高分解能の無傷の全網膜および硝子体イメージングのための顕微手術解剖および組織透明化

サマリー

ここに提示されるのは、眼球の外側の不透明/色素沈着層が外科的に除去され、光学的透明化が適用されて網膜を透明化し、ライトシート蛍光顕微鏡を使用して無傷の網膜の末梢網膜と硝子体血管系の視覚化を可能にする無傷の全網膜イメージングのためのプロトコルです。

要約

生理学的および病理学的状態における網膜のニューロンおよび血管構造は、従来の網膜フラットマウント製剤および切片と比較して、無傷の全網膜イメージング技術を使用することで、よりよく視覚化および特徴付けることができます。しかし、無傷の網膜全体の免疫蛍光イメージングは、眼球、すなわち強膜、脈絡膜、および網膜色素上皮(RPE)の不透明なコーティングと、全層の高解像度光学イメージングを妨げる網膜層の光散乱特性によって妨げられます。これらの障害に対処するために、色素層の化学的漂白と組織透明化プロトコルが説明されています。しかし、現在記載されている方法は、無傷の全網膜における緑色蛍光タンパク質(GFP)などの内因性蛍光分子のイメージングには適していません。他のアプローチでは、色素沈着層と眼球の前部を外科的に除去することでこの制限を回避し、末梢網膜と硝子体の構造は破壊されましたが、無傷の眼のイメージングが可能になりました。ここに提示するのは、強膜/脈絡膜/網膜色素上皮(RPE)層の外科的解剖と修正された組織透明化法およびライトシート蛍光顕微鏡法(LSFM)を組み合わせた無傷の全網膜および硝子体免疫蛍光イメージングプロトコルです。この新しいアプローチは、網膜の動揺しない血管およびニューロン要素、ならびに病理学的状態の硝子体および硝子体血管系について前例のないビューを提供します。

概要

健康な状態と疾患状態における網膜ニューロンと血管要素の間の相互作用は、パラフィンまたはクライオ固定網膜組織の物理的切片または網膜平坦製剤の免疫蛍光研究によって伝統的に研究され^{てきました1。}しかし、組織切片化は網膜のニューロンと血管の連続性を乱し、隣接する網膜切片の3次元再構成が可能な解決策として提案されていますが、それでもエラーやアーティファクトの影響を受けます。また、網膜フラットマウント製剤は、網膜血管およびニューロン要素の完全性、および隣接する網膜領域間の地理的接続を著しく乱します²。あるいは、最近、網膜ニューロンおよび血管成分の自然な解^{剖学的位置}での三次元投影を視覚化するために、無傷の全網膜イメージングが導入されました2,3,4,5。

無傷の全網膜イメージングでは、無傷の全網膜の隣接する網膜領域(タイル)の血管要素およびニューロン要素からの蛍光シグナルが、ライトシート顕微鏡を使用してキャプチャされます。次に、これらのタイルを「縫い合わせ」て、網膜全体の3次元ビューを再構築します2,3,4,5,6。無傷の全網膜イメージングは、網膜血管疾患、変性疾患、および炎症性疾患の病因を研究するための前例のない網膜のビューを提供します2,3,4,5,6。例えば、Prahstらは、無傷の全網膜のライブイメージングを用いて、酸素誘発性網膜症(OIR)モデルにおいて、病理学的血管房、異常な細胞運動性、および糸状仮足ダイナミクスの変化に対する、以前は「評価されていなかった」結び目のある形態を明らかにし^{ました2。}同様に、Henningら、Singhら、およびChangらは、無傷の全網膜^における複雑な三次元網膜血管網を実証した^3,4,6。Vigourouxらは、無傷の全眼イメージング法を使用して、周産期⁵の網膜と視覚投影の組織を示しました。網膜のこのような比類のない3次元ビューを作成することができるようにするために、無傷の全網膜イメージングプロトコルは、2つの主要な制限を克服しています:1)眼球(強膜、脈絡膜、およびRPE)の不透明で色素沈着したコーティングの存在、および2)網膜核層および網状層の光散乱特性によって引き起こされる全網膜の厚さを通る光の限られた透過。HenningらとVigourouxらは、無傷の網膜を画像化できるように、脈絡膜/RPE色素のH₂O₂漂白を適用した^3,5。しかし、漂白は、緑色蛍光タンパク質(GFP)などの内因性蛍光色素を有する動物株や、生体内免疫蛍光染色後の動物株には適していません^3,5,7。さらに、Henningらの_H2O2処理の方法は、網膜剥離を生じるマイクロバブルを生成する可能性のある水性条件で実施した。また、_H2O2処理は55°Cで行い、これは組織抗体親和性をさらに悪化させる条件であった。さらに、漂白は酸化メラニンに由来する重い自家蛍光を導入する可能性があります⁸。過マンガン酸カリウムとシュウ酸を使用した眼切片の他の色素脱失プロトコルは、胚性切片のRPE色素を除去することができましたが、この色素脱失法は免疫標識の有効性を低下させることも示されています^9,10。漂白に代わるものとして、Prahstら、Singhら、およびChangらは、強膜、脈絡膜および角膜を除去して、網膜全体を顕微鏡光が到達可能にした^2,4,6。ただし、角膜、水晶体、および末梢網膜を切除すると、末梢網膜と硝子体血管が歪んで混乱する可能性があるため、これらの方法は末梢網膜と硝子体血管系の研究には適していません。

現在利用可能なすべての無傷の全眼イメージングプロトコルには、網膜層^2,3,4,5の光散乱特性を克服するための組織光学的透明化ステップの使用が含まれています。組織光学的透明化は、光の散乱および吸収を最小化するために、特定の組織、ここでは網膜の屈折率をその細胞および細胞間の要素のすべてにわたって均等化することにより、網膜を顕微鏡光に対して透明にする¹¹。眼球の色素沈着コーティング(脈絡膜およびRPE)は十分に除去できないため、組織の光学的透明化が網膜に適用される前に、脈絡膜およびRPEを除去または漂白する必要があります6,12,13,14,15,16,17,18。

未熟児網膜症(ROP)、持続性胎児血管系(PFV)、ノリー病、およびスティラー病などの病的状態における硝子体および硝子体血管系の関与および寄与は、組織調製において網膜および硝子体血管が破壊されない場合に最もよく研究される19,20,21,22,23.無傷の全網膜イメージングのための既存の方法は、硝子体とその血管系を自然に破壊する眼の前部を除去するか、漂白剤を適用して内因性の蛍光色素を除去するかのいずれかです。硝子体と血管系を無傷で手つかずの状態で視覚化するための公開された方法は欠けています。ここでは、眼球の色素沈着および不透明なコーティングの外科的解剖、網膜に最適化された修正組織光学的透明化、およびライトシート蛍光顕微鏡法からなる全網膜および硝子体イメージング法について説明します。サンプル調製、組織光学的透明化、ライトシート顕微鏡法、および画像処理のステップについて、以下で詳しく説明します。

プロトコル

すべての実験は、テキサス大学医学部の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。動物の使用とケアは、眼科および視覚研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の声明に従っていました。この手順を実行するために必要なすべての材料は、 資料の表に記載されています。各ステップを実行するときは、パウダーフリーの手袋を着用してください。手順6と7については、公式の顕微鏡操作マニュアルも参照してください。

1.動物の準備

1. 該当する施設動物管理および使用委員会が承認したプロトコルに従って実験マウスを安楽死させます (ここでは、ケタミン 60 mg/kg とデクスメデトミジン 0.5 mg/kg の組み合わせによる麻酔と、その後の子宮頸部脱臼を使用しました)。直ちに解剖と心臓灌流のためのプラットフォーム上で動物を安定させることに進みます。
   注:実験動物は、個々の研究のデザインに基づいて選択されます。
2. 腹部と胸部を解剖して心臓を露出させます。左心室に配置された27Gの針を介して心臓を輸血することにより心臓灌流を行い、右心房に小さな(~1mm)切開を作成して血液の排出を可能にします²⁴。
   1. まず、30〜50 mLの氷冷リン酸平衡生理食塩水(PBS)を輸血し、次に30〜50 mLの新たに調製した4%パラホルムアルデヒド(PFA)を輸血します。
   2. PFA輸血が成功したかどうかを確認するには、体全体と尾全体に目に見える筋肉のけいれんがないか確認します。除核ステップに進みます。

2.眼球の核摘出と固定

1. 湾曲した宝石商の鉗子を使用して、上まぶたまたは下まぶたをそっと押して、眼球を眼窩から押し出します。宝石商または同様の鉗子の別のセットを使用して、結膜を側面から穿刺し、視神経側から球体を保持します。球体が視神経から切断されるまで、球体をソケットからゆっくりと持ち上げます。
2. 調製したばかりの氷冷した4%PFAを含むチューブにグローブを移します。それに応じてチューブにラベルを付けます。グローブを4°Cの冷蔵庫で4%PFA中に入れたまま12時間(一晩)待ちます。
   注意: 先端がカットされたプラスチック製の移送ピペットを使用して、地球儀を移します。2つ目のピペットチップでカットチップの開口部を広げ、鋭いエッジでサンプルを損傷しないようにします。

3. サンプルの解剖(図1 および 図2)

1. 実体顕微鏡下で、角膜-強膜接合部(図1A)を特定し、30 G針の鋭い切断先端を使用して、角膜-強膜接合部の約0.5〜1 mm後ろの強膜に非常に表面的な切断を行います(図1B)。
2. 鋭利な先端の刃の1つを切開はさみに進め、強膜/脈絡膜/ RPEと網膜の間の潜在的なスペースに行ったばかりの切開部をはさみます(図1C)。はさみを進め、強膜/脈絡膜/ RPEが網膜の外面から剥がれるまで円周方向に切ります(図1D、E)。
   注意: 網膜に穴が開かないように、この手順をゆっくりと穏やかに実行することが重要です。最初の数回のカットは、網膜をカットしないようにするために特に重要です。
3. 必要に応じて、強膜/脈絡膜/RPEに放射状に弛緩するカットを行い、円周方向の切断とそれに続く視神経と強膜/脈絡膜/ RPEの剥離のプロセスを促進します。PBSに浸したサイズ1のペイントブラシを使用して、RPEの小さなパッチ(図1F)を取り除きます。
4. 無傷の眼球全体をPBSの入ったチューブに移します。すぐに次のステップに進むか、免疫標識のために4°Cで保存してください。
   注:眼球には、核摘出後、および必要に応じて眼の向きを保つために解剖後に眼球にマークを付けることができます。ここでプロトコールを一時停止し、サンプルを4°Cの冷蔵庫で一晩保存してから次のステップに進むことができます。

4. 血管染色

1. 0.2% Tween-20 を含む PBS に室温で 20 分間浸漬することにより、組織を透過化します。
2. サンプルをPBSで3回、シェーカーで10分間洗浄します。
3. 0.25% Triton X-100 を含む PBS 中の 5% 正常ヤギ血清 (NGS) とサンプルを室温で 1 時間インキュベートします。
4. 一次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。ここでは、抗マウスコラーゲンIV抗体を使用しました(最終濃度は0.2%Tween-20を含むPBSで調製しました)。
5. PBSで3回、1回の洗濯につき5分間洗ってください。
6. サンプルを蛍光標識二次抗体とインキュベートします。ここでは、抗ウサギ剤のAlexa Fluor 568を4°Cで12時間使用しました(0.2%Tween-20を含むPBSで1:200希釈)。
7. PBSで3回、各1時間洗浄した後、ティッシュの除去手順に進みます。

5. 2,2′-チオジエタノール(TDE)による光学的清算

1. PBSを含むストックTDE溶液を使用して、最終濃度が10%、20%、30%、40%、50%、および体積比(v / v)になるように、作業TDE濃度を調製します。各眼サンプルに少なくとも2 mLの溶液を調製して、組織に浸透するのに十分な量の余裕を確保します。
2. TDEの濃度を上げるように、6ウェルまたは12ウェルプレートウェルでサンプルをインキュベートします。まず、無傷の眼球全体を10%TDE溶液に10%TDE溶液に室温で2〜4時間浸します。続いて、各TDE濃度で2〜4時間、サンプルをより高いTDE濃度に移します(図2C)。
   注:網膜は40%〜50%の濃度で透明化し始めますが、60%溶液でのインキュベーション後に最大の透明化が起こります。網膜は、70%以上の濃度で透明度が低下します(図2D)。
3. 必要に応じて、連続する清算交換ステップのいずれかで清算プロセスを一晩停止します。

6. ライトシート顕微鏡による眼全体のイメージング

1. 使用するライトシート顕微鏡プラットフォームの構成を考慮して、無傷の全眼サンプルをマウントします。顕微鏡と取得ソフトウェアの指示に従って、ライトシートのアライメント、光路の照明と検出などの取得パラメータを設定します。
   注:この実験で使用したサンプルは、角膜側から皮下注射針の先端までインスリン注射器に接着されました(図2E)。その後、サンプルを顕微鏡チャンバー内に懸濁しました。
2. 顕微鏡チャンバーに60%TDEを清澄溶液として充填します。
3. サンプルをライトシート顕微鏡チャンバー内に60%TDE溶液(最終透明濃度)に浸します。
4. さまざまな市販またはカスタムメイドの共焦点顕微鏡およびライトシート顕微鏡を使用して、クリアな目を画像化します。このプロトコルでは、両面照明ライトシート顕微鏡が使用されます。
5. 低解像度および低倍率のイメージング(5倍、NA 0.16)を使用して、特にタイリングと組み合わせた場合に、細胞形態および細胞プロセストレースをイメージングします。高解像度と倍率のイメージング(20倍、NA 1.0)を使用して、細胞の形態と、核やミトコンドリアクラスターなどの大きな細胞内小器官の両方をイメージングします。

7. 撮影後の画像処理

注:取得後の処理は、ファイルの種類と画像化されたファイルと互換性のあるソフトウェアによって異なります。

1. ブレ除去またはデコンボリューションを適用して、画像化されたタイルをステッチする前に生の画像をさらに補強します。Weinerフィルターを適用して、画像のブレを除去できます。或いは、ImageJ PSFジェネレータプラグイン²⁵のようなモデリングツールを使用して、Richardson−Lucyデコンボリューションおよび理論的または実験的に測定されたPSFを用いてノイズ除去した後、画像を反復的にデコンボリューションすることができる。
2. 前処理されたzスタックのステッチングと、アフィンおよび非リジッドボリューム変換、その後、さまざまな商用またはパブリックドメインのソフトウェアパッケージ(ImageJ – BigStitcherプラグイン)を使用して、マルチビューボリュームレジストレーションとフュージョンを実行します²⁶。

結果

乳頭周囲血管網とミクログリアのゼロ角度投影を図3Aに示します。また、CX3CR1-GFPマウスにおける網膜ミクログリア全体の無傷の分布を図3Bに示します。ここで紹介する方法の主な利点は、自然蛍光色素をイメージングする能力です。図3:C、Dは、現在のインタクト全眼イメージング法(図3C)とフラットマウント調製法(図3D)で調製したサンプルの代表的なZ投影(緑チャネル)のミクログリアを示しています。ミクログリアを定量化し、無傷の全網膜およびフラットマウント調製物から無作為に選択した関心領域で比較しました。フラットマウントと無傷の全網膜イメージングとの間には、ミクログリア数に関して統計的に有意な差は認められませんでした(図3E)。

ディスカッション

網膜および硝子体の発達と病状は、切片やフラットマウントの準備のために網膜を切断しない無傷の全網膜イメージング技術で最もよく研究されます。既存の無傷の全眼イメージング法は、先天性蛍光色素を除去する色素漂白を組み込むか、眼球の不透明なコーティング(RPE、脈絡膜、強膜)と眼の前部を物理的に除去することを含み、末梢網膜や硝子体を乱す可能性があります。ChangらとPrahstらは、眼球の外側のコーティングと角膜を取り除き、それによって硝子体と硝子体血管系と末梢網膜を破壊する可能性がある^2,4。そのため、彼らの方法は、網膜の細胞の特徴や硝子体の発達、および硝子体血管系が関与する病状の研究には適していない可能性があります。あるいは、HenningらとVigourouxらは、^{顕微鏡イメージングのために}脈絡膜とRPEを透明にする技術として顔料漂白を使用した^3,5<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Experimental animal
CX3CR1-GFP マウス	ジャクソン研究所	5582
麻酔
デクスメデトミジン	パー製薬	42023-146-25
ケタミン	フレゼニウス カビ
組織採取、固定、およびサンプル解剖
心臓灌流ポンプ	フィッシャー科学	NC9069235
シアノアクリレート瞬間接着剤	amazon.com
ファインハサミ-シャープ	ファインサイエンスツール	14160-10
ファインピンセット	ファインサイエンスツール	11412-11
パラホルムアルデヒド (PFA)	Electrone microscopy sciences	15710-S
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010049
size 1 painting brush	dickblick.com
straight spring hasors	ファインサイエンスツール	15000-03
シリンジ、ニードルチップ、27 ゲージ x 1.25 インチ	BD
チューブ 1.5 ml、15 ml、50 ml	Thermo sceintific
Tween-20	ThermoFisher	85114
Immunofluorescent staining
Anti-mouse collagen IV antibody	Abcam	ab19808	1:200 希釈
抗ウサギ Alexa Fluor 568	Invitreogen	A-11011	1:200
希釈 通常のヤギ血清	サーモフィッシャー	50062Z	10% 濃度
<強>組織クリアリング
2,2&プライム;-チオジエタノール (TDE)	フルカ アナリティカ	STBD7772V
ロッキング シェーカー	フィッシャー サイエンティフィ	02-217-765
<強>顕微鏡
蛍光ミクロスフェア	テトラスペック	T14792
ライトシート蛍光顕微鏡 (LSFM)	ツァイス	Z1
<ストロング>ミクログリア enumeration
ImageJ	国立衛生