DNA中の希少点変異の肉眼検出

サマリー

このプロトコルは、金ナノ粒子と常磁性微粒子を利用することにより、野生型DNA分子の200倍過剰の点変異DNAの肉眼同定を可能にします。

要約

このプロトコルは、野生型DNAの過剰における体細胞点突然変異を検出するための肉眼比色試験を説明しています。この方法の将来予測される応用は、リキッドバイオプシーからの循環無細胞DNAのまれな突然変異の同定であり、がん診断や個別化治療のための腫瘍患者の層別化に関連しています。概念実証として、この検査はBRAF遺伝子のBRAF^V600E 変異を検出するように設計されており、これはBRAF阻害剤による標的療法の恩恵を受けることができる黒色腫患者のサブグループを特定するために重要です。しかし、この比色試験は、ユニバーサル検出プローブの使用により、臨床的に関連性のある他の体細胞変異に容易に一般化することができ、したがって、腫瘍学的診断において強力な可能性を提供する。

この検査では、BRAF^V600E の0.5%が過剰なBRAF^WT DNAを検出し、これは一部の市販の機器アッセイの感度と一致します。このような感度は、診断目的に臨床的に関連し、薬剤感受性の患者を早期に特定することができます。リアルタイムPCRに基づく市販のアッセイとは対照的に、この検査は、標準的なPCR(または等温技術)で増幅されたDNAに対して実行でき、わずか1時間で数ステップのワンチューブ反応で肉眼で読み出すことができるため、最小限の機器と処理で済みます。現在、この検査は合成DNAサンプルにのみ使用されています。しかし、後者は、循環する無細胞DNAから増幅された実際のサンプルを模倣するように設計されており、検査を臨床診断に変換するのに有利に働きます。

概要

この方法の目的は、最小限の計装方法と肉眼での読み取りにより、DNAサンプル中の過小評価されている点変異を検出することです。最終的な目標は^、がんの早期診断とモニタリングのための循環無細胞DNA(ccf-DNA)(血液生検サンプルなど)の体細胞変異の検出のための迅速検査における将来のアプリケーションに適した原理実証アッセイを持つことです1。がん関連の体細胞変異は、重要ながんバイオ^{マーカー2}であり、ccf-DNAのマイナーな(しかし非常に変動しやすい)³分画に存在するため、その同定は困難である⁴。モデル標的として、BRAFキナーゼの構成的活性化を引き起こす発がん性変異BRAF^V600Eを選択した。この変異は、すべてのBRAF変異がんの80%に存在し^{5、一般に}循環腫瘍DNAの<1%にしか存在しません⁶。この変異を持つ患者を特定することは、BRAF阻害剤に対する治療反応を予測するため、重要です。したがって、BRAF変異状態を評価するためのいくつかの方法7,8,9,10が開発されており、感度は0.01%....

プロトコル

1. 金ナノ粒子プローブの合成

1. 40 nmのクエン酸キャップ金ナノ粒子を、以下に詳述するように2段階の標準播種成長法を使用して合成します。
   1. 15 nmクエン酸キャップ金ナノ粒子(AuNPsシード)を、古典的なTurkevich–Frens法^13,14を用いて合成する。
      1. すべてのガラス器具を王水(HCl:HNO₃ 、3:1 v / v比)で洗います。
      2. 0.25 mM HAuCl₄ 250 mL を加熱し、均一に撹拌しながら沸騰させます。
         注意:HAuCl₄ は腐食性で有毒です。
      3. 直ちに38.8 mM Na₃・クエン酸塩25 mLを添加します。
      4. 30分間沸騰させて攪拌し続け、溶液が赤いルビー色に変わります。
      5. 溶液を火から下ろし、攪拌しながら室温まで冷まします。
      6. 0.22 μm PTFEメンブレンシリンジフィルターを使用したフィルター。
      7. ガラス瓶に4°Cで保存します。
         注: ここで実験を一時停止できます。
   ....

結果

この方法は、過剰なBRAF^wt合成DNAにおけるBRAF^V600E変異の検出に使用されました。図 1 は、検出戦略の詳細を示しています。アッセイは、比色YES/NO結果^17,18を与え、赤は陽性結果(YES)に対応し、黄色は陰性結果(NO)に対応します。

簡単に説明すると、ストレプトアビジン常磁性微粒子を、BRAF^V600E 変異を有するビオチン化識別プローブ(DP1)でコーティングしました。分析対象のターゲットサンプル(BRAF^wt とBRAF^V600E DNAの混合物)を微粒子に添加しました。短時間のインキュベーション後、2本目の検出プローブ(DP2)をチューブに添加し、続いて比色AuNPプローブを添加しました。サンプル中のBRAF^V600E DNAはDP1に結合し、次にD.......

ディスカッション

この分析法の中核的な側面は、1つのヌクレオチドについて標的DNAと非標的DNAが異なるだけの場合、過剰な干渉する非標的DNAの状況で標的DNAを識別する能力です。したがって、プローブの設計とハイブリダイゼーション条件は、感度の高い識別を達成するために重要です。このアッセイは、関心のある任意の点突然変異の検出に適応するために、ユニバーサル比色プローブを使用するように設計されています。ただし、新しいプローブペアが新しい突然変異に対して設計されるたびに、反応条件のいくつかの小さな最適化を実行する必要がある可能性があります。

この分析法で唯一重要なステップはステップ 2.17 で、52 °C で磁気分離を行う必要があります。 このステップでは、前の洗浄ステップの温度を維持する必要があります。これは、アッセイが非常に少量で行われるため、温度制御なしで磁気分離を行うと、温度が非常に急速に低下し、非標的分子がビーズに非特異的に結合するためです。これが起こらないようにするには、ネガティブコントロールの色を確認します(アッセイの最後.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ベンチトップ遠心分離機 - アレグラ X 30	ベックマン・コールター	A99473
DL-ジチオスレイトール	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, ダルムシュタット, ドイツ	D0632-25G
Dynabeads M-280 ストレプトアビジン常磁性微粒子	Invitrogen	11205D
ヒドロキシルアミン硫酸塩	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, ダルムシュタット, ドイツ	379913-25G
KDS 100 レガシー シリンジ ポンプ	kdScientific	789100
NanoDrop OneC 分光光度計	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	806552-500ML
Pierce™TCEP-HCl、No-Weigh™フォーマット	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)	A35349
ポリエチレングリコール 600	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	202401
PTFE 0,22 µmフィルター、フルオロポア	ミリポア	FGLP04700
Quant-iT™オリグリーン&トレード;ssDNA Assay Kit	Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA)	O11492
Sodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	W302600
Synthetic Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
Tetrachloroauric(III) acid	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, Darmstadt, Germany	520918
チオール化ポリT DNAプローブ	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
透過型電子顕微鏡 (TEM)	JEOL JEM 1011 顕微鏡
Zetasizer Nano S - ダイナミック光散乱システム	Malvern Panalytical