サイトカインの組み合わせで刺激したHaCaT細胞を用いたIn vitroでの乾癬様皮膚の転写プロファイルの確立

サマリー

この論文では、HaCaT細胞株上の5つのサイトカイン(IL-17A、IL-22、IL-1α、TNF-α、OSM)の組み合わせを使用して、転写レベルでin vitro乾癬様皮膚炎症モデルを確立する方法を提示します。

要約

乾癬は、自然免疫系と適応免疫系によって媒介される一般的な慢性炎症性皮膚疾患であり、表皮ケラチノサイトの異常な増殖と分化、および炎症細胞の浸潤を特徴としています。皮膚特異的なケラチノサイトは、自然免疫の主要な参加者であり、免疫細胞や環境刺激に応答するため、乾癬の免疫病因に重要な役割を果たしています。ここでは、IL-17A、IL-22、IL-1α、TNF-α、およびオンコスタチンMを含む5つの炎症誘発性サイトカインの組み合わせ(M5の組み合わせ)を使用して、HaCaT細胞株で乾癬様ケラチノサイトの炎症を転写レベルで誘導する方法を紹介します。結果は、M5の組み合わせ誘導HaCaT細胞が抗菌ペプチド(BD2、 S100A7、 S100A8、および S100A9)、ケモカイン、およびサイトカイン(CXCL1、 CXCL2、 CXCL8、 CCL20、IL-1β、IL-6およびIL-18)。ケラチノサイトの分化マーカー(Keratin1、 Keratin10、 Filaggrin、 およびLoricrin)のmRNAレベルはダウンレギュレーションされており、これは乾癬様ケラチノサイトに由来するトランスクリプトームデータと一致していました。したがって、ここで説明する方法は、転写レベルでin vitro乾癬様皮膚炎症を確立し、乾癬の分子病因の研究に貢献します。

概要

乾癬は、免疫応答の調節不全によって引き起こされる一般的な非伝染性慢性炎症性皮膚疾患であり、主に表皮を形成するケラチノサイト^{に影響を与えます1}、ケラチノサイトと角化亢進症および不全角化症を伴うケラチノサイトの異常急速な増殖を特徴としています。乾癬は、世界の野生の人口の約3%に影響を及ぼします²。疾患負担は、心血管疾患やシンドロームによって引き起こされるメタボリックシンドロームなど、いくつかの併存疾患によってさらに増加します³。

表皮は、ケラチノサイトの5つの層から構成され、分化の過程で、基底層、棘層、顆粒層、ルシダム層(手のひらと足の裏に見られる)、角質層^4の形態変化を経ます。表皮の分化の変化は、皮膚のバリアの乱れを引き起こし、これは皮膚炎症性疾患の病因にとって重要です5,6,7,8。ケラチノサイトは、水分の損失を防ぎ、UVB曝露、アレルゲン、病原体などの環境トリガーに....

プロトコル

手順1〜3は滅菌状態で行ってください。すべての培地には、0.1 mg / mLのペニシリンとストレプトマイシンが含まれていました。.

1. 細胞調製

1. 10 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)に10 mLのHaCaT細胞を播種し、100 mmの細胞培養皿に10%ウシ胎児血清(FBS)を添加します。培養皿を加湿した5%_CO2インキュベーターで37°Cで2日間インキュベートします。
2. 培養液が約80%のコンフルエントに達したら、培地を培養皿から慎重に取り出し、5 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄します。手動で培養皿を静かに揺らします。
3. PBSを取り出し、2mLの0.25%トリプシン-EDTA溶液を細胞に加えます。培養皿を静かに振って、溶液が細胞の単層を完全にコーティングします。
4. 加湿した5% CO₂ インキュベーターで細胞を37°Cで5分間インキュベートし、位相差顕微鏡で細胞が培養皿の表面から目に見える形で剥がれるまでインキュベートします。
   注:細胞の形態は丸く見えるはずです。細胞が十分に分離されていない場合は、手動で撹拌しながらさらに5分間インキュベートします。
5. 細胞が剥離し....

結果

M5併用刺激はHaCaT細胞の炎症反応を誘導した。
HaCaT細胞は、M5サイトカインの組み合わせの有無にかかわらず、免疫および炎症性ケモカインおよび抗菌ペプチドの調節に関与する乾癬関連遺伝子のmRNA発現を評価しました。好中球ケモカインCXCL1³⁸、CXCL2³⁹、CXCL8⁴⁰、およびT細胞ケモカインCCL20^41,42は、M5併用刺激HaCaT細胞において、未処理のHaCaT細胞と比較して時間依存的に有意に増加しました(図1A)。BD2⁴³、S100A7<.......

ディスカッション

本明細書に記載されるのは、5つのサイトカインの組み合わせ(IL−17A、IL−22、IL−1α、TNF−α、OSM)をHaCaT細胞株に用いて、転写レベルでin vitro乾癬様皮膚炎症プロファイルを確立する方法である。このプロトコルは、乾癬の病因における遺伝子のメカニズムに関する研究や、乾癬の治療薬のスクリーニングに適合させることができます。最近の報告では、IL-17AおよびIL22の過剰発現が病変皮膚でCD8 T細胞を産生していることが、乾癬の病因への関与を示唆していることが示されています⁶¹。IL-1α、IL-22、およびIL-17Aは、動物モデル^62,63,64,65において皮膚の炎症を誘発することができる。IL-17やIL-22などの産生された抗菌ペプチド

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM—ダルベッコの改変イーグルミディアムギ	ブコ	11965092
胎児ウシ血清	ギブコ	10100139C
HaCaT細胞	中国タイプ培養コレクション	センター GDC0106	15世代未満
ヒトIL-1&β;ELISAキット	Beyotime	PI305
ヒトIL-6 ELISAキット	Beyotime	PI330
ヒトIL-8 ELISAキット	Beyotime	PI640
IL-1 α Human	Prospec	CYT-253	組換えタンパク質
IL-17 Human	Prospec	CYT-250	組換えタンパク質
IL-22 Human	Prospec	CYT-328	組換えタンパク質
OSM Human	Prospec	CYT-231	組換えタンパク質
PBS	Gibco	10010049	pH 7.4
ペニシリン-ストレプトマイシン	Gibco	15140163
PrimeScrip RT 試薬キット	タカラ	RR047A
TB グリーン プレミックス Ex タ	カラ	RR420A
TNF アルファ ヒト	Prospec	CYT-223	組換えタンパク質
TRIzo 試薬	Invitrogen	15596018
トリプシン-EDTA (0.25%)、フェノールレッド	Gibco	25200072