血管形成術治療患者における局所循環単核前駆細胞を用いた切断の予測

サマリー

下肢切断は、重篤な四肢虚血(CLI)における閉塞血管形成術の後でも起こり得る。単核前駆細胞(Mpc)は血管修復を反映する。本プロトコルは、血管形成術に近い循環からのPPCの定量化、および内皮機能不全との関係および下肢切断の予測を記述する。

要約

重篤な四肢虚血(CLI)は末梢動脈疾患の進行期を表す。血管形成術は下肢への血流を改善する;しかし、一部の患者は不可逆的に四肢切断に進行する。血管損傷の程度および血管修復のメカニズムは、血管形成術後の結果に影響を与える因子である。単核前駆細胞(Mpc)は血管損傷および修復に反応し、血管疾患を反映する能力を有する。本プロトコルは、血管形成部位に近い血管からの血液循環から得られたMpCの定量化、ならびに血管形成障害との関係およびCLI患者における血管形成術後30日間における四肢切断の予測能力を記述する。

概要

末梢動脈疾患(PAD)は、血液供給の制限を伴う慢性および進行性の血管閉塞を特徴とする^1。世界規模では、下肢のPADは高齢者人口の約10%に影響を及ぼし、その最大7%は四肢切断^2、3に提出される。

クリティカルリム虚血(CLI)はPAD¹の最も深刻なプレゼンテーションを表します。患者は通常、閉塞した動脈に起因する安静時、潰瘍、または壊疽で痛みを経験する。臨床予後は好ましくない一方で、1年³年^、4、5の間に四肢切断と死亡の30%のリスクによってマークされています。

血管形成術は、CLI患者の下肢への血流を回復させることができる低侵襲血管内処置である。しかし、血管形成術^1,5の後でも、一部の患者は必然的に大きな四肢切断を必要^とする。血管形成術後の不利な結果の早期同定は、治療執行の可能性のために非常に貴重である。

従来の危険因子は、血管形成術⁶を受けるCLI患者における主要な四肢切断に対して限られた予測能力を提供するかもしれない。病態生理性バイオマーカーは、潜在的な臨床応用を有する新規の方法を表し、血管損傷に関連する疾患に特に有用な^{結果をもたらす可能性がある7。}今日では、内皮修復特性を所有する細胞集団の参加は、アテローム硬化性プラークの部位において^、8,9に^{ますます認められている}。

単核前駆細胞(MPC)は、血管再生能力を有する幹細胞の骨髄および独自の構造的および機能的特性に由来する。増殖するMPCの能力のために、移行し、血管の遵守を示す;これらの細胞は虚血^10、11、12に応答して内皮修復を反映する良い候補となっている。また、血管損傷の根底にあるメカニズムへの継続的な関心は、局所的に生じるバイオマーカーの予後的役割を探求する動機^{となっている。}

本研究の目的は、血管形成術を受けているCLI患者の血管閉塞に近い循環するPPCの量を決定する方法を説明することです。内皮機能不全と四肢切断の指標を持つMpC間の関係を評価する方法。

併存症と固有の血管特徴に基づく予後と比較して、局所的なPPCの量は、内皮機能不全および四肢切断に関する臨床結果を予測する特定の能力を示す。一貫して、いくつかの研究は、PAD^15、16を有する患者の評価中に同様のバイオマーカーの予後の役割^を説明^している。

前の結果⁷に基づいて、ここで説明する方法は、下肢および冠動脈虚血、脳卒中、血管炎、静脈血栓症および血管損傷および修復を伴う他の人々のようないくつかの臨床において、不利な血管転帰の危険性がある集団の早期同定に有用であり得る。

プロトコル

セントロ・メディコ・ナシオナル「20デ・ノビエンブレ」ISSSTEの機関研究倫理委員会は、この将来のプロトコルを承認し、登録されたすべての患者が書面によるインフォームド・コンセントを提供しました。

1. 下肢の血管ブロック、血液採取、バルーン血管形成術の評価

注:この実験に使用された研究サンプルは、68歳と20人中10人の20人の糖尿病患者で構成されていました。サンプルの半分は喫煙者であり、最も一般的な共罹患率は2型糖尿病、全身動脈性高血圧および/または脂質異常症であった。サンプルは、年齢、性別、共罹患率のために標準化されることを意図していました。MPCとCLIの関係に対する臨床的・人口統計学的影響によるバイアスの可能性は排除できなかった。

1. ラザフォード分類¹³ に従って四肢虚血の臨床的重症度を評価する( 補足表1参照)。
2. 下肢血管造影、血液採取、バルーン血管形成術を行う。
   1. 手術前に抗凝固薬と麻酔薬を使用してください。
   2. 選択した鼠径部の血管に18Gの針を入れます。
   3. 紹介者を配置し、フレキシブルガイドワイヤーを進めます。次に、初期ガイドは、さらに6Fr導入者に対して変更される。
   4. 透視的なガイドの下でのコントラスト媒体または_CO2の周期的な注入を使用して、動脈の軌道および血管閉塞部位を同定する(図1)。
      注:コントラストメディア40cc、0.9%生理食塩水で1:1、または12 psiの圧力で1ショットあたり10〜20 mLの_CO2 を使用してください。
   5. 2 本の 0.014 Fr ナビゲーション ガイド ワイヤと 2 本の 0.014 Fr サポート ガイド ワイヤを船舶に導入し、ブロックされた場所まで進めます。
      注:2つの0.014 Frガイドワイヤ(260 cmの長さ)がナビゲーションに使用され、2つの0.014 Frガイドワイヤー(260 cmの長さ)は、単一の手順の間にサポートのために使用されます。
   6. 5 Frおよび3 Frのカテーテルを順次導入し、血管閉塞に最も近い部位から10mLの血液を採取する。氷の上の血液サンプルを維持します。
      注意:カテーテルサイズは5 Frおよび3 Frであり、手順中に変更されます。
   7. ガイドワイヤーをもう一度進めます。次に、血管形成術のバルーンカテーテルを導入し、カテーテルの端に位置する膨張可能なバルーンを含む。血管形成術バルーンカテーテルを進め、バルーンを病変部位に置きます。血管壁に位置する遮断歯垢に対してバルーンを膨らませることによって血管形成術を行う。血流の回復を確認します。
      注:ステントは、手順の後に動脈を開いたままに保つためにブロックされた領域に配置することができます。
   8. カテーテルを導入し、血管ブロックに最も近い部位に進む。血管形成術後30分間隔で10mLの血液を採取する。氷の上の血液サンプルを維持します。
      注:血管形成術の前後の血液サンプルの収集は、血管形成術がPPCの数に及ぼす影響をさらに評価するために推奨されます。
   9. 蛍光ガイドですべてのワイヤを取り外します。
   10. 術後の治療手順を提供します, 1 mg/kg 皮下12時間、アスピリン100mg、スタチン、および鎮痛でエノキサパリンを使用した抗凝固療法を含む.24時間の間に血管穿刺の部位で圧縮する。

循環単核前駆細胞(Mpcs)の定量化 (図2)

1. 新鮮な15 mL円錐形チューブに、採取した血液の6 mLを移し、PBSで1:1(v/v)を希釈します。
   注:採取から1時間以内に血液を処理してください。
2. 密度勾配分離の準備をして、それぞれ3本の試験管に2mLの濃度勾配媒体を加える。次に、希釈した血液の3等量のアリコートを各試験管に加える。
   注:試験管の最大容量の4分の3を超えないようにしてください。
3. 遠心分離機 1,800 x g で 30 分 4 °C. ピペットを使用してリングとして存在するインターフェイス層を収集し、新しいチューブに転送します。PBSを2mL加え、4°Cで6分間1,800 x g でスピンします。 これは、PPCが含まれるようにペレットを保存します。
4. ステップ2.3に記載されているように遠心分離によりPPCを含むペレットをPBSで洗浄する。洗浄ごとに新鮮なPBSを使用し、4°Cで2分間1,800 x g で回転します。 この処理を 6 回繰り返します。
5. 最後の洗浄後、1 mLのPBSを使用して細胞ペレットを再懸濁します。20 μLのセル懸濁液を0.4%のトリパンブルー、1:1(v/v)で希釈します。この細胞懸濁液の10 μLを、ヘモサイトメーターと光顕微鏡を用いた細胞計数に使用してください。
6. アリコート1 x 10⁶ MPCは、以前にラベル付けされた5 mLフローサイトメトリーチューブに含まれる。
   注:対応するアイソタイプ一致対照抗体を準備してください。
7. チューブを1,800 x g で4°Cで6分間遠心分離します。 吸引し、上清を捨てる。
8. 抗体インキュベーション溶液の100 μLで希薄な一次抗体[1x PBS,pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0.05%]とチューブに添加します。10 sで再中断し、暗闇の中で4°Cで20分間インキュベートします。
   注:本プロトコルで使用される一次抗体の最終濃度はCD45 1:50、CD34 1:20、KDR 1:50、CD184 1:20、CD133 1:50であった。プロトコルは、PBSで4%パラホルムアルデヒド中のリンパ球を固定し、4°Cで24時間までサンプルを保存することによって、このステップで停止することができる。
9. 4°Cで2分間1,800xgの遠心分離機を使用し、上清を捨てます。 500 μL の 1x PBS、pH 7.4、EDTA 2 mM で再中断します。
10. フローサイトメトリー解析を行います。
    1. アイソタイプに一致した対照抗体を使用して背景を設定します。次に、FSC/SSCプロットでは、広がったリンパ球を選択し、細胞の破片、残存顆粒球、および他の粒子を除外しようとした。このような分布は100%と考えられる。
       注:リンパ球は通常、プロットの左下領域に広がっています。
    2. CD45⁺および CD34 + の細胞数が多い一般的な免疫フェノタイプのゲートを使用します。次に、以前に CD45⁺、 CD34⁺を同定したゲートを使用して二重陽性免疫フェノタイプを選択し、KDR (VEGFR-2)⁺、 CD133⁺または CD184⁺のいずれかを追加します。特定のセル表面マーカーによって、Mpc サブ集団を識別します。ゲート イベントの割合としてレポートします。
11. MPC の主なサブ人口を識別します。本研究では、分析した免疫フェノタイプはCD45+CD34+CD133+^であった。CD45⁺CD34⁺CD184⁺;CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺;CD45⁺CD34⁺KDR⁺;CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺および CD45⁺CD34 +^KDR+CD184^7,17.
    注:これらの細胞表面マーカーは、CD45(リンパ球)、CD34(内皮および/または血管細胞)、KDR(VEGFR-2)(内皮細胞の膜マーカー)、CD133(内皮前駆細胞)およびCD184(造血幹細胞および内皮細胞)の研究に使用された。

3. MPCと内皮機能の変化と血行力学的検査(FMD)の関係

1. フロー媒介拡張(FMD)、前および後血管形成術を決定する。
   1. 血管線形トランスデューサを使用して、上腕動脈の直径を測定します。
   2. 前腕の測定部位の上に血圧計のカフを置き、収縮期血圧の上に50mmHgで5分間収縮させ、収縮させます。
   3. 次の60s内の上腕動脈の直径を再び決定する。FMD を推定するには、以下の式を使用します。
      注: 100 /基底直径を×式(%)=(一過性虚血後の最大直径 - 基底直径)を使用して拡張の程度を計算します。
2. MPC の数を、FMD のベースライン FMD 値および血管形成後デルタと相関します。

4. 四肢切断のためのMpcの予後能力

1. バルーン血管形成術および患者の退院後の定期的な医療予約をスケジュールして、下肢への血流の質を評価する。
2. 血管形成術後2週間で四肢虚血の臨床的重症度を評価する。ラザフォード分類¹³に従って、休息の痛み、下の虚血、および機能的な足の保存を解決することを評価する。
3. 四肢虚血の臨床的重症度を比較, ベースラインとフォローアップで.不利な結果のために大きな切断を必要とするケースを特定します。
4. PPCの数を下肢の大切断を必要とする患者の割合と相関させる。

結果

閉塞した動脈からの血液サンプルは、血管形成術に対処した部位で、68歳と20人中10人の糖尿病患者から採取された。サンプル人口の半数は喫煙者であった。血管病変は主にラザフォード級VIとして採点された。一方、患者は2型糖尿病(100%)の有病率が高く、高血圧(70%)が高いと脂質異常症 (55%)

下肢血管形成術が行われた後の30日間の臨床フォローアップ。血管形成術後のベースラインまたはダイナミクスにおけるMPC亜集団の割合は、FMDによって評価された内皮機能不全の程度と相関(スピアマン分析)した。そして、血管形成術後に四肢切断を受けている患者間で比較されたMpcのベースライン数(U-Mann Whitney)。この研究は、ベースラインMPCサブ人口^CD45+CD34+^KDR+がFMD(図3A、左)と負相関しているのに対し、MPCCDCD45+CD34+CD133+CD133+CD184+血管形成術後の変化はFMD改善と有意に相関することを示した(

ディスカッション

血管ブロックの正確な部位での採血は技術的な困難を示す可能性があります。したがって、血管ブロックに近接して採血を行った。同様に、血管プラークに近いPPCの量は非常に動的であり、血管形成術の前後にバリエーションを生じる可能性があります。我々の観察によると、血管損傷および修復内で起こるいくつかの病因生理学的プロセスを反映する可能性があるため、MPCの数のベースラインおよび30分後血管形成術の変化を評価することが推奨される。

Mpcs判定のための血液サンプル処理は、最初の3時間以内に行うことを推奨します。したがって、適切な組織計画、さらには以前のシミュレーションの実践は、血管管外科チームと研究室の研究者との間で確立される可能性があります。MPCの分離は慎重に行われるべきであり、特に血液サンプルを密度勾配およびMPCを含むペレットの投下に分解する。我々のグループは細胞を細胞測定管に移し、一次抗体を加え、固定し、細胞を4°Cで一晩保存するために使用する。時間管理の便宜性のために、フローサイトメトリーの読み取りは翌日に行われる。

血管損傷お...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BSA	ロシュ	10735086001	ウシ血清アルブミン(BSA)を緩衝剤、安定剤、標準剤、およびブレンド用
キャリブレーションビーズ	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuantキャリブレーションビーズは、0.05%アジ化ナトリウムを含む水溶液で供給されます。最大100回の検査で3.5 ml
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	PBS/EDTAバッファーCD184
(CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	でR-フィコエリトリンに結合した抗体モノクローナル、アイソタイプ組換えヒトIgG1、結合
型CD309(VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	PBS/EDTA緩衝液中のR-フィコエリトリンに結合した抗体
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	モノクローナル抗体クローンAC136は、CD34のクラスIIIエピトープを検出 CD45
- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	モノクローナルCD45抗体、ヒト標識
コニカルチューブ	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15mlコニカル遠心チューブ
サイトメトリーチューブ	FALCON Corning Brand	#352052	5mLポリスチレン丸底チューブ 12x75スタイル。不妊。
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	金属、(Pbとして) <10ppm、鉄<0.01%、AS<1ppm、不溶性物質<0.005%
改善されたノイバウアー	ブランドなし	番号なし	細胞計用血球計算盤。(範囲0.1000mm、0.0025mm2)
K2 EDTA採血管	バキュテナー	#367863	ライラックプラスチックバキュテナーチューブ(K2E)10.8mg、6mL。
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	滅菌済みで、エンドトキシンの存在を確認しました。密度:1.077±0.001g/mL
パラホルムアルデヒド	SIGMA-ALDRICH		生体試料の固定、(粉末、95%)
ピペットトランスファー 1,3mL	CRM グローブ	PF1016, PF1015	トランスファーピペットは、より精度の高い液体移送を容易にするツールです。
試験管	KIMBLE CHASE	45060 13100	耐熱試験管。サイズ/キャップ 13 x 100 mm

として使用します。重カタログBD #SZBF0920V