリーチは、胚への損傷を最小限に抑えるのに役立ちます。
3. 固定のために20分間4%PFAで胚をインキュベートする。
4. 新鮮なPBSで200 μLの0.1%vのポリソルベート20で、1回の洗浄につき10分間、胚3倍を洗浄します。
5. 固定胚を4°CでPBSに0.1%v/vポリソルベート20で保存してから、免疫蛍光プロトコルを使用します。

8. トリプシンを用いて単細胞消化

注:新鮮な(固定されていない)胚は、単一細胞消化に使用されます。

1. 200 μLのPBSで胚を1回洗い、各ウェルに200 μLのトリプシン溶液を加えます。チャンバーカバースリップをインキュベーターに5分間戻します。
2. チャンバーカバースリップをインキュベーターから取り外し、ステレオスコープ下の胚を調べます。胚の周囲の細胞は引き込み始め、MTBは依然として胚から遠隔に位置するプレートに取り付けられるべきである。
3. 小さなピペットまたは細かく引っ張られた口のピペットを使用して、胚全体を分解する前に個々のMTBを拾います。ステップ 9.1 に進んで MTB を保存し、ステップ 9.3 の後にステップ 8.4 に戻ります。
4. ハンドヘルドマイクロマニピュレーションピペットまたは口ピペットを使用して、上下に吸引することによって胚を優しく解きそめます。
5. 細胞は胚全体から解離し始める。トリプシンで合計10分間インキュベートされるまで、小径のピペットチップまたは口ピペットを使用して、胚を穏やかに繰り返し吸引し続けます。

9. 単一セル選択とサンプルコレクション

1. 最小限のトリプシンで、解離した細胞を20μL PBS+0.1%ポリビニルピロリドン(PVP)の3滴の洗浄液を介して、細胞を失わないように注意して胚培養油の下で移動させます。
2. 細胞を洗浄した後、細かく引っ張られたガラスピペットを使用して1つのセルを選択します。PBS+0.1%PVPの最小容量の無菌0.2 mL低結合チューブに慎重に単一の細胞をピペット。
3. 液体窒素_(LN2)で単一細胞を凍結し、将来の使用のために-80 °Cで保存します。

健康な胚は、拡張培養の過程で増殖を続けた(図2B)。異常な胚は外縁から後退し、崩壊し始めた(図2C)。我々の経験から、胚の約75%がフィブロネクチンコーティング皿の底に48時間で付着し、その付着物は培養で約90%増の72時間となった。胚の付着の成功は、胚盤胞の初期品質によって大きく影響を受ける可能性があります。72時間までに付着していない胚は生き残らない可能性が高い。

D8受精後(D3の拡張培養)において、胚の大部分の細胞は、トトロホブラストマーカーGATA3に陽性であったCTBであった(図3A)。細胞栄養芽細胞は、すでに胚の周囲に多核STBに分化し始めていた(図2B、左パネル、点線)。これらのSTBはシート状の外観を持ち、ヒト絨毛性ゴナドトロピンサブユニットβ(hCGB;) 図3A、センターパネル)。胚はD8とD10の間で急速に成長し、この期間中にCTBの急速な細胞増殖を示唆した。D10では、CGB陽性MTBの形成は最大であり、この時点でのhCG産生の盛り上がりによって確認できた(図3B)。回遊性栄養芽細胞も出現し、胚体から離れ、EVTマーカーHLA-G(図3A、右パネル)に陽性染色された。D12によって、STB分化は減少し、MTB産生はより顕著になり、D10のホルモン産生からD12の細胞遊泳への重点のシフトを示唆した。これらの変化は、この移植期の間に得られたタイムラプスビデオ(Movie 1)によって観察された。当社の単一細胞RNAシーケンシングデータは、細胞機能の動的変化も反映しています。これらのデータは一緒に、早期の栄養芽細胞分化を示唆し、早期胎盤の出現は動的プロセスであり、その間、胚は非常に特定の時点で高度に特殊化された細胞機能を優先して移植を成功させることができる。

図 1: 拡張培養および単一細胞サンプル収集の手順図。
地球温暖化性ガラス化胚、透明体除去、拡張胚培養、酵素消化、細胞トトロフォ芽細胞(CTB)、シンジトロホブラスト(STB)、および回遊性トロフォブラスト(MTB)の分離。この図は、西ら12から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:拡張培養中の栄養芽細胞および胚の形態
(A) トリプシンによる酵素消化後の異なる栄養芽細胞タイプの代表的な画像。左側に小さなCTB、中央に大きなSTB、右にMTB。(B) D8(左)、D10(中央)、D12(右)における健康胚の代表的な画像。左パネルの破線は、おそらく増殖性のCTB集団を概説し、点線は平坦化されたSTBを概説する。右パネルのピンクの円は、胚から遠隔に位置していたMTBをアウトラインします。(C)D8(左)、D10(中央)、D12(右)で退避し始める異常胚の代表的な画像。Cスケールバー= 200 μm。いくつかの画像は、西ら12から適応されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:拡張培養中の栄養芽細胞マーカー発現及びhCG産生の代表的な画像。
(A)D10におけるCTBマーカーGATA3の発現を示す胚の代表的な免疫蛍光画像(左)、D10でのSTBマーカーCGB(中央)、およびD12でのMTBマーカーHLA-G(右)。Aスケールバー= 200 μm(B) D8からD12までの拡張培養の過程における代表的なhCG濃度(mIU/mL)(平均±SEM、n = 3)。統計解析は、一方向 ANOVA を使用した後、Tukey の検定 (P < 0.05) を使用して行いました。これらの画像は、西ら12から適応されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

動画1:D8からD12までの拡張培養におけるヒト胚のタイムラプスビデオ。 ビデオは、ブラストコアエルの崩壊、STBの形成(緑の円で示される)、そしてMTBの最終的な分化と移行(オレンジ色の円で示される)を示しています。これは西ら12.から適応されている。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

著者らは開示するものは何もない。