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方法論記事

X線位相コントラストイメージングのための活発に成熟するウシ関節軟骨外植片のin vitro調製

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DOI:

10.3791/61607

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2022年1月31日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm UA07, Rayonnement Synchrotron pour la Recherche Biomédicale (STROBE), 2Centre of Nanohealth, Swansea University Medical School, 3ISTerre, Université Grenoble Alpes, CS, Grenoble Cedex 9, 4Novitom, R&D Grenoble, 5ESRF, European Synchrotron Radiation Facility, CS, Grenoble Cedex 9

この記事について

サマリー

このプロトコルは、X線による高解像度のイメージングのための in vitro ウシ関節軟骨の調製について説明しています。これらの外植片は、出生後に積極的に成熟します。ここでは、生検から3D X線位相コントラストイメージングのデータ分析まで、外植片の培養、組織固定、シンクロトロン調製までに必要なステップについて説明します。

要約

関節軟骨の出生後の成熟を支えるメカニズムを理解することは、次世代の組織工学戦略を設計し、疾患または損傷した軟骨を修復する可能性を秘めているため、非常に重要です。一般に、関節軟骨の出生後の成熟は、生物の成長に対応するために組織のコラーゲン構造と機能が大幅に変化するものであり、数か月から数年の時間スケールで発生します。逆に、軟骨の構造組織の溶解も長い時間スケールで起こることが、組織変性の特徴です。これらの生物学的プロセスを詳細に研究する私たちの能力は、成長因子が未熟な関節軟骨の早熟な in vitro 成熟を誘発する可能性があるという発見によって強化されました。関節に起こる発生や疾患に関連する変化には骨や軟骨が関与しており、これらの組織を共イメージングする能力があれば、それらの絡み合った役割についての理解が大幅に深まるでしょう。

軟部組織、軟骨、骨の変化を同時に可視化することは、関節疾患のフォローアップに使用される従来の前臨床イメージングモダリティでは克服すべき課題となっています。3次元X線位相コントラストイメージング法(PCI)は、低密度物体のイメージングに高い性能を発揮し、従来のX線イメージングと比較して追加情報を提供できるため、20年間にわたって絶え間なく開発されてきました。

このプロトコルでは、軟骨の生検、 in vitro で成熟した軟骨の生成から、X線位相コントラストイメージングを使用して収集された画像のデータ分析まで、実験で使用される手順について詳しく説明します。

概要

未熟な関節軟骨は、成人の関節特異的機能を得るために、形態学的、構造的、および生体分子的変化1を開始するための適切な支持体である。主な変更点は、未熟軟骨の表面に対して平行な配向を示すコラーゲン線維から、成熟軟骨では組織の深部にある線維が垂直な線維への再編成です。成体軟骨の擬似層別化は、コラーゲン線維配向の方向に沿った常在軟骨細胞の再編成を通じて明らかであり、表面の細胞は円盤状で表面に平行で、より深いゾーンでは細胞が徐々に大きくなり、列に組織化されます。出生後の成熟は、何ヶ月にもわたって起こることが知られており、基本的に思春期の終わりに完了しますが、長い時間スケールは、この重要な発達移行を研究することを困難にするか、技術的に詳細に研究することを困難にすると考えられていました2。この問題の解決には、線維芽細胞成長因子-2とトランスフォーミング成長因子-β1が一緒になって、関節軟骨の成熟を再現する重要な生理学的および形態学的変化を誘発できることがわかったことなど、いくつかの進歩がありました2,3(図1)。成長因子によるin vitro成熟は3週間以内に起こり、生体力学的インプットは必要ありません。培養後、II型コラーゲンの発現は著しく減少し、成熟軟骨に見られるように、成熟した三価コラーゲンと未成熟二価コラーゲンの架橋の比率が増加します。また、細胞外マトリックスとコラーゲン線維の組織は、成熟した軟骨で見られる組織化に近くなっていますが、この移行の側面は完全ではありません。生化学的には、成長因子で処理された軟骨の組成は、成体の関節軟骨を模倣しています3。

この記事で使用されているモデルは、 in vitro 未熟な雄(生後7日齢)の牛去勢牛から中手指節関節内側顆の外側側面から無菌条件下で切除された直径4mmまたは6mmの外植片の培養。石灰化した軟骨と軟骨下骨の薄い層が、各外植片の基底面に保持されていました。関節軟骨は、インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)、10 mM HEPES緩衝液pH 7.4、アスコルビン酸、および50 μg/mLゲンタマイシンを添加した古典的な無血清培地であるダルベッコの修飾イーグルス培地(高グルコース4.5 g / L)で培養しました。この培地には、100 ng/mL の線維芽細胞増殖因子 2 (FGF-2) と 10 ng/mL のトランスフォーム成長因子 β1 (TGF-β1) が添加され、3 日ごとに培地交換で補充されます2.成長因子を組み合わせることにより、軟骨の成熟が高度に加速されます。これらの変更は 21 日以内に行われます。成長因子の刺激は、基底面からのアポトーシスと吸収、および表面軟骨細胞の細胞増殖をさらに誘導します3.培地の組成は、 テーブル 1.Khan et al. 2011 によって開発されたモデルに従う2、関節軟骨外植片を10 ng/μLの濃度でTGF-β1および100 ng/μLの濃度でFGF2で培養します(ストック濃度10 μg/mLおよび100 μg/mLをリン酸緩衝生理食塩水/0.1%BSAに溶解)。培地1 mLあたり、各成長因子1 μLを使用します。L-グルタミンと高グルコースを含むDMEM-F12は、インスリン、トランスフェリン、セレン(ITS)、アスコルビン酸、ゲンタマイシン、HEPESを添加すると、さまざまな細胞株や外植片の培養物に特有の生理学的成長要件をすべて備えた完全な培地の補給を提供する人工培地です。DMEM-F12は、いくつかの多様な無機塩(すなわち、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、NaH2発注書4)、ブドウ糖、アミノ酸(窒素源)、ビタミン、補因子、水。これらの塩は、細胞の生存と培養の正常な成長を維持するための十分なエネルギー投入を提供します。ミネラルイオンは、自然の生理学的環境に近い浸透圧の維持に貢献します。高濃度のグルコース(4.5 g / L)は、主に解糖系を通じて軟骨細胞が呼吸するために使用されます。F12培地のサプリメントは、硫酸塩CuSOの供給源が多数あるため、使用されます4、FeSOの4、ZnSO樹脂4 およびMgSO4 硫酸化グリコサミノグリカンの合成に必要です。色付きのインジケーター(ここではフェノールレッド)とCOで確認したとおり2/HCOの-3 緩衝液をリン酸塩と組み合わせることで、pHは7.4に近い値で一定に保たれます。軟骨細胞が使用する主要な呼吸経路は解糖系であり、乳酸は最終生成物であり、pHの上昇を引き起こすため、局所的に生成された乳酸を除去するのに役立つ生体力学的力がない場合、HEPESは生理学的プロセスのための緩衝環境を維持するように作用します。ゲンタマイシンは、アミノグリコシド系抗生物質で、増殖を阻害することで外部の細菌汚染を抑制します。アスコルビン酸は、その抗酸化作用の培地補完として使用されます4.アスコルビン酸は、コラーゲン中のプロリン残基をヒドロキシル化してその三重らせん構造を安定化させる酵素、プロリルヒドロキシラーゼの補因子です。トランスフェリンは通常、細胞外抗酸化物質(毒性およびROSの減少)として機能します5,6.また、細胞培養における細胞外鉄の貯蔵と輸送を提供および促進する能力があるため、培地に添加されます。トランスフェリンは生理学的条件下で鉄に非常に強く結合するため、フリーラジカルの生成を触媒する遊離鉄はほとんど存在しません7.その結合した受容体からのインスリンホルモンシグナル伝達は、グルコース、アミノ酸などのいくつかの要素の吸収を増加させます。また、細胞内輸送、脂肪生成、タンパク質、核酸合成などのいくつかのプロセスにも関与しています。インスリンには成長促進作用があります。セレンは、複合溶液「インスリン - トランスフェリン - セレン」に、亜セレン酸ナトリウムとして追加的に存在する。これは主に、グルタチオンペルオキシダーゼ(GPX)などの(セレノ-)タンパク質の補因子として、培養物の補助抗酸化剤として使用されます。で in vitro 関節軟骨細胞であるITSは、細胞の脱分化と肥大分化に関連する遺伝子発現を阻害することにより、細胞増殖と表現型の保存を促進するようです8.線維芽細胞成長因子-2や形質転換成長因子-β1などの成長因子を培地に添加します。それらは、細胞の分化、成長、治癒、および発生を誘導および調節するために使用されます2,3.FGF-2とTGF-β1を組み合わせると、培養細胞や組織での細胞増殖も強力に促進されます9.

この関節軟骨のin vitro成熟モデルは、主に3つの理由で有用です。第一に、このモデルでは発生相転移が加速されているため、成熟中のlysl oxidase-L1の発現上昇など、in vivoモデルで何ヶ月にもわたって発生する知覚できない変化を研究することができます10。第二に、関節軟骨の組織工学は、等方性の形態と構造を持つ軟骨が生成されるという事実に苦しんでいますが、これは、局所的な欠陥を修復するために関節に移植すると機能的に欠損します。成熟した変化を誘発する方法を理解することで、完全に機能する埋め込み型デバイスの開発が加速します。第三に、この研究に関連するのは、小児期に発生するカシンベック病などの変性関節疾患があり、成人期に重度の関節変形を引き起こします。この特定の病気は、セレンとヨウ素の風土病的な欠乏症が数千万人の住民に影響を与える可能性のある地理的領域(中国)と強く関連しています11,12,13。Kashin-Beck病の骨格欠損の検討は、それが思春期頃に発生することを示しており、骨格成熟過程の摂動が関係している。したがって、関節軟骨(AC)におけるセレンの役割をさらに理解するには、軟骨の成長と発達のための堅牢なモデルが必要です。in vitro成長因子による成熟モデルは、セレンイオンの存在下または非存在下での成熟中の関節軟骨の成長および代謝に関する研究のための有用な出発点を提供する14,15,16。セレン(Se)欠乏症が複雑で相互に関連する生物学的プロセスに及ぼす影響に関する私たちの知識は、依然として非常に乏しいままです。主な問題は、セレンがその制限的な作用範囲(40〜400μg / kg17の必要な濃度)と非常に低い濃度のために研究対象の元素であり続けるという事実にあります。未熟なウシ軟骨を用いた成熟加速モデルは、発生の重要な段階で起こる生物学的変化を観察する前例のない能力を提供します。生物中のSe-concentrationは厳密に制御されており、このモデルは、成熟中の正確な追跡を可能にするイメージング技術を開発するための出発点です。これらの技術は、AC劣化を防ぐための戦略を研究するための強力なツールとなり、新しい再生医療ベースの治療法の基礎を開発する可能性があります。

軟部組織、軟骨、骨の変化を同時に視覚化することは、従来の前臨床イメージングモダリティにおける大きな課題です。これは確かに関節疾患のフォローアップ18,19にとって重要な助けとなるでしょう。一例として、従来のX線マイクロコンピュータ断層撮影法(μCT)は、軟部組織に対して性能が劣り、骨欠損、骨棘の描写、軟骨の間接的な可視化に限定されていました。一方、磁気共鳴画像法(MRI)は、疾患の初期段階で骨の変化(微小石灰化など)を正確にレンダリングする能力が低いにもかかわらず、従来、軟部組織イメージングに採用されています。骨や軟骨に敏感になり、軟骨、軟骨細胞の構成細胞を区別する能力は非常に重要です。位相差イメージング(PCI)は、材料のX線屈折率が軽元素の吸収指数の1000倍になる可能性があるという特性に依存しています。これにより、ソール吸収に基づく従来の方法と比較して、軟組織のコントラストが高くなります。したがって、PCIは、高吸収組織(例えば、骨)と低吸収組織(例えば、線維性軟骨、靭帯、腱、半月板および関連する軟組織(滑膜および筋肉))の両方を同時に表現する関節を構成するすべての組織を画像化することができる)18,19,20,21。

参考文献20で実証されているように、X線PCIは軟骨の他の前臨床イメージングモダリティよりも優れています。このプロトコルの目的は、手順を詳しく説明し、いくつかの代表的な結果を示すことです。成長因子が未熟な軟骨外植片に及ぼす影響のスキームを 図1に示します。

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プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、スウォンジー大学の倫理研究委員会によって承認されており、生検材料は英国の環境・食糧・農村地域省(DEFRA)からライセンスを受けて取得されました。このプロトコルは、当施設の動物管理ガイドラインに従っています。

1.外植片の文化

  1. ウシの脚の頭皮からの外植片の調製
    1. 吸収性プロテクターとメス、#10メスブレードを備えた標準的な外科用メスを準備します。
    2. すべての材料に70%エタノール溶液をスプレーします。
    3. 牛の脚(獣医の承認を得て屠殺場から入手した生後7日齢の雄牛の去勢牛)を水に浸して、すべての血液と泥を取り除きます。
    4. 石鹸で脚をきれいにし、ブラシでこすります。
    5. 十分にきれいになったら、脚に70%エタノールをスプレーします。
    6. 吸収紙の上に置きます。
    7. メスで足の周りを切ります。
    8. 脚の長さに沿って繊細な線をなぞります。
    9. 関節ゾーンには特に注意してください。
    10. 縦方向のメスのラインに沿って脚の皮膚を慎重に取り除きます。
    11. 廃棄物(皮膚、使用済みティッシュ、紙、手袋)を臨床廃棄物袋に入れます。
    12. 石鹸で脚を洗浄/ブラッシングし、皮膚を剥がしたら再度エタノールで滅菌します。
    13. 関節腔に近い領域を傷つけないでください。空洞が開いたり、血液浸潤で損傷したりすると、無菌状態ではなくなり、脚を使用できなくなります。
    14. 70%エタノールを噴霧したアルミホイルに脚を置きます。
    15. 適切なサイズのラテックス手袋を脚の端にかぶせて、近位端からの血液の排出や蹄からの汚染を防ぎます。
    16. 廃棄物は、制度上のルールに従って適切な方法で処理します。
  2. 外植片の抽出と培養
    注意: 外植片は、ジョイントの内部部分(図 2、2つの最初のステージ)。同等の条件であるためには、ほぼ同じ形状と特性を持つサンプルに4つ(または6つ)の異なる処理を適用するために、同じゾーンから4つ(または6つ)の外植片を打ち抜く必要があります。
    1. 使用の25分前に層流フードを開け、アルコール70%で洗浄します。
    2. 培地を温めるために水浴に入れます。
    3. 各ウェルに1.5 mLの塩基性培地、DMEM-F12のみ(洗浄培地)を入れた24ウェルプレートを調製します。
    4. 1.5 mLの完全培地で別のウェルプレートを調製します。使用時まで37°Cの培養インキュベーターで保存してください
    5. 70%エタノール入りのユニバーサルチューブと洗浄剤入りのユニバーサルチューブ1本というラックに材料を準備します。
    6. メスと4mmまたは6mmの生検パンチ(アルコールユニバーサルチューブに入れる)を準備します。
    7. チューブと材料をボンネットの下に置きます。
    8. ボンネットの下に70%エタノールを噴霧した吸収性プロテクターを置きます。
    9. 70%エタノールを噴霧したティッシュを準備します。
    10. 解剖プレートを取り、アルミホイルで覆います。
    11. 事前に準備した同じものを冷蔵庫(4°C)から取り出し、70%エタノールをスプレーします。
    12. 危険なバッグや臨床用バッグをボンネットの近くに捨てて、後で廃棄物をオートクレーブします。
    13. 足に70%エタノールをスプレーします。
    14. ジョイントを動かして、切開を行う必要があるジョイントの正中線を見つけます。これは内部で行います。
    15. 滅菌メスを取ります。
    16. ジョイントエッジの輪郭に沿って正中線に沿って慎重にカットします。中手指節関節内側顆軟骨には触れないでください。
    17. 関節が開いたら靭帯を慎重に切断します。
    18. 足の下部をオートクレーブバッグに捨てます。
    19. 関節のすべての軟骨を露出させるために、他のすべての組織を取り除きます(図2)。
      注意: 足で何かに触れないように注意してください。
    20. メスと生検パンチをアルコールに入れ、次に洗浄媒体に入れます。
    21. このパンチでいくつかの円(面ごとに4〜5)を作成し、骨の内部面に沿って力を入れます。
    22. 終わったらバイオパンチをアルコールに入れてお手入れします。
    23. メスを取り、各円の間と骨の中心線に沿って切り取ります(線をなぞります)。
    24. 軟骨外植片を取り出すには、円生検の境界の1つを垂直に切り取り、次に軟骨下骨を非常に慎重に水平に切ります。
    25. 軟骨下骨と石灰化した軟骨に沿ってパンチラインより下に水平に切られた軟骨外植片を取り除くために、外植片が飛び出します。
      注:外植片は、可能であれば均一な厚さにする必要があります。
    26. 1.5 mLの洗浄培地で満たされたウェルプレートに外植片を置きます。
      注:関節の同じ場所から来る外植片の実験的制御と処理を常に行ってください。
    27. 外植片が正しく向き合っていることを確認してください。外植片の表面は上を向き、外植片の軟骨下骨部分はウェルプレートの底を向いている必要があります。
    28. 各生検の間、ウェルプレートを閉じたままにしておきます。
    29. 洗浄液を取り出します。
    30. ウォッシュメディウムで再度洗ってください。洗浄液に2〜3時間放置します。骨の残留物、血液は培地で流動する時間があります。
    31. 完全な培地を含む新しいウェルプレートに外植片を移します。ピペットで何かに触れないように注意してください。
    32. 外植片がまだ正しい位置にあること(骨がウェルプレートの底部に面している)を確認します。
    33. すべてをきれいにし、臨床廃棄物は適切な場所に捨ててください。
    34. 外植片を5%CO2のインキュベーターで37°Cの培養器に入れたら、細胞/組織の多様なニーズを維持するために、外植片の培養培地を温かい新鮮な培地で2日ごとに交換します。外植片がまだ正しい位置にあること(骨がウェルプレートの底部に面している)を確認します。
  3. サンプルの固定(オプション)
    注:この手順は、細胞培養の終了時、つまり3週間の培養後にのみ実行してください。その後、外植片は成熟した段階に達しました。
    1. DMEM-F12で外植片を組織培養フードの下のピペットで洗浄します。
    2. 組織培養フードの下のピペットで外植片をPBSで2回洗浄します。
    3. 10% NBFS(中性緩衝ホルマリン生理食塩水)に浸して、4°Cで一晩固定します。
    4. 固定された外植片をPBSのマイクロ遠心チューブに入れます
    5. 外植片は4°Cで保存します。 固定外植片は、これらの条件で最大6か月滞在できます。

2. イメージングセッションのためのサンプル調製

  1. サンプルとカメラの視野に対して適切なサイズ(通常は1 mLのチップ)の円錐形のプラスチックチップを使用します。
  2. コーンの先端を密封(炎で加熱)して、防水性のあるサンプル容器にします。
  3. 先端にPBSを充填します。サンプルをピンセットで保持し、チューブに挿入します。ゆっくりと振って気泡を取り除きます。
  4. チューブをトモグラフィーステージに取り付け、簡単なX線写真を撮って位置を合わせます。

3. X線位相コントラストイメージングセッション

  1. 検出器をサンプルから2.5mの位置に置きます
  2. X線光子エネルギーを、ブラッグ・ブラッグ幾何学内の二重シリコン結晶システムを使用して17 keVに設定します。
  3. マウントイメージング検出器は、光学系上の科学用CMOSカメラ22 で構成され、3D画像では3.5μmの等方性ボクセルサイズが得られました。
  4. 厚さ60μmのガドリニウムオキシスルフィドシンチレータスクリーンを使用して、X線を可視光に変換します
  5. データ収集:サンプルの360°スキャン中に2000回の投影を取得し、各投影で2秒の露光時間を確保します。
  6. 位相検索アルゴリズムを使用して、ref.23で説明されているように位相信号を抽出します。このアルゴリズムは、サンプル内の複素屈折率分布に関する先験的な知識を使用します。ここでは検証されていない主な仮説は、再構築すべき材料が1つあるというものである。この特定のケースでは、屈折と吸収指数の比を1,200に設定し、骨と軟骨の視覚化に最適な妥協点を実験的に観察しました。
  7. PyHST2 コード24 のオープンソースのグラフィックス プロセッシング ユニット (GPU) ベースの実装を使用して、標準のフィルター付きバック プロジェクション CT 再構成アルゴリズムを使用します。

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結果

図3にスケッチしたように、単純な伝搬ベースのイメージングセットアップ25を使用しました。シンクロトロン伝搬ベースのイメージングでは、コヒーレントなX線ビームが物体を照らし、空間的に変化する位相シフト19を生じさせる。X線ビームがサンプルの後を伝搬すると、歪んだ波面が特性パターンを生成します。これらの特性パターンを専用のアルゴリズム23で解析することにより、サンプルによって引き起こされた位相シフトが数値的に取得される。

説明した方法論を用いた代表的な位相コントラストイメージングスライスを 図4 と 図5に示します。

3週間の培養後、前述したように外植片を固定した。固定後、外植片は4°Cで最大6ヶ月間保持できます...

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ディスカッション

私たちは、in vitroの急速に成熟する関節軟骨の研究のために、データ取得プロトコルを含む、サンプル調製から画像の視覚化までの完全な研究を発表しました。シンクロトロンイメージングセッションの結果、モデルの良さが示されました。

ここで示すモデルでは、いくつかの観測値と制限について言及する必要があります。この「加速成熟」は、培養後21日以内に起こります。培養期間が長いと、細胞代謝と軟骨ECM成分(すなわち、コラーゲンとプロテオグリカン)の内容物の変化に伴って、外植片プラグは分解し始めます(参考文献27)。それでも、私たちのモデルでは、21日の制限内で、組織は安定したままです2,3。モデルの複雑なリモデリングダイナミクスを評価できます。成熟した軟骨は、生化学的および生体力学的特性に関して成体の軟骨を模倣していますが、提示されたモデルは、成...

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謝辞

著者は、ESRFが社内ビームタイムを提供してくれたことに感謝しています。著者は、科学的な議論をしてくれたEric Zieglerに感謝します。記載されているPCI実験は、フランス・グルノーブルにある欧州シンクロトロン放射線施設(ESRF)のビームラインBM05で行われました。CBは、この研究の一部に資金を提供してくれたExplora'docオーヴェルニュローヌアルプと、スウォンジー大学とグルノーブルアルプ大学の奨学金に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Material:生物学的製品
DMEM/F-12(1:1)(1X)+ GlutaMAX DulbeccoのModified Eagle Medium F-12 Nutriment Mixture(ハム)500mLGibco by life technologies31331-028
Gentamicin試薬溶液、50 mg / mLGibco by life technologies15750-060
HEPES、特殊調製、1M、pH 7.5 ろ過済みSigmaH-3375
ITS, Insulin-Transferrin-SeleniumGibco by life technologies51500-057
L-アスコルビン酸-2-リン酸, sesquimagnesium salf hydrate, 95%SigmaA8960-5G
中性緩衝ホルマリン (NBF)Sigma AldrichHT501128
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) pH 7.4Gibco by life technologies10010023
<ストロング>カルチャー機器:
アブソレントプロテクター、ベンチコートワットマンTM猫番号2300731、ポリステレンバック、460cm * 50m
アキュレートVWR
オートクレーブ可能廃棄バッグ汚染されたプラスチック実験器具の処分のために、蒸気、有害廃棄物、STERILIN(白い袋)生検パンチMILTEXの浸透を可能にするために開いたままにしておく必要があります
KAI参照33-364&6ミリメートル直径
代替治療のための臨床廃棄物 中型デューティ(UN承認重量5kg、閉鎖解除方法、UN-SH4/Y5/S/II/GB/4/06(オレンジ袋)
エッペンドルフチューブ0.5mLおよび1.5mL
ファルコンチューブ15mLおよび50mL
、検出可能なRNase、DNase、DNA&パイロジェン1000ul斜め目盛り、フィルターチップStarlab、TipOne(滅菌)S1122-1830
可能なRNase、DNase、DNA&のフリー発熱性物質20µl斜めの目盛り、フィルターチップStarlab、TipOne(滅菌)S1120-1810
可能なRNase、DNase、DNA&のフリーパイロジェン200ul斜め目盛り、フィルターチップStarlab、TipOne(滅菌)S1110-1810
キュベーターー37°C;C、5%CO2
光学顕微鏡
ピペットボーイ25mL、10mL、5mL 滅菌プラスチックピペット
ピペット (25-10-5 ml)CellStar、Greiner Bio-one
プラスチックピンセットオックスフォードインストゥルメントAGT 5230
メス
のヒントP1000、P200、P10、P10、P10、P10チップ(滅菌)
組織培養フード
ポンプ
ウォーターバス37°C
ウェルプレート12&24ウェルプレート
<ストロング>保護装置:シールド
グローブ
>白衣
安全ゴーグル
データ収集装置:
フィジーソフトウェアオープンソースソフトウェア
PyHST再構築ツールキットオープンソースソフトウェア
のは検出検出インインキュベータで加湿雰囲気 真空

参考文献

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