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方法論記事

デンプン顆粒サイズ分布の解析と仕様

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DOI：

10.3791/61586

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2021年3月4日

 ,  , 
1Cooperative Agriculture Research Center, College of Agriculture and Human Science, Prairie View A&M University

この記事について

サマリー

ここでは、デンプン顆粒サイズ分布の再現性と統計的に有効な決定、および2パラメータ乗法形式を使用して決定された顆粒対数正規サイズ分布を指定するための手順を示します。植物や食品科学の研究のためのグラムスケールデンプンサンプルのすべての顆粒サイジング分析に適用可能です。

要約

すべての植物源からの澱粉は、異なる発生頻度を有する様々なサイズおよび形状の顆粒で構成されている、すなわち、サイズおよび形状分布を示す。 いくつかのタイプの粒子サイズ設定技術を用いて決定されたデンプン顆粒サイズデータは、顆粒形状への感受性や顆粒サンプルサイズの制限など、乗り越えられない体系的な誤りから生じる再現性の悪さや統計的有意性の欠如のためにしばしば問題となる。電気センシングゾーン手法を用いてデンプン顆粒サイズ分布の再現性と統計的に有効な決定、精度と比較可能性を向上させた採用された2パラメータ乗算形式を用いて決定された顆粒対数サイズ分布を指定する手順を概説した。これは、グラムスケールデンプンサンプルのすべての顆粒サイジング分析に適用可能であり、したがって、デンプン顆粒サイズがデンプン生合成装置およびメカニズムによってどのように成形されているかに関する研究を容易にする可能性があります。そして、それらが食品および産業用途のためのデンプンの特性および機能性に与える影響。代表的な結果は、概説された手順を用いて、サツマイモの澱粉サンプルの顆粒サイズ分布の複製分析から提示される。我々はさらに、手順のいくつかの重要な技術的側面、特に、顆粒対数正規サイズ分布の乗算仕様と、顆粒凝集体による頻繁な開口閉塞を克服するためのいくつかの技術的手段について議論した。

概要

デンプン顆粒は、植物光合成および貯蔵組織における2つの主な予備ホモグルカンポリマー、線形またはまばら分岐アミロースおよび高度に分岐したアミロペクチンが、脂質およびタンパク質を含むいくつかのマイナーな成分と一緒に整然と詰まっている物理的構造である。さまざまな植物種のデンプン顆粒は、球体、楕円体、多面体、血小板、立方体、立方体、不規則な細管を含む多くの3次元(3D)形状(ref.1、2)を示す。同じ組織や同じ植物種の異なる組織のそれらでさえ、様々な発生頻度を持つ形状のセットを持つことができます。つまり、植物種由来のデンプン顆粒は、特定の形状ではなく、特徴的な統計的形状分布を有し得る。不均一で球状の顆粒形状により、デンプン顆粒のサイズを適切に測定および定義することが困難になります。さらに、植物種の同じ組織由来のデンプン顆粒は、異なる割合のサイズの範囲、すなわち、特徴的なサイズ分布を示す。このサイズ分布は、デンプン顆粒サイズの分析と記述をさらに複雑にします。

デンプン顆粒のサイズは、顕微鏡、沈積/立体式場流分画(Sd/StFFF)、レーザー回折、電気センシングゾーン(ESZ)を含む粒子サイズ化技術のいくつかのカテゴリ(ref.3)を使用して分析されています。しかしながら、これらの技術は、顆粒状およびサイズ分布の存在下でのデンプン顆粒サイズの決定に等しく適していない。光、共焦点、走査型電子顕微鏡を含む顕微鏡は、形態4、5、6、7、構造8、9、およびデンプン顆粒の開発10、11の研究に優れていますが、固有の欠点のためにそのサイズ分布を定義するのにはほとんど適していません。いくつかの種のデンプンの顆粒サイズの決定に使用されてきた光学顕微鏡データ(IAOM)の顕微鏡顆粒画像またはソフトウェア支援画像分析の直接測定、 トウモロコシ12、小麦13、14、ジャガイモ15、大麦16を含む、1D(通常は最大長)または2D(表面積)サイズの非常に限られた数(数万から数千)のデンプン顆粒画像のみを測定することができます。技術によって本質的に制約される小さな顆粒サンプリングサイズは、デンプンの単位重量当たりの巨大な顆粒数(1グラム当たり120 x 10 6、1.5 g/cm³密度で10 μmの球すべてを仮定)を考慮すると、統計的に代表されることはほとんどありません。Sd/StFFF技術は、高速および分解能、およびデンプン顆粒17の狭いサイズの画分を有する可能性があるが、その精度は、損傷、異なる形状、およびデンプン顆粒の密度によって深刻な影響を受ける可能性があるため、おそらくほとんど使用されていない。レーザー回折技術は最も広く使用され、すべての主要な作物種3、14、16のデンプン顆粒サイズ分析に適用されています。この技術には多くの利点があるが、実際には顆粒形状分布の存在下でのデンプン顆粒サイズの決定には適していない。同時レーザー回折器のほとんどは、均一な球状粒子の三重光散乱理論18と、他の均一性の形状については修正されたMie理論18に依存している。この技術は、したがって、本質的に粒子形状に非常に敏感であり、均一性19の特定の形状にも完全には適しておらず、ましてや様々な割合の形状のセットを有するデンプン顆粒に対しては完全に適していない。ESZ技術は、開口を通過する粒子の体積に比例する電界の乱れを測定する。粒状の体積サイズ、数、体積分布情報などを高解像度で提供します。ESZ技術は、色、形状、組成または屈折率を含む粒子の光学特性とは無関係であり、結果は非常に再現性が高いため、特に一連の形状を有するデンプン顆粒のサイズ分布を決定するのに適している。

デンプン顆粒のサイズも多くのパラメータを使用して定義されています。それらはしばしば平均直径によって皮口的に記述されたが、これはいくつかのケースでは、2D画像12、20、または同等の球径の平均の顕微鏡的に測定された最大長の算術手段であった3。他の場合には、粒状サイズ分布は、サイズ範囲21、22、分布平均容積または平均直径(球量、数、体積、または表面積で重み付け)を使用して指定した場合は、正規分布14、23、24、25、26である。様々な分析からデンプン顆粒サイズのこれらの記述子は、非常に異なる性質のものであり、厳密に比較することはできません。異なる種のデンプン顆粒のこれらの「大きさ」、あるいは同じ種の同じ組織を直接比較した場合、それは非常に誤解を招く可能性があります。さらに、想定された正規分布の広がり(または形状)パラメータ、すなわち、分布の幅(すなわち、サイズの広がり)を測定するσ標準偏差(またはグラフィック標準偏差σ g)は、ほとんどの研究で無視されている。

デンプン顆粒のサイジング分析が直面している前述の重大な問題を解決するために、ESZ技術を用いてデンプンサンプルの顆粒サイズ分布を再現可能かつ統計的に有効な決定を行う手順と、採用された2パラメータの対数正規サイズ分布を正確かつ可分性の向上を用いて適切に指定する手順を概説した。検証とデモンストレーションのために、サツマイモ澱粉サンプルの複製顆粒サイズ分析を手順を用いて実行し figure-introduction-1 figure-introduction-2 、x/(乗算および除算)s* 形式で、そのグラフィック幾何平均と乗算標準偏差s * を使用して対数微分体積率体積等価球径分布を指定しました。

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プロトコル

1. 澱粉サンプルの調製

  1. 確立された手順に従って、各種植物種のデンプン蓄積組織から2つ(または3グラムスケール)の複製デンプンサンプルを調製する(例えば、ジャガイモ15、サツマイモ28、小麦粒13、29、トウモロコシカーネル30、等)。
  2. スターチサンプルをアセトンまたはトルエン3~4xで十分に洗浄し、顆粒凝集体を最小限に抑え、完全に乾燥させます。
    注: 準備毎に1g以上の澱粉を生成する抽出手順を使用してください。3つまたは2つの反復抽出物のそれぞれから1つまたは2つの0.5gのアリコートが、それぞれ、1つのデンプン抽出物の顆粒サイズ分析のためにサンプリングされる。

2. 電解質製剤

  1. 50g/L塩化リチウム500 mLをメタノールで調製し、レプリケーションデンプンサンプル(1ランあたり100 mLと100 mLを追加)用に4回のサイジングランにします。好ましくは、電解質を大量のバッチで作り、例えば、一度に4〜8L、濃度変動を最小限に抑える。
  2. 容器を氷の上または4°Cキャビネットで冷却し、塩化リチウムの溶解を速めます。

3. アナライザーのセットアップ

  1. 分析するデンプンサンプルの既知の(文献または試行走行を通して)顆粒サイズの範囲(例えば、サツマイモの澱粉の100 μm開口)をカバーする粒子径範囲を有する開口チューブを選択してください。未知の顆粒サイズの範囲のデンプンサンプルの場合、粒子径範囲が重なっているいくつかの絞り管を使用して試行を経て適切な絞りを選択します。
    注: 開口チューブの粒子径範囲は、2~60%の正確なサイズ範囲で、オリフィス径の80%まで拡張されたサイズ範囲です。 表1 は、主要な作物デンプンの顆粒をサイズ変更するための3つの最も有用な開口管の特性を示しています。澱粉サンプルの粒状サイズ範囲が単一の開口チューブのサイズ範囲よりも広い場合、異なるサイズの絞りを測定して最大5個の粒径分布を組み合わせたマルチチューブオーバーラップ解析を行います。各絞りは、チューブにラベル付けされた直径と部品番号によって識別できます。チューブ上のバーコードに含まれるその直径とシリアル番号は、アナライザのコントロールパネルのバーコードリーダーを使用して、アナライザソフトウェアにスキャンすることができます。
  2. デンプン顆粒サイズの測定に100 mLまたは200 mL分析ビーカー(キュベット以上)を選択し、測定中に良好な顆粒懸濁液を維持するために自動攪拌(以下)を設定します。
  3. 実行設定を指定する標準動作方式 (SOM) と、結果を分析、表示、および印刷するための環境設定ファイルを作成します。SOM と基本設定ファイルを必要に応じて標準操作手順 (SOP) に結合します。
    注: 標準化されていない分析の場合は、SOM を使用して解析を実行し、必要に応じて [SOM を編集] ウィンドウ(下記参照)を使用して実行間の SOM 設定を調整します。実行が完了したら、必要に応じて環境設定を変更して、実行結果を分析、表示、および印刷します。標準化可能な顆粒サイズ解析では、SOP を使用して解析を実行します。
    1. アナライザー ソフトウェアを起動します。メインマニュで 、SOP | SOM ウィザードの作成 または SOM の編集を行うか、またはステータス パネルで [SOMの編集] をクリックします。ウィザードまたは [SOM の編集] ウィンドウを使用して、SOM の設定を選択します。サツマイモ澱粉サンプルの顆粒のサイズ変更に一般的に使用される設定を 表 2にまとめています。
    2. 作成した SOM を、SOM ウィザードの設定の概要 ウィンドウまたは [SOM の編集] ウィンドウでファイルに保存します。
    3. メインマニュで、[SOP]をクリック|[プリファレンスの作成ウィザード]または[プリファレンスの編集]環境設定編集ウィンドウのウィザードまたはタブを使用して、必要に応じて、表 3または他の設定値として環境設定を選択します。
    4. 選択した環境設定を、環境設定の作成ウィザードの作成ウィザードの設定の概要ウィンドウまたは 「環境設定の編集」 ウィンドウでファイルに保存します。
    5. メイン メニューで 、[SOP] をクリック|SOP の作成ウィザード:ウィザードのステップ バイ ステップ ガイドに続いて、説明を入力し、作成する SOM および基本設定ファイルを選択し、SOPを保存します。

4. 澱粉サンプルの粒状サイズ分析

  1. アナライザーの準備
    1. アナライザーの電源を入れ、コンピュータでソフトウェアを開き、アナライザーへの自動接続後にステータスパネルの上部にある[準備完了]ステータスを確認します。
    2. 電解液瓶を電解質で満たし、必要に応じて廃棄物瓶を空にします。
    3. ユーザーズマニュアルのガイドに従って、選択した絞りチューブを適切に取り付けて固定します。キャリブレーションされていない新しい絞りチューブの場合は、キャリブレーションの下のステップバイステップガイドに従って キャリブレーション| メインメニューで絞りを調整します。校正された絞りチューブの場合は、実行またはキャリブレーションの下にある「 絞り管の変更」ウィザード のステップバイステップガイドに従って キャリブレーションを確認|メインメニューで絞りキャリブレーションを確認 します。
    4. ロックリリースクリップ(左サンプルコンパートメントの壁の中央前面)を押して、手動でプラットフォームを下に下げて、アッセイプラットフォームのロックを解除します。100 mL の電解質を含む分析ビーカーをプラットフォームに配置し、攪拌位置に攪拌機を移動し、手動でプラットフォームをセルフロックの上の位置に上げて、開口チューブと攪拌機を電解質に浸します。
    5. 下部の計器ツールバーの [充填] をクリックして、アナライザーに自動的に電解質を入力させ、[ フラッシュ ]をクリックして、アナライザが自動的にシステムをフラッシュします。
    6. [メイン メニュー] の[SOP | SOM の読み込み] をクリックして SOM を読み込み、SOM を使用して、プリファレンス ファイルを使用せずに分析を実行します。または、SOP |をクリックしてSOP をロードします。メインメニューの SOP をロードするか、ステータスパネルのSOPをロードし、SOP を使用して分析を実行します。
    7. SOP を使用する場合は、メイン メニューの[SOM 情報]または[基本設定情報| SOP]をクリックして、SOM と基本設定を確認します。[サンプル|メインメニューにサンプル情報を入力するか、ステータスパネルで情報を編集して、実行のサンプル情報を入力します。
  2. デンプンメタノールサンプルとサイジング懸濁液を準備する
    1. それぞれ2または3つの複製デンプン抽出物から2または1個の0.5gサンプルを秤量する。
    2. 50 mL円錐形遠心分離管に5 mLメタノールに0.5 gデンプンアリコートをそれぞれ加え、超音波プロセッサから低強度超音波(12-24 W/cm2)のいくつかのパルスを使用してデンプン顆粒を完全に分散させます。
    3. 使い捨て可能な移管ピペットを使用して、澱粉メタノール懸濁液の1つの小さな滴(〜0.2mL)をビーカーで一定の攪拌下で50 g/L LiClメタノール電解質の100 mLに塗布する。サンプルコンパートメントドアを閉じます。
  3. サイズ変更の実行
    1. 下部のインストゥルメントツールバーで「 プレビュー 」をクリックして、プレビューの実行を開始します。ステータスパネルで、動的に表示される濃度バーが緑色で表示され、サスペンションの公称濃度範囲が 5 ~ 8% であることを確認します。
    2. 下部の ツールバーの 停止をクリックして、プレビューの実行を停止します。必要に応じて、懸濁液のアリコートを電解質に置き換えてデンプン電解質懸濁液を希釈し、プレビュー実行を繰り返します。
      注:サスペンションの5%から8%の公称濃度範囲は、凝集した顆粒による絞り閉塞のために停止せずに実行を完了するために重要です。必要に応じて、滴検サンプルサイズ、および/またはデンプンメタノール懸濁液の濃度を調整して、公称濃度を最適範囲にした新しいデンプン電解質懸濁液を作ります。
    3. 検証後、下部のツールバーの [開始 ]をクリックして実行を開始します。分析装置は、実行中の ステータス パネル に実行時間と共に表示されるサイズの粒の合計数が、SOM の 制御モード によって設定された合計カウント (125,000 または 250,000) に達すると、自動的に実行を完了します。懸濁液濃度(5~8%以下)に応じて、1回の走行に2~5分以上かかります。
      注: アナライザーが SOM の閉塞検出設定ごとの絞り閉塞を自動的に検出すると、実行を中止し、絞りを解除してブロックを解除し、新しい実行を開始します。このブロックアクションは、アナライザーが実行操作をキャンセルする前に、最大 4 回繰り返すように設定されています。この実行中止の閉塞問題は 、表 2 に示された 2 つの技術的な方法を使用して、説明で詳しく説明することによって克服できます。
    4. 必要に応じて、下部ツールバーの[開始]または[繰り返し]をクリックするだけで、同じデンプン電解質懸濁液を使用して技術的な繰り返し実行を実行します(表2および説明の説明)。
    5. 実行または繰り返し実行が完了した後、ビーカーを空にし、メタノールでリンスし、次の実行のために100 mLの新鮮な電解質溶液で再充填します。
    6. 実行中に、60 μm を超える顆粒の数が合計カウントの 0.1% を超えた場合に 拡張サイズ範囲 の通知ダイアログが表示された場合は、拡張ダイナミック サイジング範囲を絞り直径の 80% に実行する場合は 、[60% から 80% を実行] をクリックします。
      注: 拡張サイズ範囲 の設定は、開口直径の 60% (この場合は 100 μm) を超える顆粒のアクションを制御します。SOM の設定は、60 μm を超えるデンプン顆粒を含めることを指定し、その数が総カウントの 0.1% を超える場合に使用されます。実行の完了は、合計カウントによって制御され、合計の合計 0.1% (静的に有意でない量と推定される) より大きな顆粒を含めずに、それ以外の場合よりもわずかに短い時間を要する場合があります。
  4. 実行結果の分析
    1. 実行の制御に SOM を使用した場合は、メイン メニューのSOPの下にある[基本設定の作成ウィザード] または[環境設定の編集]を使用して、結果の表示、印刷、および統計分析に必要な設定を選択します。
    2. 比較のために、1 つのグラフで複数の実行の結果をオーバーレイします。
      1. メイン ツールバーまたはファイル|の[オーバーレイ] をクリックします。[メインメニュー]をクリックして[オーバーレイ]ウィンドウにアクセスします。[ファイル] ボックスで目的の複数の結果ファイルに移動して選択し、[追加] をクリックして [選択したファイル] ボックスに移動し、[OK]をクリックして選択した結果を 1 つのグラフに重ね合わせることができます。
      2. 開いているオーバーレイにファイルを追加するには、[ファイルの実行]をクリック|[実行]メニューの[オーバーレイ]を開いて[オーバーレイ]ウィンドウにアクセスし、目的のファイルに移動して、クリックして追加します。
    3. 反復分析(2抽出x 2デンプンサンプリングまたは3抽出x 1デンプンサンプリング)からの平均結果を、平均粒状サイズ分布と統計量をリストまたはグラフで表示または印刷します。
      1. メイン メニューで、[ファイル] | [ファイル] をクリック|平均ウィンドウを開く平均。[ファイル] ボックスで目的の複数の結果ファイルに移動して選択し、[追加] をクリックして [選択したファイル] ボックスに移動します。
      2. 平均分布に追加の結果ファイルを含めるには、[実行] メニューの [ ファイルを開く] | [平均値に追加 ] をクリックして [平均値に追加] ウィンドウを開き、ファイルに移動して追加します。新しい平均は、グラフの [実行 (結果)] ウィンドウまたはリストに表示されます。

5. 平均分布の指定

  1. 平均分布を表示するメニューの実行ウィンドウで、計算|[実行] メニューの平均統計値を使用して、統計情報の概要ウィンドウを開き、行の平均統計量と、列の平均分布のグラフ統計を表示します。
  2. グラフ統計列のグラフィック幾何平均 figure-protocol-1 ()および S.D.(s*) を使用して figure-protocol-2 、x/ s* 形式で平均分布を指定します。平均 figure-protocol-3 統計行にリストされている平均S.D.(σ)を使用して平均分布の幾何平均平均の平均平均平均値(μ、平均分布と同じ)を除算して、平均複製分布の変動を測定するCVを計算します。
    注: 複製分布の平均値の変動を評価する平均 S.D. (μ) は、 figure-protocol-4 平均分布の広がりを測定するグラフィックジオメトリ S.D. とは異なります。

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結果

この手順を検証し、決定した顆粒サイズ分布の再現性を実証するために、サツマイモデンプンサンプルの複製サイジング解析を行いました。先に説明した手順28を用いて同様の発達年齢で、飼育ラインSC1149-19の畑成長サツマイモからの複製(S1およびS2)澱粉サンプルを調製した。各デンプン抽出物から、2つの0.5gアリコート(aおよびb)をサンプリングし、5mLのメタノールに懸濁し、凝集体を分解するために低エネルギー超音波のいくつかのパルスで超音波処理した。デンプンメタノール懸濁液の2組の各ペアをドロップサンプリングしてデンプン電解質懸濁液を作り、次に上記の概説されたSOMを使用して2回サイズ(技術的な繰り返し実行)し、それぞれ125,000顆粒の合計カウントを行った。1 回のサイズ変更の実行ごとに、合計カウントが約 65,000 ~125,000 を超えると、表示された微分体積サイズ分布のグラフィックジオメトリ S.D.(s*) と幾何平均 ( figure-results-1 ) ...

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ディスカッション

概説された手順は、デンプン顆粒サイズ分析のためのいくつかの既存の方法でいくつかの重要な問題を解決しました, 3D顆粒の不適切な1Dまたは2Dサイジング、均一な顆粒形状によるサイズ測定の歪み、限られた顆粒サンプルサイズによる再現性の悪さ、疑わしい統計的妥当性、顆粒形状と無正規サイズ分布の両方の存在下での顆粒サイズの不正確または不適切な仕様(特に平均サイズの使用)を含む。デンプン顆粒の3Dサイズ(体積)を測定し、顆粒形状に反応しないESZ技術を使用しています。非常に大きな顆粒サンプルサイズ(4 x 250,000)を持つ複製分析から平均粒状サイズ分布を導出する設計は、結果を統計的に有効で再現性が高めるだけでなく、技術的に凝集した顆粒と損傷した顆粒による歪み測定を軽減してサイズ精度を向上させます(以下を参照)。代表的な結果で示されるように、この手順を用いて決定された複製分布の幾何学的手段の平均に対するCVは、通常5%未満であり、結果の満足のいく再現性を示す。さらに、 figure-discussion-1 対数正規顆粒体積等価球サイズ分布のスケール()...

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開示事項

著者は開示するものは何もない

謝辞

この研究の一部は、農業大学総合農業研究センターと農業・人間科学部総合食料安全保障研究センター、プレーリービューA&M大学によって支えられている。私たちは、彼の技術サポートのために華天に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
分析ビーカーベックマン・コールター ライフサイエンスA35595スマートテクノロジー(ST)ビーカー
アパーチャチューブ、100 & マイクロ;mベックマン・コールター ライフサイエンスA36394MS4E
ポーザブルトランスファーピペッター用、フィッシャーサイエンティフィック (Fishersci.com)13-711-9AM同様のオリフィスを持つ他のディスポーザブルトランスファーピペッターも使用できます。
フィッシャーブランド円錐形ポリプロピレン遠心分離チューブ、50ミリリットルフィッシャーサイエンティフィック(Fishersci.com)05-539-13チューブの他の同様のタイプを使用することができます。
ガラスビーカー、150 〜 250 mlフィッシャーサイエンティフィック (Fishersci.com)02-540Kこれらのビーカーは、開口管と攪拌機を洗浄するためのメタノールを封じ込めるために使用されます。
LiClフィッシャーケミカルL121-100
メタノールフィッシャーケミカルA412-500分析では大量のメタノールを使用するため、まとめて購入します。
メトラー・トレド ML-T 精密天びんメトラー・トレド302434120.01gから1mgのその他の精密天びんであれば、どんな精密天びんでも使えます。
マルチサイザー4e コールターカウンターベックマン・コールター ライフサイエンスB23005旧モデルのマルチサイザー3は、パラメータを少し調整するだけでも使用できます。4eモデルには100μが付属しています。m絞り管。直径の異なる他の絞り管は、会社とは別に購入できます。
超音波プロセッサUP50Hヒールシャー超音波技術UP50H低電力(<50ワット)出力も使用できます。特定の超音波処理器用のMS1およびMS2ソノトロードの両方を使用して、デンプン顆粒を5mlのメタノールに分散させることができます。常に最も低い設定、20%の振幅、0.1または0.2サイクルを最初に使用し、アグリゲートが懸濁状態が続く場合は設定を上げます。
ディス

参考文献

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