リードIIを用いた麻酔マウスの心電図記録

サマリー

我々は、技術的に容易で、安価で、速く、かつ、手ごろな価格の小型マウスで、高感度で実行できるECGプロトコルを提示する。この方法は、マウスの薬理学的薬剤、遺伝子改変、疾患モデルを研究するためのスクリーニングアプローチとして提案する。

要約

心電図は、心臓伝導システムを評価するための貴重なツールです。動物研究は、心電図に関する新しい遺伝的および薬理学的情報を生成するのに役立ちました。しかし、マウスなどの生体内の小動物の心電図測定は困難でした。この点を達成するために、我々は多くの利点を有する麻酔マウスで心電図記録方法を使用した:それは技術的に簡単な手順であり、安価であり、短い測定時間を有し、そして若いマウスでさえ、手頃な価格である。麻酔を使用する場合の制限にもかかわらず、制御群と実験群の比較は、高感度で行うことができます。我々は、このプロトコルの有効性を決定するために自律神経系のアゴニストおよびアンタゴニストを有するマウスを治療し、我々の結果を以前の報告と比較した。当社のECGプロトコルは、アトロピンによる治療における心拍数およびQTc間隔の増加、カルバコール治療後の心拍数およびQTc間隔の低下、イソプレナリンによる心拍数およびQTc間隔の上昇を検出したが、プロプラノロール投与に関するECGパラメータの変化には注意しなかった。これらの結果は、このECGプロトコルの信頼性を確認し、以前のレポートでサポートされています。したがって、この方法は、高コストおよび技術的困難のために試みることのないECG測定を行うスクリーニングアプローチとして使用することができる。

概要

心電図(ECG)は心拍の電気的活動を測定する検査であり、心伝導系を評価するための貴重なツールです。心電図で測定されるパラメータには、心拍数、PR間隔、QRS期間、およびQT間隔があります。簡単に言うと、PR間隔は、心房の裂孔ノードから房心室節を通ってプルキンエ繊維に電気インパルスが移動するのに必要な時間に対応します。QRS持続時間は、プルキンイェシステムと心室心筋を介して起こる心室脱分極の時間です。QT間隔とは、心室再分極の持続時間である。

マウスの心電図記録は、研究者が心機能を調べ、不整脈、心房細動、心不全などの心臓表現型の生理学的および病的生理学的メカニズムを決定するのに役立っています。ほとんどの心血管研究は、遺伝子組み換えマウスモデルの研究に関与しています。.遺伝的に操作された小さなマウスからECG記録に関する有意義なデータを得ることはしばしば困難です。

マウス¹で ECG を実行するための方法はいくつかあります。研究は、意識的な動物の心電図記録が、心機能に対する麻酔の効果が十分に確立されているので、可能な場合に麻酔動物よりも好ましいことを示唆している^2。意識的なマウスでECGを記録する2つのプロトコルは、注意¹です。ECG放射テレメトリシステムは、意識マウス^11,3におけるECGの連続的な長期モニタリングのためのゴールドスタンダード^である。意識的な状態で記録される強度にもかかわらず、放射テレメトリ結合ECG測定には、セットアップとインプラントの高い費用、経験豊富なオペレータの要件、1週間以上の安定化期間、大型マウスの必要性(>20 g)、およびECG記録¹の単一のリードの獲得を含むいくつかの制限があります。プラットフォームに埋め込まれた足サイズの導電性電極を使用する別のシステムは、麻酔またはインプラント^11、44を伴わない意識的なマウスでのECG記録を可能にする。この非侵襲的システムは、外科的処置の要件、麻酔の必要なし、マウスあたりの低コスト(初期セットアップは高価である)、測定のための短い時間、および新生児^11、44の手頃な価格など、多くの利点があるため、放射テレメトリシステムが利用できない状況での代替方法である。このシステムの主な欠点は、連続的な長期監視に適していないということです¹.

ここでは、麻酔マウスでの安価で簡単で高速な心電図記録方法を紹介し、心臓伝導系の自律遮断/刺激後にECGを行うことにより、その妥当性と感度を実証します。我々は、マウスにおける薬理学的薬剤、遺伝子改変、および疾患モデルの効果をスクリーニングするためのこの心電図法を提案する。

プロトコル

すべての動物の手順は、実験動物のケアと使用のための地元の委員会によって承認されました, キョンヒ大学 (ライセンス番号: KHUASP(SE)-18-108) そして、実験動物のケアと使用のための米国国立衛生研究所のガイドに準拠.

1. 実験動物

1. すべてのマウス(39匹のマウス、Balb/ c、雄、7\u20129週齢)を病原体のない施設に保管し、実験動物のケアと使用のためのガイドに従ってください。
2. マウスは、食料と水への自由なアクセスで一定の温度で12時間の明暗サイクルで維持します。

2. 麻酔薬の調製

注:トリブロモエタノールは、トリブロモエタノール麻酔マウス¹1、5、6における心拍数の安定性と心エコー検査の再現性に基づいて^、5,ケタミンの組み合わせとイソフルランに使用されます^。

1. 1 mL の第三級アミルアルコールの濃度で 2,2,2-トリブロモエタノールのストック溶液を作ります。40\u201245 °Cで24時間温め、4°Cで12ヶ月間保管してください。
2. 働く溶液のために、25 mg/mLに生理食塩水(0.9%NaCl)の19.5 mLのストック溶液の0.5 mLを希釈する。40\u201245 °Cで1時間温め、4°Cで1ヶ月間お店を保管してください。

3. ECGシステムのセットアップ

1. マウスの心電図信号は環境騒音や動きに敏感であるため、2m以内にノイズや振動がないようにシステムを設定してください。
2. ハードウェアのセットアップを準備する:データ収集システム、バイオアンプ、およびECGデータ分析ソフトウェアでインストールされているコンピュータ。
   1. 電源ケーブルを使用して、データ収集システムを電源(AC)に接続します。
   2. USBケーブルを使用して、データ収集システムをコンピュータに接続します。
   3. バイオアンプの背面パネルの信号出力を、ケーブルを使用してデータ収集システムのフロントパネルのアナログ入力に接続します。
   4. I 2 Cケーブルを使用して、データ収集システムのI²C出力をバイオアンプの^I2C入力に接続します。²
   5. 3リードバイオアンプケーブルを、バイオアンプのフロントパネルの6ピン入力ソケットに接続します。
   6. 背面パネルのスイッチを使用してデータ収集システムの電源を入れます。
      注:簡単に言えば、信号はバイオアンプを介して増幅され、次のチャネル設定のコンピュータ化されたデータ取得および分析システムを使用して記録される:2 k /sのサンプリングレート、20 mVの範囲、および200 Hzのローパスフィルタ設定。
3. 分析ソフトウェアプログラムを開き、ECGデータ取得用に設定します。
   1. [設定] に移動する |チャネル設定:サンプルレートを2 k/sに設定し、範囲を20 mVに設定します。入力アンプを200 Hzのローパスに設定します。
   2. ECG分析に移動 |ECG 設定検出と分析の設定のプリセットで「マウス」を選択します。
   3. [平均化]パネルで、連続する心周期N(例えば4拍または60s)を、平均ビューおよびテーブルビューの単一の平均信号に連結することを選択します。
   4. QTcパネルで、QT間隔の心拍数補正値として定義される「バゼット」法を選択します:QTc = QT / (RR/100)^0.5、RR間隔= 60/心拍数^7。

4. ECG測定

1. マウスを精密なスケールに置き、その重みを記録します。
2. 腹腔内(すなわち)トリブロモエタノールの働く溶液(体重当たり18mLの働く溶液(b.w.))の注入によってマウスに麻酔を誘発する。
3. 麻酔マウスを上の位置に置きます。マウスが完全に麻酔状態であることを確認します(2分未満)。
4. リードII ECGスキームに従って、鍼治療針を皮下に右および左前肢と左後肢に挿入し、テープで固定する(図1)。挿入電極の深さと位置が実験全体を通して一貫していることを確認します。
5. 電極の他の端を3リードバイオアンプケーブルのリード線の反対側にある3つのスナップコネクタにクリックして接続します。
6. 麻酔薬が送達されてから3分後に薬を注射する(図2)。
7. 麻酔薬を注入した後、ECG 10分の記録を開始します。記録が完了したら、麻酔薬を注入した後、12〜17分間のECGデータを使用して分析を行います。
8. ECG記録セッションの終了時に、電極を慎重に取り外します。

5. ECGデータ分析

1. ECG分析に移動 |ビューを平均化し、ソフトウェアが個々のビートのP波、QRS複合体、およびT波の開始と終了を正しく識別することを確認します。必要に応じて、誤って置かれたカーソルを適切な位置に移動することで、これらの波や間隔を手動で修正することができます。
   注: 図3Aに示されているように、PR 間隔は P 波の発症から QRS コンプレックスの設定に及びます(ほとんどはマウスの ECG に Q 波が欠けています)。QRSの持続時間は、Q波の発症(主にマウスECGのR波)からS波の終わりまで延びる。QT間隔は、T波の終わりまでのQ波(主にマウスECGにおけるR波)の発症を含む。マウスのQ波及びSTセグメントの短い持続時間および存在の欠如は、ヒトの^ECG8に対して相対的である。
2. ECG分析に移動 |テーブルビューとは、ビューの平均化ウィンドウで個々のビートをチェックすることにより、正しく識別されたECGデータを選択します。
   注:図 3は、実際のマウス ECG 信号の例をいくつか示しています。図3Aは、P波、QRS複合体、およびT波に関して正しく識別された正常な野生型信号を表しています。PQRS波のコンピュータ化された選択は、図3Bのように、P波の発症を誤って配置する通常の野生型信号のような誤った誤配置を引き起こす可能性があります。図3CではQRS複合体の末端を誤って配置するECG信号を用いて、QRS持続時間を過大評価する結果となる。図3DではQRS複合体の終わりを誤って配置するECG信号を、不明瞭なT波と図3Eが識別できないT波を有するECG信号によるQRS複合体の過小評価を生じる。除外または手動による修正を行わない場合、PQRS 間隔は超過または過小評価される可能性があります。正しく識別されたECG信号と、ターゲットのピークを逃さない信号を必ず選択してください。したがって、このような場合は、B、C、D、およびE(図3)を含む、一般に正確にECGパラメータを推定する際に除外される。
3. テーブルビューで目的のECGデータを選択し、スプレッドシートファイルにコピー/ペーストします。

6. 統計分析

1. 統計プログラムを使用して統計分析を実行します。ブラインドされた実験条件でデータを分析します。2 グループ比較のために、学生のt-test と Mann-Whitney U 検定を実行します。各図の数字は、各グループで使用されるマウスの数を示しています。結果を平均値 ±SEM として報告します。
2. U検定によるpp<0.05との違いは統計的に有意であると考えてください: *, p < 0.05;**, p < 0.01;および***、p < 0.005 対対応のコントロール。

結果

薬理実験

私たちの非侵襲的なECG測定が心臓伝導系に対する自律神経変調の影響を反映しているかどうかを判断するために、正常なBalb/cマウスは自律神経系(ANS)のアゴニストおよびアンタゴニストと挑戦しました。アトロピンとカルバコールはそれぞれ副交感神経自律神経遮断および刺激に作用するために使用され、一方、プロプラノロールおよびイソプレナリンは交感神経自律神経遮断および刺激をそれぞれ引き出すために投与された^、9。

心拍数はアトロピン(p<0.05)およびイソプレナリン処理マウス(p<0.05)で有意に増加し、カルバコール(p< 0.005)は、車両と比較して(車両、391±13 bpm対アトロピン、487±15 bpm対カルバコール、158±7 bpm;車両、382 ±14 bpm対イソプレナリン、548 ±8 bpm;車両、404±25bpm対プロプラノロール、303±16bpm bpm)<...

ディスカッション

プロトコルには、いくつかの重要な手順があります。周囲の環境は騒音や振動から解放されるべきである。ECG電極は、研究者が技術的に経験するまで、挿入ステップが予備的な実験を必要とする皮膚の下に安定して一貫して挿入されなければならない。また、麻酔薬は適切に調製して保存し、適切な用量で使用するべきである。最後に、PQRS波は、平均表示ウィンドウ内の個々のECGビートに適切に配置する必要があります。

我々の研究には、薬物の検査が含まれていた。しかし、薬理学的検査を省略すると、麻酔薬の注入後5分で記録を開始することでステップ4.7を変更することができ、ECGデータは10〜15分まで使用することができる。⁵

自律神経遮断および薬物による刺激は、心拍数に関して差動応答を引き出す。いくつかのプロトコルは、ECG研究で使用されています.マウスでテレメータされたECG録音に基づいて、 アトロピン、イソプレナリン、およびプロプラノロールは心拍数を有意に変化させなかったのに対し、カルバコールは有意に減少し...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2,2,2-トリブロモエタノール	Sigma-Aldrich	T48402-25G	麻酔薬, Avertin
Animal	Japan SLC, Inc., 静岡県		Balb/c マウス, 雄, 7-9 週齢
Atropine	Sigma-Aldrich	A0123	副交感神経拮抗薬
BioAmp	AD Instruments, Bella Vista, Australia	ML132	バイオアンプ
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382	副交感神経作動薬
鍼付き電極	DongBang Acupuncture Inc., Sungnam, Korea	DB106	0.20 x 15 mm
Isoprenaline	Sigma-Aldrich	I2760	sympathetic agonist
LabChart 8	AD Instruments, Bella Vista, Australia		データ分析ソフトウェア
Mouse food	LabDiet, St. Louis, MO, USA	5L79	マウスダイエット
PowerLab 2/28	ADインスツルメンツ、ベラビスタ、オーストラリア		データ収集システム
プロプラノロール	シグマ-アルドリッチ	P0884	感神経拮抗薬
SPSS統計プログラム	SPSS	SPSS 25.0	統計プログラム