ラット・ペイアーのパッチにおけるリンパ球ダイナミクスの顕微鏡観察

サマリー

ここでは、経胸管リンパ球を採取し、ラット・ペイアーのパッチ中の腸管リンパ球の移動をタイムラプス写真を用いて3時間観察するための正確な方法について述べた。この技術は、炎症性条件下でリンパ球の動態がどのように影響を受けるかを明らかにすることができる。

要約

ナイーブリンパ球は、生理学的状態下で血液からリンパ組織に再循環し、腸免疫における重要な現象として一般的に認識されています。ペイヤーのパッチ(P)や腸間膜リンパ節などの二次リンパ器官の間質は、ナイーブリンパ球が抗原を感知する場所である。ナイーブリンパ球は、高い内皮小静脈、PPへの参入のポータルに到達するために血流を循環します。一部の免疫調節剤はリンパ球の移動に影響を与えると推定されるが、微小循環ダイナミクスの正確な評価は非常に困難であり、生体内でリンパ球の移動を観察する方法を確立することは、正確なメカニズムの解明に寄与することができる。リンパ管からリンパ球を採取し、ラットPの腸管-熱帯リンパ球の詳細なダイナミクスを観察する方法を改良した。生体内でラットPを観察する共焦点レーザー走査顕微鏡を選び、タイムラプス写真を用いて記録しました。リンパ球動態の解析に貢献できる鮮明な画像を得ることができるようになりました。

概要

ペイアーのパッチ(P)は、小腸の層状層の数百のリンパ卵胞で構成されています。PPは、卵胞、卵胞間領域、および卵胞の下部に位置する胚葉中心に分けられ、そこでリンパ球は抗原提示によって刺激される。不十分なリンパ管はなく、抗原は上皮細胞層を介して腸管腔から層状のプロプリアに侵入する。リンパ様卵胞を覆う上皮領域は、毛包関連上皮と呼ばれ、その中に特殊な散在するM細胞が粘膜抗原を取り込む。M細胞は、その後、高等内皮細胞(HEV)^の内皮を介してPに流入する素朴なリンパ球に向かって提示される、発光側および抗原からの抗原を取り込む。PPは腸内免疫に重要な役割を果たし、炎症の初期段階に関連しています。多くの分子相互作用は、接着分子、ケモカイン^2、3、およびスフィンゴシン-1リン酸⁴を含む、二次リンパ系器官(SLA)へのリンパ球の入り口を含む。したがって、多くの期待される治療標的がある。したがって、PP内のリンパ球ダイナミクスを観察することで、炎症の非常に初期の段階を垣間見ることができ、いくつかの有望な薬物の有用性を調べることができます。

この方法は、いくつかの手順(胸管⁵ へのカヌリン化および採取されたリンパ球への注射後のリンパ球および長....

プロトコル

実験議定書は、国防医科大学動物研究委員会(16058年)によって承認された。動物は標準的な実験室のチャウ(クレア日本株式会社、東京、日本)で維持された。実験動物は国立衛生研究所のガイドラインに従って治療された。

1. リンパ球の採取と分離

注:リンパ球は新鮮で保存できないため、実験ごとにラットから採取する必要があります。さらに、腸管-熱帯リンパ球は、それらが循環する胸部管から直接収集されなければならない。すべての手順は6時間以内に完了する予定で、すべての器具、手袋、表面はきれいです。動物を生理的に安定した状態に保つためには、実験で使用されるすべての生理食塩水および他の液体を暖かく保つべきである。

1. ヘパリン曲線(半径約5mm)のように、高温(約80~90°C)に浸漬した後、缶詰チューブ(直径1mm)を形成し、数時間前から粘着テープを使用してプラスチック製の板に固定します。
2. ミダゾラム(2mg/kg)、ドミトール(0.15mg/kg)、ベトゥルファール(2.5mg/kg)の混合物を腹腔内注射で雄のウィスターラット(8-12週間)に麻酔し、ヘアクリッパーを使用して腹部の体毛を切断します。髪が腹腔に入らないように剃った後、しっかりと髪を取り除きます。
3. つま先ピンチにより、手術に必要な安定した麻酔の深さが得られていることを確認した後、中線から左肋後部領域に水平に外科用ハサ....

結果

リンパ球からのリンパ球の採取
胸部管のカヌレーションのためにラットを準備するには、 図1 に示すように緊張した胸管に切開し、次に図 2に示すようにボルマンのケージにラットを維持する。

リンパ球が十分に採取されると、約107〜108/mLリンパ球を含む約20mL/6hのリンパ液を得ることができる。TDLのうち、70%がCD4を発現し、その中で約90%の細胞がCD62Lを発現し、TDLの主な組成(>60%)を意味する。ナイーブ腸管リンパ球で構成されています。ここで採取したリンパ球は、腸管に特異的に移動する細胞であるため、ペイアーのパッチ中の移動状態を評価するのに適している。

顕微鏡観察
十分な量の蛍光リンパ球を注入した後、 図3

ディスカッション

ここでは、ナイーブな腸管熱帯リンパ球を収集し、ラットPでの移動を観察するためのプロトコルについて説明しました。これらの手順は、リンパ球がPの微小血管構造でどのように動くかを明らかにし、正常または薬用状態下でそれらのダイナミクスを視覚的に比較することを可能にする。これらのダイナミクスの直接観察は、観察期間は数時間に制限されているが、いくつかの薬物による免疫学的修飾の手がかりを得るために多くのメリットを有する。

メソッドにいくつかのヒントを記載しました。その中で最も繊細な手順の1つは、オペレータが胸部管を迅速かつ正確にできる必要があるということです。手術に時間がかかり、不必要な損傷を伴う場合、著しい出血および炎症が起こり、結合組織の浮腫および胸部管の閉塞によるTDL採取の減少をもたらす。私たちは、小さな刃先のはさみを使用して胸部管に小さな切開を作成した後、チューブをカニュールにしていました。しかし、この手順は、リンパの排水によるカヌレーション部位を妨害する。したがって、今、私たちは胸部ダクトを切断しません。むしろ、鋭いエッジでそれを刺します。この方法により、cannulation が簡.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
A1R+	ニコン		共焦点レーザー走査型顕微鏡
カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C1157
ホーチェスト 33342	サーモフィッシャーサイエンティフィック	H3570
イソフルラン	和光 純薬工業	099-06571
RPMI 1640 中	GIBCO	11875093
テキサスレッド–デキストラン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D1863