方法論記事

コスト効率と適応性のあるスクラッチ移行アッセイ

DOI：

10.3791/61527

⸱

2020年6月30日

 , 
1Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi

この記事について

サマリー

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また、機器を多用する方法を用いずに細胞移動を決定する新しい手法を提供する、スクラッチ移行アッセイにコスト効率の高い方法を提示します。線維芽細胞はこのプロトコルで使用されたが、それは適応され、細胞の移動に影響を追加の細胞タイプおよび影響を研究するために利用することができる。

要約

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細胞の移動は、生理学的および病理学的事象の両方において重要な要素である。正常な細胞移動は、免疫応答の開発や取り付けなどの重要な機能に必要です。細胞の移動過程で欠損または変化が起こると、有害な結果(すなわち、癌転移、創傷治癒、瘢痕形成)を有する可能性がある。細胞移動の重要性のために、手頃な価格、適応性、反復可能な細胞移動アッセイへのアクセスが必要です。一般的なスクラッチ移行アッセイを利用して、一般的な実験室機器を用いた細胞移動解析の新しい手法を開発しました。説明された方法は、タイムラプス顕微鏡を使用せずに関心のある特定の領域を再キャプチャすることを可能にする視覚的なマーカーを使用しています。さらに、移行マトリックス基質の変更から薬理学的修飾剤の添加に至るまで、実験計画において柔軟性を提供します。さらに、このプロトコルは、細胞の移動を調べる際にいくつかの方法では考慮されない、細胞の移動の領域を説明する方法を概説します。この新しいアプローチは、より多くの聴衆にスクラッチ移行アッセイを提供し、研究者が細胞移動の生理学的および病理生理学的影響を調べるより大きな機会を提供する。

概要

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細胞の移動は、多くの生理学的事象および病理学的事象にとって極めて重要である。それは、開発中に、免疫応答を取り付けるために、および適切な創傷治癒1、2、3のために必要とされる。これらの細胞移動イベントの多くは、物理的または化学的な信号によって引き起こされる可能性があります。例えば、免疫応答中に、白血球は化学誘引剤2に応答して傷害部位に向かって移行する。さらに、白血球はまた、追加の免疫細胞の移動を誘導するためにサイトカインを放出し、ならびに創傷治癒過程に関与する線維芽細胞などの他の細胞タイプ、およびしたがって、多細胞応答4を始動する。細胞の移行能力は、適切な生理機能のために不可欠です。しかし、細胞の移動が未チェックになると、それは有害な反応を有し、慢性炎症、血管疾患、癌転移、および傷害治癒障害2、3、4、5、6、7などの病理学的事象に寄与する可能性がある。

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プロトコル

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1. 一般的な細胞培養

  1. 1 g/L グルコースを含むダルベックコの修飾イーグルス培地 (DMEM) の培養心臓線維芽細胞、 ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、および14.2 mM NaHCO 3、14.9 mM HEPES、15%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、2%L-グルタミン、および0.02%の抗菌試薬(材料表を参照)を補い、37°CでCO2インキュベーターで維持した。
  2. 90〜95%の合流まで培養心臓線維芽細胞は、通過0(P0)で到達する。この時点で線維芽細胞は、移行アッセイに使用される48ウェルプレートに分割する準備ができています。

2. 移行プレートの準備

  1. 黄色または明るい色の永久マーカーを使用して、ウェルの中心を下に、線を引くことによって48ウェル細胞培養プレートを準備します。次に、ウェルを 3 つの別々の対象領域に分割する 3 つのハッシュマークを描画します。これらのセクションは、イメージングに使用されます。
    注:ライトカラーの永久マーカーを使用すると、移動セルのイメージングが容易になります。黒や青などの暗いマーカーは、移動セルの視覚化を防ぎます。
  2. 基質(例えば、コラーゲン)上の移動を評価する場合は、特定の基質に使用される指示および濃度に従って、この時点でウェルをコーティングする。

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結果

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この手順は、ほとんどのラボで費用対効果が高く、容易に適応可能な、細胞移動を研究するための新しいアプローチを文書化しています。多くの研究では、細胞の移動を評価するためにタイムラプス顕微鏡を使用してきましたが、この方法に必要な機器は多くの研究室で容易に入手できません。線やダッシュを使用して境界を使用すると、高価な機器を使用せずに、異なる時点で特定の対象領域を取り戻すことができます(図1&図3)。この新しいアプローチには境界の使用が不可欠ですが、この方法には、個々の研究者のニーズに合わせて適応できる多くの分野があります。プロトコルは 24 時間のエンドポイントを示しました。ただし、個々のラボのニーズに基づいてエンドポイントを拡張できます。プロトコルのエンドポイントを調整することで、細胞の培養を継続して、さらに使用することができます。さらに、このプロトコルは、移動に対する細胞外マトリックス基質と同様に薬理学的修飾剤の影響をテストする柔軟性を可能にする。最後に、この方法の最もコストのかかるコンポーネントは、ライセンスを受.......

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ディスカッション

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スクラッチ移行アッセイに対するこの新しいアプローチは、研究者が細胞移動の変化を調べるためのよりアクセスしやすい方法を提供します。このアッセイは、他のスクラッチアッセイと同様のスクラッチを投与するための同じ手順に従うが、細胞移動10のイメージングおよび正確な分析のための新しい方法を提供する。この方法は、タイムラプス顕微鏡とライブセルイメージングチャンバの機器集約的な方法を使用する代わりに、一般的に利用可能なラボ機器の使用を詳述します。一般的な反転顕微鏡とカメラを利用して、一貫した培養条件を維持しながら、同時に移動画像をキャプチャすることができます。また、この方法は、高度な機器を使用することなく、同じ関心領域の正確なイメージングを提供します。同じ移行領域をキャプチャすることで、細胞移動の決定における不整合が軽減され、より厳密で正確な細胞移動の測定が可能になります。最後に、この方法はスクラッチの領域を考慮に入れます。傷の人間の変動を最小限に抑えるために注意が払われますが、不整合は依然として発生する可能性があります。全体的に見て、上記のプロトコルは、セルの移行を評価するために一般的に使用される強力.......

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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この研究は、米国陸軍医学研究賞#81XWH-16-1-0710、ミシシッピ大学薬学部、生体分子科学科によって支援されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アドビ すべてのアプリアドビこれには、このプロトコルで使用されるイメージングソフトウェアであるアドビフォトショップが含まれます
アバントピペットチップ 200ul バインディング非滅菌MIDSCIAVR1チップはオートクレーブ滅菌されています
AxioCam Erc 5s カメラツァイス426540-9901-000
クーマシー ブリリアントブルー R-250フィッシャーサイエンティフィックBP101-25
Costar 平底細胞培養プレート 48 ウェルズフィッシャー サイエンティフィ07-200-86
DMEM L-グルタミン、1g/L グルコース、ピルビン酸ナトリウムフィッシャー サイエンティフィMT10014CM
画像 JNIHこれは、米国政府が提供するフリー ソフトウェアであり、このプロトコル
パラホルムアルデヒドフィッシャー サイエンティフィック サイエンティフィック AC416785000
プレミアム米国起源のウシ胎児血清革新的な研究IFBS-HU
プリモシンInvivoGENant-pm-2これは、このプロコトールで心臓線維芽細胞を培養するために使用される抗菌剤です
ツァイスプリモバート顕微鏡ツァイス491206-0002-000
ゼンブルーエディション 2.3 ソフトウェアツァイスソフトウェアはカメラの購入が付属しています
ック ック

参考文献

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  1. Gilbert, S. F. Developmental biology. , Sinauer Associates, Incorporated. (1997).
  2. Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
  3. Yahata, Y., et al.

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