血清型1肺 炎球 菌519/43株における変異体の構築

サマリー

ここでは、自然にDNAを獲得する能力を利用して遺伝子改変できる 肺炎球 菌血清型1株519/43と自殺プラスミドについて述べる。原理の証明として、ニューモリシン(プライ)遺伝子の同質変異体が作られました。

要約

肺炎連鎖球菌 血清型1は、低中所得国、特にサハラ以南のアフリカで依然として大きな問題となっています。その重要性にもかかわらず、この血清型の研究は、それを改変するための遺伝的ツールの欠如によって妨げられてきました。本研究では、血清型1臨床分離株(株519/43)を遺伝子改変する方法について述べる。興味深いことに、これは肺炎球菌が自然にDNAを取得する能力を利用することによって達成されました。しかし、ほとんどの肺炎球菌とは異なり、線状DNAの使用は成功しませんでした。この重要な株を変異させるには、自殺プラスミドを使用する必要がありました。この方法論は、その生物学と病原性の両方の観点から、このとらえどころのない血清型をより深く理解するための手段を提供しました。この方法を検証するために、主要な既知の肺炎球菌毒素であるニューモリシンは、よく知られたわかりやすい表現型を持っているため、変異しました。予想通り、突然変異体が赤血球を溶解する能力を失ったことを示しました。目的の血清型で重要な遺伝子を変異させることができれば、腹腔内および鼻腔内感染時の機能喪失変異体の表現型が他の血清型で観察されたものとは異なる表現型を観察することができました。要約すると、この研究は、株519/43(血清型1)が遺伝子組み換え可能であることを証明しています。

概要

肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae、肺炎球菌)は、世界的に罹患率と死亡率の主な原因の1つです。最近まで、100近くの血清型のS.肺炎が発見されています1,2,3,4,5,6,7。毎年、侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)は、5歳未満の子供の約70万人が死亡している^{と主張しています8}。肺炎球菌は、世界中の細菌性肺炎、中耳炎、髄膜炎、敗血症の主な原因です⁹。

アフリカの髄膜炎ベルトでは、血清型1が髄膜炎の発生の原因であり、非常に毒性の高い配列型である配列型(ST)ST217が優勢です^10、11、12、¹³、¹⁴

プロトコル

1. SOE-PCR23による変異アンプリコンの生成とスペクチノマイシンカセットの増幅

1. まず、株519/43由来のプライ遺伝子の隣接領域の相同性アーム(それぞれply 5'(488 bp)およびply3'(715 bp))の増幅のためにPCRを実行します。プライマー plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATTACTATCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) および plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTTTATCCTCTACC).
2. ply5'には次のPCR条件を使用します:94°Cで60秒間変性、ステップ2:94°Cで30秒間変性、ステップ3:58°Cで30秒間アニーリング、ステップ4:72°Cで30秒間伸長、ステップ5:ステップ2に戻って35サイクル繰り返し、ステップ6:72°Cで30秒間の最終伸長。
   1. ply3' には、ステップ 4 とステップ 6 の延長時間が 60 秒であることを除いて、同じ PCR 条件を使用します。
....

結果

ここで説明するプロトコルは、PCRを使用して左右の相同性アームを増幅すると同時に、 プライ 遺伝子の中央領域から191 bpを削除することから始まります。PCRを実行している間、BamHI部位が左相同性アームの3'側および右相同性アームの5'末端に導入されます(図1A)。これに続いて、左右の相同性アームが1つのアンプリコンに融合されたPCR-SOEが続きます(図1B)。次に、このSOE-PCRアンプリコンをTAクローニングを使用してpGEMTeasyにクローニングし、プラスミドpSD1を生成します(図1C)。形質転換が成功すると、アンピシリンに耐性のある白いコロニーが得られます。青色コロニーは、空のpGEMTeasyプラスミドを含む形質転換体になります。次に、pSD1は、SOE-PCR時に導入されたBamHI部位で消化され(図1D)、スペクチノマイシンカセットにライゲーションされます.......

ディスカッション

肺炎連鎖球菌、特に血清型1は、侵襲性肺炎球菌疾患および髄膜炎を引き起こす世界的な脅威であり続けている。血清型1に対して保護されるべきさまざまなワクチンの導入にもかかわらず、アフリカでは、この血清型は依然として高い罹患率と死亡率につながる発生を引き起こす可能性があります¹³。この血清型を遺伝的に操作する能力は、その臨床的関連性のために非常に重要です。この研究に記載されている方法は、この血清型内の代表的な株の遺伝子操作を可能にします。侵襲性株519/43(ST5316)、デンマークの髄膜炎患者からの臨床分離株²⁵。

ここで紹介した方法論は、外因性DNAを取得できるため、主に選択された株によって成功しましたが、肺 炎球菌 の形質転換に使用される従来のプロトコルに加えられた変更により、形質転換プロトコルの典型的な成功率は約70%です。

この方法論では、通常の線状DNAの代わりに自殺プラスミドを使用すること.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AccuPrime Pfx DNA ポリメラーゼ		12344024	フラグメントの増幅に使用
アンピシリンナトリウム塩	シグマ アルドリッチ	A9518	ステージ 1 (pSD1)
血液寒天培地	オキシド	CM0055	S. pneumoniae 形質転換体
ウシ血清 アルブミン	シグ	55470	S. pneumoniae Transformation
Brain Heart Infusion		Oxoid CM1135	S. pneumoniae細胞の増殖に使用される
塩化カルシウム Cacl2	Sigma	449709	S. pneumoniae Transformation
Competence stimulating peptide 1	AnaSpec	AS-63779	S. pneumoniae 形質転換
ルリアブロス寒天培	ギブコ	22700025	pSD1およびpSD2のめっきおよび選択
ルリアブロスベース(ミラーの製剤)	ブコ	12795027	pSD1およびpSD2
ナークゲル抽出キット	NEB	T1020S	からバンドを抽出するために使用されます
Miniprep Kit	NEB	T1010S	細胞からプラスミドを抽出するために使用
pGEM T-easy	Promega	A1360	Suicide Plasmid
S.O.C.	形質転換後の細胞の回収に使用される	Invitrogen	15544034
水酸化ナトリウム (NaOH)	Sigma	S0899	S.pneumoniae 形質転換
に使用されます スペクチノマイシン塩酸塩	SigmaAldrich	PHR1426	細菌の選択に使用されます
サブクローニング効率 DH5αコンピテントセル	Invitrogen	18265017	pSD1 および pSD2 の作製に使用

マのプレートに使用地に使用 に使用されます ギモ DNAゲルモナークプラスミド