本稿では、ヒト肺の近位領域および遠位領域からの生存上皮細胞の濃縮を可能にする組織解離および細胞分画アプローチの詳細な方法論を提供する。本明細書では、これらのアプローチは、3Dオルガノイド培養モデルの使用を通じて肺上皮前駆細胞の機能解析に適用される。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
上皮オルガノイドモデルは、臓器系の基本的な生物学を研究し、疾患モデリングのための貴重なツールとして役立ちます。オルガノイドとして増殖すると、上皮前駆細胞は自己更新し、 in vivo 対応物と同様の細胞機能を示す分化後代を生成することができる。本明細書では、ヒト肺から領域特異的前駆細胞を単離し、実験および検証ツールとして3Dオルガノイド培養物を生成するための段階的なプロトコルについて説明します。我々は、領域特異的前駆細胞を単離することを目標として、肺の近位領域および遠位領域を定義する。酵素的解離と機械的解離の組み合わせを利用して、肺と気管から全細胞を単離しました。次いで、基底細胞を選別するためのNGFRおよび肺胞II型細胞を選別するためのHTII−280などの細胞型特異的表面マーカーに基づく蛍光関連細胞選別(FACS)を用いて、近位または遠位起源細胞から特異的前駆細胞を分画した。単離された基底または肺胞II型前駆細胞を用いて、3Dオルガノイド培養物を作製した。遠位および近位前駆細胞の両方が、30日目に5000細胞/ウェルを播種した場合、遠位領域で9〜13%、近位領域で7〜10%のコロニー形成効率を有するオルガノイドを形成した。遠位オルガノイドはHTII-280+ 肺胞II型細胞を培養中に維持したが、近位オルガノイドは30日目までに繊毛細胞および分泌細胞に分化した。これらの3Dオルガノイド培養は、肺上皮と上皮間葉相互作用の細胞生物学を研究するための実験ツールとして、ならびに疾患における上皮機能障害を標的とする治療戦略の開発および検証のために使用することができる。
概要
ヒト呼吸器系の空域は、ガスの輸送およびそれに続く上皮 - 微小血管障壁を横切るそれらの交換をそれぞれ媒介する伝導ゾーンおよび呼吸ゾーンに大別することができる。伝導気道には気管、気管支、細気管支および末期細気管支が含まれ、呼吸空気空間には呼吸細気管支、肺胞管および肺胞が含まれる。これらの空域の上皮ライニングは、機能的に異なる各ゾーンの固有の要件に対応するために、近位 - 遠位軸に沿った組成の変化。気管気管気道の偽層化上皮は、ブラシ、神経内分泌およびイオノサイトを含むあまり豊富ではない細胞型に加えて、基底、分泌および繊毛の3つの主要な細胞型からなる1,2,3。細気管支気道は形態学的に類似した上皮細胞型を有するが、その豊富さと機能的特性には区別がある。例えば、基底細胞は細気管支気道内ではあまり存在せず、分泌細胞は、気管気管支気道において優勢な漿液性および杯細胞と比較して、クラブ細胞の割合が高い。 呼吸帯の上皮細胞は、肺胞管および肺胞のI型(ATI)およびII型(ATII)細胞に加えて、呼吸器細気管支における定義が不十分な直方体細胞型を含む1,4。
各ゾーンにおける上皮の維持および再....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
ヒト肺組織は、国際医学振興研究所(IIAM)が開発し、シダーズ・シナイ医療センター内部審査委員会によって承認された同意手順に従って、死亡した組織ドナーから入手した。
1. 気管気管支または小気道/実質(小気道および肺胞)領域から肺細胞を単離するための組織処理
- 細胞単離の1日前に、すべての解剖器具、ガラス製品、および適切な溶液を準備してオートクレーブします。
- 肺組織を受け取ったら、近位領域と遠位領域を同定して分離する。気管と気管支は「近位」と見なされます。このプロトコルの目的のために、気管および気管支の最初の2〜3世代が解剖され、「近位」気道上皮の単離に使用される。直径2mm以下の小さな気道および周囲の実質組織は、このプロトコールの目的上、「遠位」肺上皮と見なされる(図1A)。
注:ヒト肺組織の処理を含むすべての手順は、適切な個人用保護具を使用してバイオセーフティキャビネット内で実行する必要があります。
2. 遠位肺組織からの小気道および肺胞上皮前駆細胞の濃縮およびサブセット化
- 遠位組織調製
- 遠位肺組織を滅菌ペトリ皿(150 x 15 mm)に入れます。組織を約1cm3 個にサイコロで割って、清潔な50mLチューブに入れます。
- ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
ソース肺組織
気管および肺外気管支(図1A)を、近位気道上皮細胞の単離およびその後の近位オルガノイドの生成のための供給源組織として使用した。実質および直径2mm未満の小さな気道の両方を含む遠位肺組織(図1A)を、小さな気道および肺胞上皮細胞(遠位肺上皮)の単離および小気道または肺胞オルガノイドの生成に使用した。偽層状上皮によって裏打ちされた近位気道には、膜タンパク質NGFRに対して免疫反応性を有する豊富な基底前駆細胞が含まれる(図1B、C)。対照的に、肺胞を裏打ちする上皮細胞は、HTII-280モノクローナル抗体との頂端膜免疫反応性を示すサブセットを含み、それらの肺胞2型細胞(AT2)同一性を示唆する(図1B、D)。これらの表面マーカーは、近位領域または遠位領域のいずれかから単離された上皮細胞の.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
我々は、分子的または機能的解析および疾患モデリングのために、ヒト肺組織から肺細胞の定義された部分集団を単離するための信頼できる方法を説明する。方法の重要な要素には、新たに単離された細胞の抗体媒介濃縮を可能にする表面エピトープの保存による組織解離を達成する能力、および領域特異的上皮オルガノイドの効率的な生成のための培養方法の最適化が含まれる。我々は、三次元培養において間質支持細胞と再結合したときにオルガノイドを形成できる上皮前駆細胞の回収と濃縮に焦点を当てています。これらの培養物におけるオルガノイドのクローン性を定義しなかったにもかかわらず、単離されたマウス肺上皮前駆細胞を用いて実施された同様の研究は、異なる蛍光レポーターを保有する細胞の混合培養物の使用に基づいてクローン学的に示された22,23。
本明細書に記載の方法は、消化された肺組織からの細胞回収を改善することを意図した適応を含む。消化されたサンプルを16ゲージの針に通し、残りの未消化の凝集塊をさらに破壊し、均質.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
IFCおよびHおよびE染色の水野貴子、組織切片のヴァネッサ・ガルシア、原稿作成の支援に対するアニカ・S・チャンドラセカランのサポートに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(5RO1HL135163-04、PO1HL108793-08)とセルジーンIDEALコンソーシアムによってサポートされています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 細胞単離 | |||
| 10 mL 滅菌シリンジ、ルアーロックチップ | フィッシャー科学 | BD 309646 | |
| 30 mL 滅菌シリンジ、ルアーロックチップ | VWR | BD302832 | |
| バイオハザードバッグ | VWR | 89495-440 | |
| バイオハザードバッグ | VWR | 89495-440 | |
| コネクティングリング | プルリセレクト | 41-50000-03 | |
| デオキシリボヌクレアーゼ (ロット#SLBF7798V) | シグマ アルドリッチ | DN25-1G | |
| 使い捨てペトリ皿 | コーニング/ファルコン | 25373-187 | |
| ファンネル | プルリセレクト | 42-50000 | |
| HBSS | コーニング | 21-023 | |
| リベラーゼ TM 研究グレード | シグマ アルドリッチ | 5401127001 | |
| ニードル 16G | VWR | 305198 | |
| ニードル 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 & マイクロ;m(セルストレーナー) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 & micro;m(セルストレーナー) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 & micro;m(セルストレーナー) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 & micro;m(セルストレーナー) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 & micro;m (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades VWR | 55411-050 | ||
| Red Blood Cell Lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment'GentleMACS | |||
| C チューブ | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| ライカ ASP 300s ティッシュプロセッサ | |||
| LS カラム | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| サーモミキサー | エッペンドルフ | 05-412-503 | |
| サーモミキサー | エッペンドルフ | 05-412-503 | |
| HBSS+ バッファー | |||
| アムホテリシン B | サーモフィッシャー サイエンティフィ | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M)、pH 8.0、RNase-free | サーモフィッシャー サイエンティフィ | AM9260G | 500µl |
| ウシ胎児血清 | ジェミニバイオ製品 | 100-106 | 10ml |
| HBSS ハンクのバランスの取れた塩溶液 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml ボトル |
| HEPES (1 M) | サーモフィッシャー科学 | 15630080 | 5ml |
| ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン (PSN) 抗生物質混合物 | サーモフィッシャー科学 | 15640055 | 5ml |
| のリストFACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl / 107 全細胞 |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 全細胞 |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC 抗ヒト CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC 抗ヒト CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC 抗ヒト CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC 抗マウス IgM 抗体 | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| マウスIgM抗ヒトHT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE抗ヒトCD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| オルガノイド培養培地の | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI | Medium Stemcell Technologies | 5001 | |
| 小気道上皮細胞増殖培地 | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert 組織培養インサート、滅菌 | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK阻害剤) 100mM ストック (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| マウス基礎培地: | |||
| アムホテリシン B | サーモフィッシャー サイエンティフィ | サイエンティフィ | 15290018 50 & マイクロ;l |
| DMEM/F-12、HEPES | サーモフィッシャー科学 | 11330032 | 50 ml |
| ウシ胎児血清 | ジェミニ バイオ製品 | 100-106 | 5 ml |
| インスリン - トランスフェリン - セレン (ITS -G) (100X) | サーモフィッシャー 科学 | 41400045 | 500 & マイクロ;l |
| ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン(PSN)抗生物質混合物 | サーモフィッシャー科学 | 15640055 | 500 & マイクロ;l |
| SB431542 TGF-&β; 経路阻害剤 (ストック 100 mM) | 幹細胞 | 72234 | 5 µl |
| 免疫組織化学 | |||
| 抗原アンマスキング溶液、クエン酸ベースの | ベクターH-3300 | 937 µの抗体のリスト。l in 100ml water | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 モノクローナル抗体 (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC モノクローナル抗体 (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 抗体 | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| 二次抗体 | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| ヤギ抗マウスIgG1交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 488 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A-21121 | 1:500 |
| ヤギ抗マウスIgG2a交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 488 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A-21131 | 1:500 |
| ヤギ抗マウスIgG2a交差吸着二次抗体, Alexa Fluor 568 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A-21134 | 1:500 |
| ヤギ抗マウスIgG2b交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| 免疫組織化学インキュベーション溶液 | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| 免疫組織化学洗浄液 | TBS、0.1%Tween 20 |
参考文献
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
