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方法論記事

未熟ネコの最小体積ガラス化

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DOI:

10.3791/61523

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2020年6月24日

 , 
1Dipartimento di Scienze Veterinarie per la Salute, la Produzione Animale e la Sicurezza Alimentare 'Carlo Cantoni', Università degli Studi di Milano

この記事について

サマリー

本稿は、商業的支援上の実験室製のメディアを用いた未熟な猫卵母細胞の最小体積ガラス化のためのプロトコルを記述する。それは、エキビボ生殖腺からガラス化および温暖化に至る卵母細胞の分離からあらゆるステップをカバーする。

要約

野生動物の保護プログラムでは、有価者や希少種の遺伝資源を保護し、生物多様性保全を促進するために、テガレバンキングが重要です。フェリドでは、ほとんどの種が絶滅の危機に瀕しており、国内の品種は、ゲルプラズムバンキングのためのプロトコルの効率を高めるためのモデルとして使用されています。卵母細胞凍結保存技術の中で、ガラス化はヒトおよび獣医支援生殖においてますます普及している。ヒト卵母細胞および胚のために最初に開発されたクライオトップガラス化は、猫の卵母細胞に適することが実証された。この方法には、フィールド条件の実現可能性や手順の速度など、いくつかの利点があり、いくつかのサンプルを処理する必要がある場合に役立ちます。しかし、効率はオペレータのスキルに大きく依存し、ラボ内およびラボ間の標準化、および人員訓練が必要です。このプロトコルは、卵母細胞の収集から温暖化まで、ステップバイステップのフィールドフレンドリーなプロトコルで商業的サポート上の未熟なネコ卵母細胞の最小体積ガラス化を記述する。プロトコルに従って、温暖化時の卵母細胞の完全性と生存率の維持(90%まで高い)温暖化後の成熟と胚発生の結果にはまだ改善の余地があるが、期待できる。

概要

凍結保存は、再生支援技術(ART)の重要なステップとなっています。人間では、医療や個人的な理由で生殖能力の保持や親の延期を可能にします。動物では、特に家畜やペットの計画交配の距離と時間を克服したり、特に野生の絶滅危惧種の保全プログラムで貴重な被験者の遺伝物質を保存する必要があります。配育する個体がまだ選ばれていない場合、または特にヒト医学における胚凍結に関連する倫理的問題を回避するために、配られる人が選ばれなかった場合の最良の選択である。精子は比較的簡単に保存し、解凍後に満足のいく結果を与えるが、卵母細胞は、その構造的特徴のために、保存するのがより複雑である可能性がある。実際、低い表面/体積比は、卵形プラズマを囲む透明帯の存在と同様に、細胞2を横切る凍結保護剤および水の移動を制限する。さらに、フェリドを含む家畜では、脂質が豊富な細胞質が特徴であり、凍結保存に対してより敏感であると考えられている。

ほとんどのフェリドは脅かされ、家畜猫は定期的な卵巣切除術から生殖腺が利用可能なおかげで生殖器保存のためのプロトコルを開発するためのモデルとして使用されます。野生動物では、生殖腺は、選択的手術後、または(より頻繁に) 死後に得ることができ、未熟な(胚芽小胞)配偶を取り出すことができます。成熟した(メタフェーズII)卵母細胞を得ることを目的としたホルモン刺激は、倫理的な問題と治療4に対する種および個々の特異的応答のためにヒトARTほど一般的ではない。

したがって、凍結保存戦略の開発は、通常、まれな個体の予期せぬまたは突然の死の後に取り出すことができる未熟なアテです。生物学的な観点から、未熟または成熟したアテの凍結保存にはいくつかの違いがあり、それぞれがその利点を有する。第一に、DNAは、胚芽小胞が核膜に囲まれた染色体を含む未熟な卵母細胞でより保護され、メタフェーズII卵母細胞のmeioticスピンドルは凍結傷害に対してより脆弱である可能性がある5。第二に、冷間誘発細胞骨格の損傷は、紡錘の回転、極体押出、前核移動およびサイトカネシスに影響を及ぼし、卵母細胞発生期に応じて異なる影響を及ぼし、微粉症の進行または受精後の事象に影響を及ぼす可能性がある。最後に、おそらく最も重要なのは、成熟した卵母細胞が受精する準備ができているのに対し、未熟なジマテは核および細胞質成熟6を通過するために周囲の積雲細胞の支持に依存しており、これが積雲母細胞複合体(COC)全体が凍結保存されている理由である。しかし、乳液細胞の喪失や、カテと周囲の体細胞との間の機能的なつながりの喪失は、おそらく未熟なCOCcの凍結保存の最も有害な影響である。

凍結保存技術の中でも、ガラス化は、フィールド条件でより容易に適用できるものです。低速(または制御速度)の凍結と比較して、ガラス化はより速く、プログラム可能な冷凍庫のような特定の装置を必要としない。ガラス化の三つの基本原則(すなわち、高粘度、高い凍結保護濃度、少量および超急速温度減少に結び付く)を満たすために、いくつかの媒体および支持剤は、特に未熟および成熟卵子の両方のために猫で開発され、使用されてきた。単純なストロー7から始まり、デバイスは「最小音量」目標に到達するために開発されました。クライオループ8、オープンプルストロー(OPS)9、プラスチック側溝(変性ストロー)10及びクライオチューブ11が用いられ、より効率的な装置(すなわち、クライオトップ)が採用されるまで、生存率及び明治を改善する。9クライオトップ(補足図1)は、ガラス化用の選択開放システムとなっている市販のサポートです。ヒト卵母細胞および胚のガラス化のために開発され、それは、貯蔵12の間にプラスチック管キャップによって保護された硬いプラスチックホルダーに取り付けられた小さなフィルムストリップからなる。ガラス化容積の極度の減少(わずか0.1μL)により、このガラス化サポートは、家庭用ネコを含む数種にますます適用され、様々なメディア13、14、15、16、17と共に使用されています。13,14,15,16,17

この原稿の目的は、実験室製のメディアと商業支援を用いて最小の体積ガラス化のために使用し、未熟なネコCOCの凍結保存のためのフィールド条件で容易に適用することができるヒト卵母細胞のために最初に開発されたものからのマイナーな変更を伴う、コレクションガラス化温暖化プロトコルを記述することです。

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プロトコル

ここに描かれた手順は、猫の卵巣が獣医院で、飼い主が要求した定期的な卵巣切除術または卵巣子宮摘出術による副産物として採取されたので、倫理的承認を受けなかった。

1. 卵母細胞コレクション

  1. 実験を開始する前に、卵巣および卵母細胞の収集のための溶液を準備する。抗生物質と抗ミキサイト剤(ペニシリンGナトリウム100 IU/mL、ストレプトマイシン硫酸塩0.1mg/mL、アンホテリシンBの0.25 μg/mL)を混合したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で卵巣採取溶液を調製する。卵母細胞回収液(すなわち、PBS/PVA)を100 IU/mLのペニシリンGナトリウム、0.1mg/mLのストレプトマイシン硫酸塩、0.1%(w/v)ポリビニルアルコール(PVA)でPBSで調製します。
  2. 卵巣および卵母細胞のコレクションのためのソリューションは使用まで4 °Cで保管してください。
  3. クイーンズの支払いの日には、サンプルを処理する数時間前に、卵巣および卵母細胞の収集ソリューションの一部を取り、室温(RT;25±2°C)でウォームアップさせます。
  4. サンプルが実験室に到着したら、周囲の結合組織と卵管から卵巣を分離し、ペトリ皿の新鮮な卵巣採取媒体で洗浄する。
  5. 各女王に対して35mmのペトリ皿1つを約3mLのRT PBS/PVAと、卵母細胞を収集するためにもう1つの皿を充填します。
  6. ペトリ皿に卵巣のペアを置き、外科的メスで皮質をミンチ。すべての卵胞が実体顕微鏡(拡大8x)の助けを借りて壊れていることを確認してください。
  7. ピペットでCOCを収集し、割り当てられたペトリ皿の新鮮なPBS / PVAでそれらを移動します。均質で暗い細胞質を持ち、積雲細胞のいくつかのコンパクトな層(グレードI18)に囲まれた良質のCOCを選択してください。

2. ガラス化

  1. 平衡化およびガラス化媒体を準備する。
    1. 7.5%(v/v)エチレングリコール(EG)と7.5%(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO)を培地199で平衡化溶液(ES)、20%ウシ血清(FBS)で調製します。
    2. 15%(v/v)EG、15%(v/v)DMSO、0.5 Mスクロースを含むガラス化溶液(VS)を中199で調製し、20%FBS(19から変更) 19
    3. 使用前に、ES と VS を RT でウォームアップします。
      注: 凍結保護剤(例えば、EG、DMSO)は細胞毒性であることが知られている。彼らの毒性に対抗する戦略は、細胞がそれらにさらされる温度を20に下げることであり、卵母細胞は通常RTで凍結保護剤にさらされる。したがって、全体の手順は、卵母細胞の収集からガラス化まで、温度変動を避けるためにこのプロトコルのRTで行われる。
  2. ガラス化皿(すなわち、「Reproプレート」として知られている2列に分割された6つの円錐形の井戸からなる特別な皿)を準備します。各ガラス化サポートに対して1行(3ウェル)を用意します。
    1. 最初の井戸の底に20 μLのESを加えます。
    2. 2 番目の底(すなわち、1VS)と 3 番目(つまり、2VS)ウェルに 300 μL の VS を追加します。
  3. ES で COC を平衡化します。
    1. 小さなボアピペット(例えば、パスツールピペットは、それを薄くするためにブンゼンのくちばしに引っ張られた - 直径は少なくとも200 μmでなければなりません)、最初の井戸の底に1つ(またはそれ以上)COCを移します。
      注:卵母細胞を囲む積雲細胞の層数に応じてピペットのサイズを選択し、COCs寸法に、各ステップでCOCsで転送されるメディアの量を可能な限り減らすことを目指します。このプロトコルを使用すると、トレーニングを受けたオペレータは、各ガラス化サポートごとに最大8個のネコCOCを正常に実行できます。
    2. ゆっくりとドロップの境界にESの20 μLを追加します。3 分間待ちます。
    3. ゆっくりとドロップの境界にESの他の20 μLを追加します。3 分間待ちます。
    4. ゆっくりとドロップの境界にESの240 μLを追加します。9 分間待ちます。
    5. 待っている間、液体窒素(LN2)で箱を準備し、実験/猫の識別コードでガラス化サポートにラベルを付け、開いたままにしておきます。両方を実体顕微鏡の近くに置き、作業中に簡単に到達できるようにします。
      注意！LN2を扱うときは、個人用保護具を着用してください。
    6. あるいは、複数のCOCをガラス化する必要がある場合は、別のCOCグループ(新しいガラス化サポートにロードされる)の最初の平衡ステップ(ステップ2.3.1~2.3.2を参照)を開始します。
  4. 90秒未満でVSでCOCをvitrify。
    1. 同じ小さなボアピペットを使用して、1VSでそれを充填し、最初のウェル(ES)の底からCOCを取り、それらを2番目のウェル(1VS)の表面に移動させます。
    2. 1VSでピペットを洗います。
    3. COCを取り、ウェルの別の領域(底部)に移動します。ピペットとそれらを囲む媒体を混ぜます。
    4. 井戸の別の領域に1VSでピペットを充填し、COCsを取り、それらを移動し、ピペットとそれらを取り巻く媒体を混合します。
    5. ステップ 2.4.4 を繰り返します。
    6. 2VSでピペットを洗います。
    7. COCを取り、3番目のウェル(2VS)の底にそれらを移動します。ピペットとそれらを囲む媒体を混ぜます。
    8. 井戸の別の領域に2VSでピペットを充填し、COCsを取り、それらを移動し、ピペットとそれらを取り巻く媒体を混合します。
    9. ステップ 2.4.8 を繰り返します。
    10. 配管をウェルの別の領域に2VSで充填し、COCを取り、ガラス化サポートのストリップにできるだけ近い先端にロードします。吸引過剰培地は、VSの量を可能な限り低減する。
    11. すぐにLN2でガラス化サポートを突き落とし、それを動かします。いくつかのクランプの助けを借りてそれを閉じて、それが常にLN2に浸されたままであることを確認します。
      注意:凍結保護剤細胞毒性のために、適切なタイミングを保つことが重要です。ガラス化媒体の濃度が高いため、細胞暴露を制御する必要があり、また、技術21の完璧な実行によっても制御する必要がある。サンプルが豊富な場合は、それらをより迅速に処理し、卵母細胞の収集からガラス化までの時間を最小限に抑えるためにそれらを分割することを検討してください。
  5. ロードされたガラス化サポートをゴブレットに保管し、加温するまでストレージLN2 タンクに保管します。
    注: LN2 が使用可能な場合、プロトコルの前の手順はすべてフィールド条件でも適用できます。乾燥した荷送人は実験室に安全にサンプルを運び、それから次の段階で進む必要がある。

3. 温暖化

  1. 温暖化メディアを準備します。
    1. 20%FBSで、ミディアム199で1 Mスクロースで解凍溶液(TS)を準備します。
    2. 培地199で0.5 Mスクロースを使用して希釈液(DS)を調製し、FBSを20%で提供します。
    3. 20%FBSでミディアム199で洗浄液(WS)を準備します。
    4. 使用前に、TSを38°Cに、DSとWSをRTで温めてください。
  2. 必要に応じて、温めたCOCのその後の使用(例えば、体外成熟、IVM)のために培地を調製する。
  3. 熱の段階を実体顕微鏡の近くに置き、それをオンにします(38°C)。ペトリ皿のふたを入れてウォームアップします。
  4. すべてが準備ができたら、貯蔵タンクからLN2の箱に温めなければならないガラス化サポートを移し、立体顕微鏡の近くに箱を置きます。
  5. 「リプロプレート」を準備します。温める必要がある各ガラス化サポートの行を準備します。
    1. 最初のウェルの底に300 μLのDSを加えます。
    2. 2 番目の底(すなわち、1WS)と 3 番目(つまり 2WS)ウェルに 300 μL の WS を追加します。
  6. ペトリ皿のふたにTS(100 μL)を一滴入れます。
  7. クランプを使用して、LN2で1つのガラス化サポートを開きます。
  8. TSドロップを実体顕微鏡の下に置き、1つの速い動きでLN2 からのガラス化支持を取り、すべてのCOCが取り外されるまでそれを動かして、滴に浸す。サポートが空になるとすぐにドロップから取り外しますが、TS の COC は合計で 1 分間(浸漬から次の手順まで)そのままにしておきます。
  9. ガラス化に使用されるピペットと同様のピペットを取り、DSで満たします。ドロップ(TS)からCOCを取り出し、最初のウェル(DS)の底に移動します。3 分間待ちます。
  10. ピペットを1WSで洗います。COCを取り、2番目のウェル(1WS)の底にそれらを移動します。5 分間待ちます。
  11. 2WSでピペットを洗います。COCを取り、3番目のウェル(2WS)の表面に移動します。彼らが井戸の底に触れるのを待ちます。
  12. ウェルの別の領域を使用して、ステップ 3.11 を繰り返します。
  13. ピペットを培養液で洗浄し、以下の用途のために卵母細胞を培養皿(例えば、IVM)に移動させる。

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結果

本プロトコル(図1および補足図1)に従ってネコの卵卵子ガラス化および温暖化に続き、大多数のシロネコが生存する。ガラス化後、他の技術の中でも、生存率は、形態学的完全性22として、またはバイタル染色を使用して光学顕微鏡で評価することができる。後者の1つは、生き生きとしている(明るい緑色蛍光)と死細胞(赤い蛍光)を同定できる蛍光ジ素・ヨウ化プロピジウム(FDA/PI)である。図2は、温暖化直後にFDA/PIで染色されたガラス化加温猫COCの代表的な画像を示しています。ガラス化後の生存率を示す実験からのデータは表1に報告されており、これは、体外成熟17またはインビトロ胚生産16を意図した卵母細胞の温暖化後のデータを描写している。全体として、ここで例として使用される2つの実験では、435個の卵母細胞のうち16、17、39...

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ディスカッション

卵母細胞凍結保存は、特にフェリダエ家のような多くの種が絶滅の危機に瀕しているタキサにおいて、重要な胚芽保護技術である。本稿では、未熟な猫卵母細胞のガラス化のためのシンプルで現場に優しいプロトコルが提示された。実験室製のメディア、最小体積ガラス化サポートおよび訓練を受けた人員は、この方法の成功のための重要な要因であり、この方法の成功の鍵となる要因であり、この方法により、この方法によって報告された代表的な結果によって示されるように、生存可能な卵母細胞を一貫して繰り返し得ることができる。

メディアの準備から始まり、プロトコルは、最良の結果を確保するために正確に従う必要がありますが、オペレータのスキルが主要な問題です。培地は、ガラス化手順の同じ日に調製する必要があり、または、それが不可能な場合は、前日に調製し、4°Cで保存する必要があります。いずれにせよ、サンプル処理の前に、ソリューションがRTにウォームアップするのに十分な時間を残す必要があります。しかし、凍結保存は最もデリケートな手順です。温暖化手順はそれほど重要ではありませんが、プロトコルとタイミングに従えば、ガラス化がより複雑になる...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作品の一部は、EVSSAR(欧州小動物生殖協会)グラント2016とミラノ大学、ピアノ・ディ・ソステグノ・アラ・リセルカ2019(リネア2アツィオーネA)によって支えられていました。また、マリアジョルジア・モルセリ博士がここに描かれた実験に貢献し、画像取得に貢献してくれたことに感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アムホテリシン BSigma-AldrichA2942/
自動ピペット&チップ//ペット20、100、240、300 µに必要;L
外科用メス//サイズ10は通常大丈夫
ブンゼンくちばし///
クランプ//卵巣隔離用の小さなもの(蚊クランプ)、液体窒素で働くための大きなもの(クレマークランプ)
クライオトップ北里(ディストリビューター:MBT - Medical Biological Technologies)01.CRディストリビューターとカタログ番号は国によって異なる場合があります
ジメチルスルホキシド(DMSO)Sigma-AldrichD2650/
エチレングリコール(EG)Sigma-AldrichE9129/
ウシ胎児血清(FBS)Sigma-AldrichF9665/
ガラスパスツールピペット//推奨長さ230 mm(100 + 130)
ゴベレット//貯蔵タンクのキャニスターによる
加熱ステージ//すべての加熱ステージは、38ºを維持できる限り、大丈夫です。C
液体窒素///
ミディアム 199Sigma-AldrichM4530/
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Sigma-AldrichD8662/
ペニシリン G ナトリウムSigma-AldrichP3032/
ポリビニルアルコール (PVA)Sigma-AldrichP8136/
Repro plateKitazato (ディストリビューター: MBT - Medical Biological Technologies)01.K-2ディストリビューターとカタログ番号は国によって異なる場合があります
Stereomicroscope//オペレーターが卵子を選択できる限り、他の実体顕微鏡は大丈夫
貯蔵タンク//定期的に充填されたタンクは大丈夫です
硫酸ストレプトマイシンSigma-AldrichS9137/
発泡スチロール/窒素耐性ボックス//液体窒素を含むことができるすべてのボックスは、オペレーターが快適である限り、大丈夫です。北里箱は「クーリングラック」と呼ばれる
糖シグマアルドリッチS1888/
タイマー//9分までの時間に設定できるタイマーは全てOKです
ピです です ショ

参考文献

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