DNA中の希少点変異の肉眼検出

サマリー

このプロトコルは、金ナノ粒子と常磁性微粒子を利用することにより、野生型DNA分子の200倍過剰の点変異DNAの肉眼同定を可能にします。

要約

このプロトコルは、野生型DNAの過剰における体細胞点突然変異を検出するための肉眼比色試験を説明しています。この方法の将来予測される応用は、リキッドバイオプシーからの循環無細胞DNAのまれな突然変異の同定であり、がん診断や個別化治療のための腫瘍患者の層別化に関連しています。概念実証として、この検査はBRAF遺伝子のBRAF^V600E 変異を検出するように設計されており、これはBRAF阻害剤による標的療法の恩恵を受けることができる黒色腫患者のサブグループを特定するために重要です。しかし、この比色試験は、ユニバーサル検出プローブの使用により、臨床的に関連性のある他の体細胞変異に容易に一般化することができ、したがって、腫瘍学的診断において強力な可能性を提供する。

この検査では、BRAF^V600E の0.5%が過剰なBRAF^WT DNAを検出し、これは一部の市販の機器アッセイの感度と一致します。このような感度は、診断目的に臨床的に関連し、薬剤感受性の患者を早期に特定することができます。リアルタイムPCRに基づく市販のアッセイとは対照的に、この検査は、標準的なPCR(または等温技術)で増幅されたDNAに対して実行でき、わずか1時間で数ステップのワンチューブ反応で肉眼で読み出すことができるため、最小限の機器と処理で済みます。現在、この検査は合成DNAサンプルにのみ使用されています。しかし、後者は、循環する無細胞DNAから増幅された実際のサンプルを模倣するように設計されており、検査を臨床診断に変換するのに有利に働きます。

概要

この方法の目的は、最小限の計装方法と肉眼での読み取りにより、DNAサンプル中の過小評価されている点変異を検出することです。最終的な目標は^、がんの早期診断とモニタリングのための循環無細胞DNA(ccf-DNA)(血液生検サンプルなど)の体細胞変異の検出のための迅速検査における将来のアプリケーションに適した原理実証アッセイを持つことです1。がん関連の体細胞変異は、重要ながんバイオ^{マーカー2}であり、ccf-DNAのマイナーな(しかし非常に変動しやすい)³分画に存在するため、その同定は困難である⁴。モデル標的として、BRAFキナーゼの構成的活性化を引き起こす発がん性変異BRAF^V600Eを選択した。この変異は、すべてのBRAF変異がんの80%に存在し^{5、一般に}循環腫瘍DNAの<1%にしか存在しません⁶。この変異を持つ患者を特定することは、BRAF阻害剤に対する治療反応を予測するため、重要です。したがって、BRAF変異状態を評価するためのいくつかの方法7,8,9,10が開発されており、感度は0.01%から2%の範囲である。

この方法が最先端の方法と比較した場合の主な利点は、リアルタイムPCRによる蛍光分子の機器検出とは対照的に、その検出が機器不要(肉眼)であることです。別の利点は、200を超える野生型DNA分子のうち、1つの変異したDNA分子を識別できる効率です。この0.5%の識別係数は、機器による検出に基づいて、一部の実験室ベースまたは市販のキットよりも優れている¹¹ または¹² と一致しており、したがって、臨床診断アプリケーションに関連しています。一方、実験室でのプロトタイプテストとして、この方法は温度に敏感なステップの手動制御に依存しています。ただし、アッセイのステップ数と合計時間は限られているため、将来的には自動化されたマイクロ流体システムへの実装が考えられます。

この概念実証法は、合成DNA分子を用いて開発されました。クリニックへの効率的な翻訳のためには、患者の血液生検から増幅された実際のサンプルを使用して検証する必要があります。この方法の将来の応用分野は、体液などの未処理の複雑な生物学的マトリックスの直接分析を意図したものではないことに注意してください。後者から、DNAを標準的な方法で抽出し、増幅して精製する必要があります。したがって、分析の出発物質は常に精製および増幅されたDNAであり、干渉物質の可能性という点では、この方法の開発に使用されたような合成DNAサンプルと合理的に同等です。

プロトコル

1. 金ナノ粒子プローブの合成

1. 40 nmのクエン酸キャップ金ナノ粒子を、以下に詳述するように2段階の標準播種成長法を使用して合成します。
   1. 15 nmクエン酸キャップ金ナノ粒子(AuNPsシード)を、古典的なTurkevich–Frens法^13,14を用いて合成する。
      1. すべてのガラス器具を王水(HCl:HNO₃ 、3:1 v / v比)で洗います。
      2. 0.25 mM HAuCl₄ 250 mL を加熱し、均一に撹拌しながら沸騰させます。
         注意:HAuCl₄ は腐食性で有毒です。
      3. 直ちに38.8 mM Na₃・クエン酸塩25 mLを添加します。
      4. 30分間沸騰させて攪拌し続け、溶液が赤いルビー色に変わります。
      5. 溶液を火から下ろし、攪拌しながら室温まで冷まします。
      6. 0.22 μm PTFEメンブレンシリンジフィルターを使用したフィルター。
      7. ガラス瓶に4°Cで保存します。
         注: ここで実験を一時停止できます。
   2. 播種成長¹⁵により、40 nmクエン酸キャップ金ナノ粒子(40 nm AuNP)を合成する。
      1. 調製溶液A:新たに調製した0.1 Mヒドロキシルアミン硫酸塩390 μLと、総量120 mLのAuNPシード13 mL、H₂O溶液溶液。
         注:目的のサイズを取得するために必要なAuNPsシードの量は異なる場合があります。新しいAuNPのシードストックごとに滴定する必要があります。
         注意: ヒドロキシルアミン硫酸塩は腐食性、毒性、変異原性があり、環境に有害です。取り扱いについて:取り扱い後は十分に洗ってください。汚染された衣類を取り除き、洗ってから再利用してください。十分な換気をして使用してください。粉塵の発生と蓄積を最小限に抑えます。目、皮膚、衣服との接触を避けてください。容器をしっかりと閉めてください。ほこりを吸い込まないようにしてください。金属製のヘラやその他の金属製のものと一緒に使用しないでください。保管用:密閉容器に保管してください。互換性のない物質から離れた、涼しく乾燥した換気の良い場所に保管してください。金属に近づけないでください。
      2. 調製液B:12.25 mLのH₂O + 0.25 mLの0.1 M HAuCl₄。
      3. 溶液Bをシリンジにセットし、シリンジをシリンジポンプにロードします。
      4. シリンジポンプのパラメータを設定します:シリンジの直径(mm単位)。流速:90 mL/h;総容量:10.80 mL(そのうち0.8 mLは、システム平衡化、すなわちチューブ充填に必要な過剰量です)。
      5. シリンジポンプを始動します。最初の0.8 mLの溶液Bをチューブに充填し、廃液容器にドロップアウトした後、溶液Aを含む反応フラスコの上にチューブを置き(中程度で均一な攪拌下で保持)、溶液Bを滴下します。
      6. 調製したばかりの0.1M Na₃・クエン酸塩2.65mLを加えてキャップをし、5分間撹拌する。
      7. 得られた40 nm AuNPを2,460 x g で10°C、18分間遠心分離して濃縮します。
      8. 穏やかに吸引して上清を取り除きます。.残量に穏やかに再懸濁します。
      9. 4°Cで保存してください。
         注: ここで実験を一時停止できます。
2. 40 nmクエン酸キャップ金ナノ粒子を標準的なチオールケミストリーにより官能基化します¹⁶。
   1. チオール化プローブオリゴヌクレオチド(5′ T(30)–(O–CH₂–CH₂)₃–SH 3′)と10 mM Tris(2-carboxyethil)ホスフィン(TCEP)を室温で3時間、穏やかな振とう(400 rpm)下でインキュベートすることにより、ジスルフィド結合を消化します。
   2. 消化されたオリゴヌクレオチドを大量に過剰に10 nM AuNPsと共に一晩インキュベートし、室温で穏やかに振とう(400 rpm)します。
   3. 10 mM リン酸緩衝液、pH 7.4、0.01% SDS 中で AuNPs-DNA 混合物を 0.3 M NaCl にするには、塩を 10 時間の時間間隔で段階的に添加し、穏やかな振とう (400 rpm) 下で行います。
   4. 室温で一晩、軽度の振とう(400rpm)でインキュベートします。
   5. DNA標識AuNPを0.25 M NaCl含有0.25 M NaClと10 mMリン酸緩衝液と0.01%SDSで3回洗浄し、過剰な未結合オリゴヌクレオチドを除去します。
   6. 得られたユニバーサルプローブ-AuNPは、使用するまで4°Cで保存してください。
      注: ここで実験を一時停止できます。
   7. 市販の蛍光ベースのアッセイを使用して、AuNP上のDNAプローブの密度を決定します
   8. 紫外可視分光法によりAuNPsの濃度を測定します。吸光度データからAuNPs濃度を導き出すために、ランバート&ビールの法則(A=εbc)および40 nm^AuNPs16 の公表された吸光係数を使用することができます。
   9. 動的光散乱(DLS)および透過型電子顕微鏡(TEM)によるAuNPsプローブの特性評価。
      注: ここで実験を一時停止できます。

2. BRAF^V600E 希少変異の比色識別

1. 分析用のターゲットサンプルを調製します:合成BRAF^V600E DNAとBRAF^WT DNAの異なる比率(BRAF^V600E:BRAF^WT 1:10、1:100、1:200、BRAF^V600E 100%、BRAF^wt 100%)の混合物。
2. 常磁性微粒子をハイブリダイゼーションバッファー(HB)(1x PBS pH 7.4、5% w/v PEG 600)で2回洗浄して平衡化し、開始容量に等しいHB容量に再懸濁します。洗浄は、1.5mLのチューブ(最大50μL/チューブ)に常磁性微粒子のアリコートを入れ、HBを500μL加え、穏やかにピペッティングして3回混合し、磁石を当てて透明な上清を分離し、直ちにHB500μLを加えて、2回目の洗浄ステップの手順を繰り返します。上清を取り除いた後、製造元のアドバイスに従って、ビーズの乾燥を避けるためにすぐにHBを追加します。
3. 試験するサンプルごとに、HBに洗浄した常磁性微粒子2.5μLを含むチューブを準備します。
4. 常磁性微粒子2.5 μLを、BRAF^V600E 変異を有するビオチン化第一弁別プローブ(DP1)の10 μM溶液10 μLと室温で5分間インキュベートすることにより、常磁性微粒子を官能基化します。
5. 干渉する未結合プローブから微粒子を磁気的に分離し、12.5 μLのHBに再懸濁します。この目的のために、チューブの側面に磁石を当て、溶液が透明になるまで待ちます。慎重にピペッティングして溶液を取り出し、すぐにHBを加え、ビーズが均一に再懸濁されるまで静かにピペットで移します。
6. ステップ2.1で説明したDNAターゲットサンプルの10μM混合物を懸濁液に10μL加えます。
7. 室温で30分間インキュベートします。
8. インキュベーション中は、常磁性微粒子の沈降を避けるために、3分ごとにサンプルを振ってください。
9. 懸濁液に、ターゲットに相補的な部分とポリAテールを持つように設計された第2の識別プローブ(DP2)の2μM溶液10μLを加えます。
10. 室温で15分間インキュベートします。
11. インキュベーション中は、常磁性微粒子の沈降を避けるために、3分ごとにサンプルを振ってください。
12. インキュベーション後に余分なDP2を磁気的に分離します。
13. 検出プローブと結合した300 fmolのAuNPを直ちに添加し、室温で5分間インキュベートします。
14. 過剰なAuNPを含む上清を磁気的に分離し、室温でHB100μLを添加して第^1の洗浄 ステップを実行します。
15. 上清を磁気的に分離し、HB100μLを添加して2^回目の 洗浄ステップを実行します。
16. 52°Cで5分間インキュベートします。
17. 上清を52°Cで磁気的に分離します。
18. 直ちに12.5 μLのHBに再懸濁して、比色結果を読み出します。
19. 結果を撮影し、サンプルを4°Cで保存します。

結果

この方法は、過剰なBRAF^wt合成DNAにおけるBRAF^V600E変異の検出に使用されました。図 1 は、検出戦略の詳細を示しています。アッセイは、比色YES/NO結果^17,18を与え、赤は陽性結果(YES)に対応し、黄色は陰性結果(NO)に対応します。

簡単に説明すると、ストレプトアビジン常磁性微粒子を、BRAF^V600E 変異を有するビオチン化識別プローブ(DP1)でコーティングしました。分析対象のターゲットサンプル(BRAF^wt とBRAF^V600E DNAの混合物)を微粒子に添加しました。短時間のインキュベーション後、2本目の検出プローブ(DP2)をチューブに添加し、続いて比色AuNPプローブを添加しました。サンプル中のBRAF^V600E DNAはDP1に結合し、次にD...

ディスカッション

この分析法の中核的な側面は、1つのヌクレオチドについて標的DNAと非標的DNAが異なるだけの場合、過剰な干渉する非標的DNAの状況で標的DNAを識別する能力です。したがって、プローブの設計とハイブリダイゼーション条件は、感度の高い識別を達成するために重要です。このアッセイは、関心のある任意の点突然変異の検出に適応するために、ユニバーサル比色プローブを使用するように設計されています。ただし、新しいプローブペアが新しい突然変異に対して設計されるたびに、反応条件のいくつかの小さな最適化を実行する必要がある可能性があります。

この分析法で唯一重要なステップはステップ 2.17 で、52 °C で磁気分離を行う必要があります。 このステップでは、前の洗浄ステップの温度を維持する必要があります。これは、アッセイが非常に少量で行われるため、温度制御なしで磁気分離を行うと、温度が非常に急速に低下し、非標的分子がビーズに非特異的に結合するためです。これが起こらないようにするには、ネガティブコントロールの色を確認します(アッセイの最後...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ベンチトップ遠心分離機 - アレグラ X 30	ベックマン・コールター	A99473
DL-ジチオスレイトール	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, ダルムシュタット, ドイツ	D0632-25G
Dynabeads M-280 ストレプトアビジン常磁性微粒子	Invitrogen	11205D
ヒドロキシルアミン硫酸塩	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, ダルムシュタット, ドイツ	379913-25G
KDS 100 レガシー シリンジ ポンプ	kdScientific	789100
NanoDrop OneC 分光光度計	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	806552-500ML
Pierce™TCEP-HCl、No-Weigh™フォーマット	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)	A35349
ポリエチレングリコール 600	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	202401
PTFE 0,22 µmフィルター、フルオロポア	ミリポア	FGLP04700
Quant-iT™オリグリーン&トレード;ssDNA Assay Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)	O11492
Sodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	W302600
Synthetic Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Tetrachloroauric(III) acid	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	520918
チオール化ポリT DNAプローブ	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
透過型電子顕微鏡 (TEM)	JEOL JEM 1011 顕微鏡
Zetasizer Nano S - ダイナミック光散乱システム	Malvern Panalytical