血管形成術治療患者における局所循環単核前駆細胞を用いた切断の予測

Summary

下肢切断は、重篤な四肢虚血(CLI)における閉塞血管形成術の後でも起こり得る。単核前駆細胞(Mpc)は血管修復を反映する。本プロトコルは、血管形成術に近い循環からのPPCの定量化、および内皮機能不全との関係および下肢切断の予測を記述する。

Abstract

重篤な四肢虚血(CLI)は末梢動脈疾患の進行期を表す。血管形成術は下肢への血流を改善する;しかし、一部の患者は不可逆的に四肢切断に進行する。血管損傷の程度および血管修復のメカニズムは、血管形成術後の結果に影響を与える因子である。単核前駆細胞(Mpc)は血管損傷および修復に反応し、血管疾患を反映する能力を有する。本プロトコルは、血管形成部位に近い血管からの血液循環から得られたMpCの定量化、ならびに血管形成障害との関係およびCLI患者における血管形成術後30日間における四肢切断の予測能力を記述する。

Introduction

末梢動脈疾患(PAD)は、血液供給の制限を伴う慢性および進行性の血管閉塞を特徴とする^1。世界規模では、下肢のPADは高齢者人口の約10%に影響を及ぼし、その最大7%は四肢切断^2、3に提出される。

クリティカルリム虚血(CLI)はPAD¹の最も深刻なプレゼンテーションを表します。患者は通常、閉塞した動脈に起因する安静時、潰瘍、または壊疽で痛みを経験する。臨床予後は好ましくない一方で、1年³年^、4、5の間に四肢切断と死亡の30%のリスクによってマークされています。

血管形成術は、CLI患者の下肢への血流を回復させることができる低侵襲血管内処置である。しかし、血管形成術^1,5の後でも、一部の患者は必然的に大きな四肢切断を必要^とする。血管形成術後の不利な結果の早期同定は、治療執行の可能性のために非常に貴重である。

Protocol

セントロ・メディコ・ナシオナル「20デ・ノビエンブレ」ISSSTEの機関研究倫理委員会は、この将来のプロトコルを承認し、登録されたすべての患者が書面によるインフォームド・コンセントを提供しました。

1. 下肢の血管ブロック、血液採取、バルーン血管形成術の評価

注:この実験に使用された研究サンプルは、68歳と20人中10人の20人の糖尿病患者で構成されていました。サンプルの半分は喫煙者であり、最も一般的な共罹患率は2型糖尿病、全身動脈性高血圧および/または脂質異常症であった。サンプルは、年齢、性別、共罹患率のために標準化されることを意図していました。MPCとCLIの関係に対する臨床的・人口統計学的影響によるバイアスの可能性は排除できなかった。

1. ラザフォード分類¹³ に従って四肢虚血の臨床的重症度を評価する( 補足表1参照)。
2. 下肢血管造影、血液採取、バルーン血管形成術を行う。
   1. 手術前に抗凝固薬と麻酔薬を使用してください。
   2. 選択した鼠径部の血管に18Gの針を入れます。
   3. 紹介者を配置し、フレキシブルガイドワイヤーを進めます。次に、初期ガイドは、さらに6Fr導入者に対して変更される。
   4. 透視的なガイドの下でのコントラスト媒体または....

Results

閉塞した動脈からの血液サンプルは、血管形成術に対処した部位で、68歳と20人中10人の糖尿病患者から採取された。サンプル人口の半数は喫煙者であった。血管病変は主にラザフォード級VIとして採点された。一方、患者は2型糖尿病(100%)の有病率が高く、高血圧(70%)が高いと脂質異常症 (55%)

下肢血管形成術が行われた後の30日間の臨床フォローアップ。血管形成術後のベースラインまたはダイナミクスにおけるMPC亜集団の割合は、FMDによって評価された内皮機能不全の程度と相関(スピアマン分析)した。そして、血管形成術後に四肢切断を受けている患者間で比較されたMpcのベースライン数(U-Mann Whitney)。この研究は、ベースラインMPCサブ人口^CD45+CD34+^KDR+がFMD(図3A、左)と負相関しているのに対し、MPCCDCD45+CD34+CD133+CD133+CD184+血管形成術後の変化はFMD改善と有意に相関することを示した(

Discussion

血管ブロックの正確な部位での採血は技術的な困難を示す可能性があります。したがって、血管ブロックに近接して採血を行った。同様に、血管プラークに近いPPCの量は非常に動的であり、血管形成術の前後にバリエーションを生じる可能性があります。我々の観察によると、血管損傷および修復内で起こるいくつかの病因生理学的プロセスを反映する可能性があるため、MPCの数のベースラインおよび30分後血管形成術の変化を評価することが推奨される。

Mpcs判定のための血液サンプル処理は、最初の3時間以内に行うことを推奨します。したがって、適切な組織計画、さらには以前のシミュレーションの実践は、血管管外科チームと研究室の研究者との間で確立される可能性があります。MPCの分離は慎重に行われるべきであり、特に血液サンプルを密度勾配およびMPCを含むペレットの投下に分解する。我々のグループは細胞を細胞測定管に移し、一次抗体を加え、固定し、細胞を4°Cで一晩保存するために使用する。時間管理の便宜性のために、フローサイトメトリーの読み取りは翌日に行われる。

血管損傷お.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	ロシュ	10735086001	ウシ血清アルブミン(BSA)を緩衝剤、安定剤、標準剤、およびブレンド用
キャリブレーションビーズ	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuantキャリブレーションビーズは、0.05%アジ化ナトリウムを含む水溶液で供給されます。最大100回の検査で3.5 ml
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	PBS/EDTAバッファーCD184
(CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	でR-フィコエリトリンに結合した抗体モノクローナル、アイソタイプ組換えヒトIgG1、結合
型CD309(VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	PBS/EDTA緩衝液中のR-フィコエリトリンに結合した抗体
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	モノクローナル抗体クローンAC136は、CD34のクラスIIIエピトープを検出 CD45
- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	モノクローナルCD45抗体、ヒト標識
コニカルチューブ	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15mlコニカル遠心チューブ
サイトメトリーチューブ	FALCON Corning Brand	#352052	5mLポリスチレン丸底チューブ 12x75スタイル。不妊。
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	金属、(Pbとして) <10ppm、鉄<0.01%、AS<1ppm、不溶性物質<0.005%
改善されたノイバウアー	ブランドなし	番号なし	細胞計用血球計算盤。(範囲0.1000mm、0.0025mm2)
K2 EDTA採血管	バキュテナー	#367863	ライラックプラスチックバキュテナーチューブ(K2E)10.8mg、6mL。
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	滅菌済みで、エンドトキシンの存在を確認しました。密度:1.077±0.001g/mL
パラホルムアルデヒド	SIGMA-ALDRICH		生体試料の固定、(粉末、95%)
ピペットトランスファー 1,3mL	CRM グローブ	PF1016, PF1015	トランスファーピペットは、より精度の高い液体移送を容易にするツールです。
試験管	KIMBLE CHASE	45060 13100	耐熱試験管。サイズ/キャップ 13 x 100 mm