このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別または免疫磁気ビーズ分離により、マウス腹腔内白色脂肪組織(WAT)デポから脂肪形成および線維炎症性間質細胞亜集団を単離するための技術的アプローチを説明しています。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
白色脂肪組織(WAT)の間質血管画分(SVF)は、非常に不均一であり、成人期のWATの拡張とリモデリングに機能的に寄与する多数の細胞タイプで構成されています。この細胞の不均一性の影響を研究する上での大きな障壁は、in vitroおよびin vivo分析のためにWAT SVFから機能的に異なる細胞亜集団を容易に分離できないことです。シングルセルシーケンシング技術は最近、成体マウスの腹腔内WATデポにおいて、機能的に異なる線維炎症性および脂肪形成性PDGFRβ+血管周囲細胞亜集団を同定しました。線維炎症性前駆細胞(「FIP」と呼ばれる)は、炎症誘発性の表現型を発揮できる非脂肪原性コラーゲン産生細胞です。PDGFRβ+脂肪細胞前駆細胞(APC)は、細胞移植時にin vitroおよびin vivoの両方で高い脂肪形成を示します。ここでは、マウスの腹腔内WATデポからこれらの間質細胞亜集団を単離するための複数の方法について説明します。FIPおよびAPCは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)またはビオチン化抗体ベースの免疫磁気ビーズ技術を利用することにより、単離できます。単離された細胞は、分子解析や機能解析に利用することができます。間質細胞亜集団の機能特性を単独で研究することで、細胞レベルでの生理学的または病理学的条件下での脂肪組織リモデリングに関する現在の知識が広がります。
概要
白色脂肪組織(WAT)は、哺乳類のエネルギー貯蔵の主要な部位を表しています。この組織内では、脂肪細胞、または「脂肪細胞」が過剰なカロリーをトリグリセリドの形で貯蔵し、大きな単房性脂肪滴にパッケージ化されています。さらに、脂肪細胞は、エネルギー恒常性の様々な側面を調節する多数の因子を分泌する1,2,3。脂肪細胞はWATボリュームの大部分を占めています。ただし、脂肪細胞はWAT 4,5に見られる全細胞の50%未満しか占めていません。WATの非脂肪細胞コンパートメント、または間質血管画分(SVF)は、非常に不均一であり、血管内皮細胞、組織常在免疫細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞前駆細胞(APC)集団が含まれています。
WATは、エネルギー貯蔵の需要の増加に伴ってサイズを拡大するという驚くべき能力において、非常に優れています。WATでの脂質の適切な保存は、非脂肪組織への有害な異所性脂質沈着から保護するため、この組織の可塑性を維持することが不可欠です6。カロリー過剰に反応して個々のWATデポがこの拡大を経験する方法は、肥満の状況におけるイ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
すべての動物のプロトコルと手順は、テキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターの施設用動物使用およびケア委員会によって承認されています。
1. 性腺白脂肪組織からの間質血管画分(SVF)の単離
- 6〜8週齢のマウスの性腺白脂肪組織を解剖し、脂肪パッドを1x PBS溶液に入れます。
- 最大4つの脂肪デポ(1〜2匹のマウスから2〜4のデポを推奨)を組み合わせ、200 μLの消化バッファー(1x HBSS、1.5% BSAおよび1 mg/mLコラゲナーゼD)を含む10 mLビーカーで組織をミンチにします。
- ミンチ組織を10 mL消化バッファーが入った50 mLの遠心チューブに移します。
- 混合物を37°Cの水浴中で1時間、振とうしながらインキュベートします。
- 100 μmのセルストレーナーで消化した組織をろ過し、未消化の組織を除去します。
- ろ過したサンプルを 2% FBS を含む PBS で 30 mL に希釈し、600 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。 成熟脂肪細胞を含む上清を吸引します。
- すぐに優先細胞単離法に進んでください。
2. FACSを用いたAPCとFIPの分離
- チューブを穏やかに振って、ペレットを1x RBC溶解....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
このプロトコルは、成体マウスの腹腔内WATデポから異なる間質細胞集団の単離を可能にする2つの戦略を説明しています。APCおよびFIPは、FACS(図1)またはビオチン化抗体による免疫磁気ビーズ分離(図2)によって単離できます。どちらのアプローチも、すべて市販の試薬と抗体を利用します。免疫磁気ビーズの分離は、gWAT SVFからの脂肪形成細胞と非脂肪形成細胞の分離につながります。フローサイトメトリー解析では、脂肪形成画分内の細胞の75%がLY6C-CD9-APCsを表していることが示されました。非脂肪生成画分の>75%がFIP(LY6C+細胞)を表していました。
.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
マウスのC57BL/6系統は、食事誘発性肥満の研究で最も使用されているマウス系統です。C57BL/6マウスは、高脂肪食(HFD)を摂取すると急速に体重が増加し、肥満に関連するメタボリックシンドロームの顕著な特徴(インスリン抵抗性や高脂血症など)を発現します。特に、高脂肪食(HFD)の摂食に関連して起こるWATの拡大は、デポ特異的な方法で起こる19,20,21,22,23。皮下鼠径部WATデポー(iWAT)の拡張は、ほぼ独占的に脂肪細胞肥大によって起こりますが、性腺WATの拡張(gWAT)は、脂肪細胞肥大と過形成の両方を通じて起こります。肥満マウスのgWATデポも、代謝性炎症の顕著な部位です。したがって、食事誘発性肥満マウスのgWATデポは、肥満に関連する脂肪組織リモデリングの複数の特徴を研究するためのモデルを表して.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
T.A.P.は、ノボ ノルディスクA/Sの従業員であり、株主です
謝辞
著者は、優れた技術支援を提供してくれたLisa HansenとKirsten Vestergaard、そして原稿の批判的な読み方をしてくれたP. Scherer、N. Joffin、C. Creweに感謝しています。著者らは、ここで説明するプロトコルの開発における優れたガイダンスと支援を提供してくれたUTSW Flow Cytometry Coreに感謝します。R.K.G. は、NIH NIDDK R01 DK104789、NIDDK RC2 DK118620、および NIDDK R01 DK119163 でサポートされています。J.P.は、Innovation Fund Denmarkから博士課程前賞を受賞しています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 機械的組織調製およびSVF分離 | |||
| 40および100 µm セルストレーナー | Fisher Scientific | 352340/352360 | |
| 1X リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Fisher Scientific | 21040CV | |
| 5ml ポリプロピレンチューブ | Fisher Scientific | 352053 | |
| Digestion Buffer (for 10mL) | |||
| 10 ml HBSS | Sigma | H8264 | |
| 10 mg コラゲナーゼ D (1 mg/ml 最終 cc.) | ロシュ | 11088882001 | |
| 0.15 g BSA(1.5 % final cc.) | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| APCs and non-APCsの免疫磁気分離 | |||
| 5X MojoSortバッファー(MSバッファー) | BioLegend | 480017 | |
| 5 ml MojoSortマグネット(MSマグネット) | BioLegend | 480019 | |
| 100 µL MojoSort ストレプトアビジンナノビーズ | BioLegend | 480015 | |
| Purity Check and FACS | |||
| 10X Red Blood Cell Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Fc block (Mouse CD16/CD32) | eBioscience | 553141 | |
| Antibodies | |||
| ビオチン CD45 | BioLegend | 103103 | 濃度: ≤ 0.25 & μ;10^6細胞あたりのg 種:マウス クローン:30-F11 |
| オチンCD31 | レジェンド | 102503 | 濃度:≤ 0.25 µ10^6細胞あたりのg 種:マウス クローン:MEC13.3 |
| オチンCD9 | レジェンド | 124803 | 濃度:≤ 0.25 µg 10^6細胞あたり 種:マウス クローン:MZ3 |
| ビオチン LY6C | BioLegend | 128003 | 濃度: ≤ 0.25 µ10 ^ 6細胞あたりのg 種:マウス、 クローン:HK1.4 |
| CD31-PerCP / Cy5.5 | BioLegend | 102419 | 、濃度:希釈、1:400 、種:マウス クローン:390 |
| CD45-PerCP / Cy5.5 | BioLegend | 103131 | 、濃度:希釈、1:400 種:マウス クローン:30-F11 |
| CD140b PDGFRβ-PE | BioLegend | 136006 | 濃度:希釈1:50 種:マウス クローン:APB5 |
| LY6C-APC | BioLegend | 128016 | 濃度:希釈1:400 種:マウス クローン:HK1.4 |
| CD9-FITC | BioLegend | 124808 | 濃度:希釈 1:400 種:マウス クローン:MZ3 |
| 細胞培養およびDifferentiation | |||
| Gonadal APC 培養培地 (500mL用) | |||
| 288 mL DMEM with 1 g/L glucose | Corning | 10-014-CV | |
| 192 mL MCDB201 Σ | M6770 | ||
| 10 mL Σ Fetal Bovine Serum (FBS)** lot#14E024 | Sigma | 12303C | |
| 5 mL 100% ITS premix | BD Bioscience | 354352 | |
| 5 mL 10 mM L-アスコルビン酸-2-2リン酸 | Sigma | A8960-5G | |
| 50 & micro;L 100 g/ml FGF-ベーシック | R&D systems | 3139-FB-025/CF | |
| 5 mL ペン/溶連菌 | Corning | 30-001-CI | |
| 500 µL Gentamycin | Gibco | 15750-060 | |
| **注:一次APCの脂肪形成能力は、商用FBSのロットごとに異なる場合があります。FBSの複数のロット/ソースをテストする必要があります。 |
参考文献
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Funcke, J. B., Scherer, P. E.....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
タグ
