一分子局在顕微鏡を用いたヒトiPSC由来心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの解析

サマリー

適切なサルコメアネットワークの形成は、iPSC由来心筋細胞の成熟にとって重要である。我々は、心臓の発達を促進する培養条件を改善するために、幹細胞由来心筋細胞の構造成熟の定量的評価を可能にする超解像ベースのアプローチを提示する。

要約

iPSC由来心筋細胞の成熟は、再生療法、薬物検査および疾患モデリングにおける応用において重要な課題である。複数の分化プロトコルが発達しているにもかかわらず、成人のような表現型に似たiPSC心筋細胞の生成は依然として困難である。心筋細胞成熟の主要な側面の1つは、高い収縮能力を確保するためによく組織されたサルコメアネットワークの形成を含む。ここでは、心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの半定量的解析のための超解像ベースのアプローチを提示する。光活性化局在化顕微鏡を用いて、新生児組織から分離したiPSC由来心筋細胞と心臓細胞のサルコメア長さおよびZ-ディスク厚さの比較を行った。同時に、信頼性の高いデータを得るための適切なイメージング条件の重要性を示しています。我々の結果は、この方法が高い空間分解能を有する心細胞の構造的成熟度を定量的に監視するのに適しており、サルコメア組織の微妙な変化を検出することを可能にすることを示している。

概要

心筋梗塞や心筋症などの心血管疾患(CVD)は、西洋世界における主要な死因^である。人間の心臓は再生能力が乏しいだけであるため、CVDからの回復を促進する戦略が必要です。これには、失われた心筋細胞(CM)を補充するための細胞置換療法と、効率的かつ安全な医薬品介入のための新しい抗不整脈薬の開発が含まれます。誘導多能性幹細胞(iPSC)は、ヒトCMインビトロでの無限の生成のための有望な細胞源であることが示されており、再生療法、疾患モデリング、および薬物スクリーニングアッセイ^{22、3、43,4}の開発に適している。

多くの異なる心臓分化プロトコルが存在するが、iPSC由来のCMは、インビトロおよびインビボアプリケーション^55、66を妨げる特定の定型的および機能的な側面をまだ欠いている。電気生理学的、代謝的、および分子変化に加えて、心臓成熟プロセスは、力の生成および細胞収縮に必要な基本的な単位であるサルコメアの構造組織を含^む7。成人のCMは、よく組織された収縮装置を示すが、iPSC由来のCMは、収縮能力の低下および収縮性の変化に関連するサルコメアフィラメントの配置解除を一般に示す^。,9単軸収縮パターンを示す成熟CMとは対照的に、未熟CMにおける混乱した構造は、細胞全体の径方向収縮を生じ、または収縮焦点^99,1010の出現を促進する。

心臓成熟を改善するために、3D細胞培養法、電気的および機械的刺激、ならびに生体内条件^{11、12、13,12,13}における細胞外マトリックスを模倣する細胞外マトリックスの使用を含む、複数のアプローチが適用されている。これらの異なる培養条件の成功と効率を評価するためには、iPSC CMの構造成熟度を監視および推定する技術が必要です。従来の共焦点イメージングとは対照的に、光活性化局在化顕微鏡(PALM)の場合の分解能は約10倍高い。この技術は、細胞構造の微妙な変化を検出し、より正確な分析を可能にします¹⁴.PALMベースのイメージングの高解像度を考慮すると、この方法の全体的な目標は、zディスクの厚さとサルコメアの長さの正確な決定によるiPSC由来CDのサルコメア成熟度の顕微鏡的評価でした。これまでの研究では、これらの構造的特徴は、心の成熟^度15を評価するための適切なパラメータであることが示されている。例えば、全長のジストロフィンを欠いた疾患のiPSC-CMは、野生型細胞¹⁶と比較した場合にサルコメア長さおよびzバンド幅を減少させた。同様に、個々のサルコメアの長さを測定し、心臓発達¹⁶に対する地形の手掛かりの影響を調べた。そこで、サルコメアの長さとzディスクの厚さを定量的に測定することにより、iPSC-CMにおけるサルコメアネットワークの構造成熟を評価するためにこのアプローチを適用しました。

プロトコル

新生児マウスと成体マウスを含むこのプロトコルのすべてのステップは、ロストック大学医療センターの動物ケアのための倫理ガイドラインに従って行われました。

1. iPSC由来心筋細胞の培養と解離

1. 前述の^2D単層法を使用して hiPSC-CM を 25 日間区別します。
2. 前温解離媒体を37°Cにし、培地を室温まで支持する。
3. PBSで細胞を2回洗浄します。
4. 細胞に温め込み解離培地を加え、37°Cおよび5%CO2で12分間インキュベート₂する。
5. セルにサポート メディアを追加します。
   注: 追加するサポート メディアのボリュームは、手順 1.4 で使用される解離媒体の 2 倍のボリュームである必要があります。
6. 5 mL血清ピペットを使用して細胞を取り出す。
7. 遠心分離細胞は 200xg で5分間、3mLのhiPSC-CM培地培地¹⁷でペレットを再懸濁した。
8. 75,000細胞/ウェルの細胞密度で8ウェルガラス底チャンバーの種子細胞と3日間培養。

2. 成人心筋細胞の分離

1. NMRIマウスからの成体心筋細胞の単離および培養は、以前に報告された¹⁸のように行った。
2. 8ウェルガラスチャンバースライドおよび培養1日で細胞をシードする。

3. 新生児心筋細胞の分離と培養

1. 新生児心筋細胞の分離手順は、NMRIマウスから得られ、前述の¹⁹のように行った。
2. 8ウェルガラスチャンバースライド内の種子分離細胞は、75,000細胞/ウェルの細胞密度でスライドし、新生児CM培養培地¹⁹で3日間培養する。

4. αアクチンネットワークの蛍光標識

注:最適な結果を得るには、細胞は8ウェルガラス底チャンバで培養されます。ラベル付けは、イメージングの1日前に実行する必要があります。

1. 37°Cでプリウォーム4%PFA。
2. 4%パラホルムアルデヒドを培養培地に直接添加してiPSC-CMを固定し(1:1希釈)、37°Cで15分間インキュベートします。固定のためのPFAの最終濃度は2%である。
3. 固定細胞を0.2%トリトン-Xにインキュベートし、PBSで希釈し、室温で5分間培養します。
4. 細胞をPBSで2回、それぞれ5分洗います。
5. 1%BSA溶液(PBSで希釈)を加え、室温で60分間インキュベートします。
6. 1%BSAで1:100 αアクチン抗体を希釈し、0.05%Triton-Xを含有して150μLの一次抗体溶液を調製する。細胞に加え、室温で60分間インキュベートします。
7. 細胞を0.2%BSA溶液で2回洗浄し、それぞれ5分ずつ洗浄します。
8. ヤギ抗マウスAlexa647抗体を1%BSAで1:100、0.05%Triton-Xを含む2次抗体溶液150 μLを調製します。細胞に加え、室温で40分間インキュベートします。
9. 細胞を0.2%BSA溶液で2回洗浄し、それぞれ5分ずつ洗浄します。
10. 細胞をPBSで2回、それぞれ5分洗います。PALMイメージングまで、標識された細胞を4°Cで暗闇の中に保管してください。

5. PALMイメージングバッファの調製

注: 各実験に対して、PALM イメージング バッファを新たに準備することが重要です。

1. 50gのグルコースを蒸留水50mLに溶解して50%グルコース溶液を調製する。
2. 50 mM Tris-HCl、10%のグルコース、10 mMの塩化ナトリウムを含む塩基性バッファーを準備します。
   1. 塩酸を使用してpHレベルを~8.0に調整します。
3. 0.6 mgのピラノースオキシダーゼを316 μLの塩基バッファーに溶解して、ピラノースオキシダーゼ溶液を調製します。
4. カタラーゼ溶液を500 μLの基本バッファーに溶解して調製します。10,000 x g で3分間、十分に混ぜ合わせ、遠心分離機を混ぜます。上清は、さらに使用するために保管してください。カタラーゼ溶液は、数日間4°Cで保つことができます。
5. 316 μLのピラノースオキシダーゼ溶液、25 μLのカタラーゼ溶液、50%グルコース溶液100μL、50μLのシステマーチン、5μLのシステマチラン、5μLのシクロオスタテトライン、3.5μLのβメルカプトエタノールを混合して、500 μLのPALMイメージングバッファーを調製します。ピラノースオキシダーゼとカタラーゼの最終的な触媒活性は、それぞれ7.5 U、35,000Uである必要があります。
   注:PALMイメージングバッファは、3〜5時間の最適なイメージング条件を提供します。蛍光色素の点滅能力が低下した場合は、新しい緩衝液アリコートを調製する。

6. PALM 画像の取得

1. 使用前に少なくとも3時間前に顕微鏡のスイッチを入れ、熱平衡を可能にするために、イメージングの前にサンプルを室温に持って来てください。顕微鏡にインキュベーションチャンバーが装備されている場合は、温度を30°Cに調整してください。
2. 適切な洗浄溶媒を使用して、チャンバースライドの目的と底部を洗浄します。
3. 300 μL の PALM イメージング バッファーをラベル付きセルの 1 つのウェルに加え、チャンバー スライドを顕微鏡のステージ ホルダに挿入します。
4. PALM 画像取得パラメータを設定します。
   1. 1.57 N.A. 100xの石油の目標を選択して取得します。
   2. PALM モードを選択し、TIRF 設定を有効にします。
   3. 取得するフレーム数を調整します。通常、5,000~10,000フレームで最適な結果を得ることができます。しかし、獲得したフレームの数は、蛍光色素の標識効率および点滅能力に強く依存し、使用者によって調整され得る。
   4. UV レーザーパワーを 0.1%、647 レーザーを 0.2% に設定します。
   5. ゲインレベルを50~100に設定します。
   6. レーザー照明をオンにして、ターゲットセルを選択します。ゲインレベルは、信号強度が低い場合(蛍光標識に依存して)増加させることができます。
   7. レーザー照明をオフにする
5. PALM画像取得
   1. ゲインを 0 に減らし、レーザーパワー(ex 647)を 100% に増やします。
   2. ターゲットセルを~5 sに漂白します。
   3. ゲインを50に増やし、PALM画像の取得を開始します。
      注:ゲインは十分な信号強度を得るために調整する必要がありますが、過飽和ピクセルは避けるべきです。信号強度が低下する場合は、ゲインレベルを上げます。
6. 必要に応じて、UVレーザーパワーを着実に増強(0.1%-10%)信号強度を高め、蛍光素の点滅を促進します。

7. PALMデータの再構築

1. イメージJソフトウェアを開き、PALMデータをインポートします。
2. 開く雷雨プラグインと "実行分析"
   1. [カメラの設定] メニューにピクセル サイズと EM ゲインを入力します。
      注:100xの目標と1.6倍の拡大レンズを使用する場合、100 nmピクセルサイズが適しています。ただし、ピクセルサイズは、PALMイメージングに使用される顕微鏡とカメラのハードウェア機能に依存するため、ユーザーはこのパラメータを慎重に確認して適応する必要があります。EM ゲイン値はメタデータから取得できます。
   2. 「ラン分析メニュー」では、パラメータを次のように設定します: B スプラインの順序: 3、B スプライン スケール: 2.0、ピーク強度しきい値: stf(Wave.F1)、フィッティング半径: 3、初期シグマ: 1.6、倍率: 5.0、更新頻度: 50、横シフト:"OK"ボタンをクリックして確認します。
3. 再構築されたPALM画像の後処理
   1. [プロットヒストグラム] メニューで 、 "Sigma" パラメータを選択します。
   2. [長方形] ツールを使用して、可能なアーティファクトを除外して ROI を選択し、ROI をフィルタに適用します。ROI 値は、フィルタ コマンド ボックスに表示されます。
   3. ROI 値に "と不確定性 <25" を追加します。可能なフィルターコマンドは次のようになります: "(シグマ > 48.6821 & シグマ < 1117.40) & 不確実性 <25"。選択したシグマ値を適用します。
   4. [重複を削除]メニューで、距離のしきい値を「10 nm」と入力して適用します。
   5. 「マージメニュー」で最大距離を「20」、最大分子あたりのフレーム数を「0」、最大オフフレームを「1」に設定します。設定を適用します。
   6. [ドリフト補正] メニューで相互相関を選択し、"ビン数" を "5" と "拡大" に設定して "5.0" にします。ドリフト補正設定を適用します。
   7. 最終的な PALM イメージを保存し、必要に応じてポスト処理データをエクスポートします。

サルコメアフィラメントの分析

1. サルコメア長さの分析
   1. イメージJソフトウェアを開き、再構築されたPALMイメージをインポートします。
   2. 選択したサルコメア構造の間にZディスクに垂直な線を引き、アクチニンフィラメント間の最短距離を測定します。
   3. [分析] メニューの [プロット プロファイル] を選択し、2 つのピーク間の長さを取得します。サルコメアの長さは1つの細胞内で変化する可能性があるため、ターゲットセルの異なる領域で最低20個のサルコメアを測定する必要があります。
2. Z-ディスク厚さの分析
   1. イメージJソフトウェアを開き、再構築されたPALMイメージをインポートします。
   2. 再構築された PALM イメージを 8 ビット モードのイメージに変換します。
   3. リッジ検出プラグインを開き、次のパラメータを入力します: 20、ハイコントラスト: 230、低コントラスト: 10、シグマ: 0.79、低いしきい値: 25.84、最小行長: 20.
   4. 「見積もり幅」「線を延長」「結果を表示」を設定します。
   5. [OK] をクリックし、結果表の [平均線幅] を使用して、さらに分析を行います。

結果

CMの構造成熟度を推定するために、新生児、完全に成熟した成人、およびiPSC CMは、最初に、サルコメアネットワークを視覚化するためにαアクチニン抗体でCMに標識した。PALMの取得後、画像を再構築し、個々のフィラメントの幅を自動検出するためのプラグインベースの画像処理ソフトウェアを用いてZディスク厚さを測定した。サルコメア長さは、隣接するフィラメントに対応する2つの隣接する強度ピーク間の距離を測定することによって算出した。 図1 は、iPSC由来CMにおけるサルコメア組織の評価を示す。

図2Aに示されるように、iPSC-CMおよび新生児細胞は、不規則で配置が不整れたサルコメア構造を有する同様のα−アクチニンパターンを示すことが判明した。同様に、定量的評価は、α-アクチニンフィラメントの長さと厚さがほぼ同じであることを示し、iPSC CMの早期発生状態を示す。より正確には、平均サルコメア長さは約1.83 μm(成人対iPSC CM対新生児CM:1.91±0.02 ...

ディスカッション

iPSC由来のCM in vitroの生成は、再生療法、疾患モデリング、薬物スクリーニングプラットフォームの開発にとって重要です。しかし、これらのCMの成熟度が不十分な心血管研究²⁰における大きな障害である。この点に関して、iPSC由来CMの構造成熟状態のモニタリングを可能にする高分解能イメージング技術が必要である。同時に、超分解能顕微鏡は、チチンおよびトロポニン^{10、21、22,21,22}に対して最近実証されるように、適切なサルコメア形成に必要な特定のタンパク質の機能を正確に分析するための貴重なツールとなり得る。

現在のプロトコルでは、αアクチニンサルコメアネットワークを解析することにより、iPSC CMの構造成熟を定量的に評価するPALMベースのアプローチを提示する。

従来の光顕微鏡と比較し...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ヒトiPS細胞株	宝	Y00325
µ-スライド 8 ウェル ガラス底	同上	80827
0.5ml エッペンドルフチューブ	エッペンドルフ	30121023
ウシ血清アルブミン	シグマ アルドリッチ	A906
心筋細胞解離キット	幹細胞技術	05025
カタラーゼ	シグマ アルドリッチ	C40-1G
シクロオクタテトラエン	シグマ アルドリッチ	138924-1G
システアミン	シグマ アルドリッチ	30070-10G
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 Ca2+ および Mg2+ なし	サーモフィッシャー	14190169
F(ab')2-ヤギ 抗マウス IgG アレクサ フルーア 647	サーモフィッシャー	A-21237
フィジー画像処理ソフト (Image J)
Glucose	Carl Roth	X997.2
Siloku Aldrich		H1758
LSM 780 ELYRA PS.1 system	Zeiss
Paraformaldehyde	Merck	8187150100
Pyranose oxidase	Sigma Aldrich	P4234-250UN
sarcomeric &α;-actinin antibody [EA-53]	Abcam	ab9465
Nadium	chloride Sigma Aldrich	S7653
滅菌水	Carl Roth	3255.1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Trizma base	Sigma Aldrich	T1503
β-メルカプトエタノール	Sigma Aldrich	63689