本稿は、商業的支援上の実験室製のメディアを用いた未熟な猫卵母細胞の最小体積ガラス化のためのプロトコルを記述する。それは、エキビボ生殖腺からガラス化および温暖化に至る卵母細胞の分離からあらゆるステップをカバーする。
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この記事について
サマリー
要約
野生動物の保護プログラムでは、有価者や希少種の遺伝資源を保護し、生物多様性保全を促進するために、テガレバンキングが重要です。フェリドでは、ほとんどの種が絶滅の危機に瀕しており、国内の品種は、ゲルプラズムバンキングのためのプロトコルの効率を高めるためのモデルとして使用されています。卵母細胞凍結保存技術の中で、ガラス化はヒトおよび獣医支援生殖においてますます普及している。ヒト卵母細胞および胚のために最初に開発されたクライオトップガラス化は、猫の卵母細胞に適することが実証された。この方法には、フィールド条件の実現可能性や手順の速度など、いくつかの利点があり、いくつかのサンプルを処理する必要がある場合に役立ちます。しかし、効率はオペレータのスキルに大きく依存し、ラボ内およびラボ間の標準化、および人員訓練が必要です。このプロトコルは、卵母細胞の収集から温暖化まで、ステップバイステップのフィールドフレンドリーなプロトコルで商業的サポート上の未熟なネコ卵母細胞の最小体積ガラス化を記述する。プロトコルに従って、温暖化時の卵母細胞の完全性と生存率の維持(90%まで高い)温暖化後の成熟と胚発生の結果にはまだ改善の余地があるが、期待できる。
概要
凍結保存は、再生支援技術(ART)の重要なステップとなっています。人間では、医療や個人的な理由で生殖能力の保持や親の延期を可能にします。動物では、特に家畜やペットの計画交配の距離と時間を克服したり、特に野生の絶滅危惧種の保全プログラムで貴重な被験者の遺伝物質を保存する必要があります。配育する個体がまだ選ばれていない場合、または特にヒト医学における胚凍結に関連する倫理的問題を回避するために、配られる人が選ばれなかった場合の最良の選択である。精子は比較的簡単に保存し、解凍後に満足のいく結果を与えるが、卵母細胞は、その構造的特徴のために、保存するのがより複雑である可能性がある。実際、低い表面/体積比は、卵形プラズマを囲む透明帯の存在と同様に、細胞2を横切る凍結保護剤および水の移動を制限する。さらに、フェリドを含む家畜では、脂質が豊富な細胞質が特徴であり、凍結保存に対してより敏感であると考えられている。
ほとんどのフェリドは脅かされ、家畜猫は定期的な卵巣切除術から生殖腺が利用可能なおかげで生殖器保存のためのプロトコルを開発するためのモデルとして使用されます。野生動物では、生殖腺は、選択的手術後、または(より頻繁に) 死後に得ることができ、未熟な(胚芽小胞)配偶を取り出すことができます。成熟した(メタフェーズII)卵母細胞を得....
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プロトコル
ここに描かれた手順は、猫の卵巣が獣医院で、飼い主が要求した定期的な卵巣切除術または卵巣子宮摘出術による副産物として採取されたので、倫理的承認を受けなかった。
1. 卵母細胞コレクション
- 実験を開始する前に、卵巣および卵母細胞の収集のための溶液を準備する。抗生物質と抗ミキサイト剤(ペニシリンGナトリウム100 IU/mL、ストレプトマイシン硫酸塩0.1mg/mL、アンホテリシンBの0.25 μg/mL)を混合したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で卵巣採取溶液を調製する。卵母細胞回収液(すなわち、PBS/PVA)を100 IU/mLのペニシリンGナトリウム、0.1mg/mLのストレプトマイシン硫酸塩、0.1%(w/v)ポリビニルアルコール(PVA)でPBSで調製します。
- 卵巣および卵母細胞のコレクションのためのソリューションは使用まで4 °Cで保管してください。
- クイーンズの支払いの日には、サンプルを処理する数時間前に、卵巣および卵母細胞の収集ソリューションの一部を取り、室温(RT;25±2°C)でウォームアップさせます。
- サンプルが実験室に到着したら、周囲の結合組織と卵管から卵巣を分離し、ペトリ皿の新鮮な卵巣採取媒体で洗浄する。
- 各女王に対して35mmのペトリ皿1つを約3mLのRT PBS/PVAと、卵母細胞を収集するためにもう1つの皿を充填します。
- ペトリ皿に....
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結果
本プロトコル(図1および補足図1)に従ってネコの卵卵子ガラス化および温暖化に続き、大多数のシロネコが生存する。ガラス化後、他の技術の中でも、生存率は、形態学的完全性22として、またはバイタル染色を使用して光学顕微鏡で評価することができる。後者の1つは、生き生きとしている(明るい緑色蛍光)と死細胞(赤い蛍光)を同定できる蛍光ジ素・ヨウ化プロピジウム(FDA/PI)である。図2は、温暖化直後にFDA/PIで染色されたガラス化加温猫COCの代表的な画像を示しています。ガラス化後の生存率を示す実験からのデータは表1に報告されており、これは、体外成熟17またはインビトロ胚生産16を意図した卵母細胞の温暖化後のデータを描写している。全体として、ここで例として使用される2つの実験では、435個の卵母細胞のうち16、17、39.......
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ディスカッション
卵母細胞凍結保存は、特にフェリダエ家のような多くの種が絶滅の危機に瀕しているタキサにおいて、重要な胚芽保護技術である。本稿では、未熟な猫卵母細胞のガラス化のためのシンプルで現場に優しいプロトコルが提示された。実験室製のメディア、最小体積ガラス化サポートおよび訓練を受けた人員は、この方法の成功のための重要な要因であり、この方法の成功の鍵となる要因であり、この方法により、この方法によって報告された代表的な結果によって示されるように、生存可能な卵母細胞を一貫して繰り返し得ることができる。
メディアの準備から始まり、プロトコルは、最良の結果を確保するために正確に従う必要がありますが、オペレータのスキルが主要な問題です。培地は、ガラス化手順の同じ日に調製する必要があり、または、それが不可能な場合は、前日に調製し、4°Cで保存する必要があります。いずれにせよ、サンプル処理の前に、ソリューションがRTにウォームアップするのに十分な時間を残す必要があります。しかし、凍結保存は最もデリケートな手順です。温暖化手順はそれほど重要ではありませんが、プロトコルとタイミングに従えば、ガラス化がより複雑になる.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作品の一部は、EVSSAR(欧州小動物生殖協会)グラント2016とミラノ大学、ピアノ・ディ・ソステグノ・アラ・リセルカ2019(リネア2アツィオーネA)によって支えられていました。また、マリアジョルジア・モルセリ博士がここに描かれた実験に貢献し、画像取得に貢献してくれたことに感謝したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アムホテリシン B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| 自動ピペット&チップ | / | / | ペット20、100、240、300 µに必要;L |
| 外科用メス | / | / | サイズ10は通常大丈夫 |
| ブンゼンくちばし | / | / | / |
| クランプ/ | / | 卵巣隔離用の小さなもの(蚊クランプ)、液体窒素で働くための大きなもの(クレマークランプ) | |
| クライオトップ | 北里(ディストリビューター:MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | ディストリビューターとカタログ番号は国によって異なる場合があります |
| ジメチルスルホキシド(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| エチレングリコール(EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| ウシ胎児血清(FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| ガラスパスツールピペット | / | / | 推奨長さ230 mm(100 + 130) |
| ゴベレット | / | / | 貯蔵タンクのキャニスターによる |
| 加熱ステージ | / | / | すべての加熱ステージは、38ºを維持できる限り、大丈夫です。C |
| 液体窒素 | / | // | |
| ミディアム 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| ペニシリン G ナトリウム | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| ポリビニルアルコール (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (ディストリビューター: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | ディストリビューターとカタログ番号は国によって異なる場合があります |
| Stereomicroscope | / | / | オペレーターが卵子を選択できる限り、他の実体顕微鏡は大丈夫 |
| 貯蔵タンク | / | / | 定期的に充填されたタンクは大丈夫です |
| 硫酸ストレプトマイシン | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| 発泡スチロール/窒素耐性ボックス | / | / | 液体窒素を含むことができるすべてのボックスは、オペレーターが快適である限り、大丈夫です。北里箱は「クーリングラック」と呼ばれる |
| 糖 | シグマアルドリッチ | S1888 | / |
| タイマー | / | / | 9分までの時間に設定できるタイマーは全てOKです |
参考文献
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.
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再版と許可
