この方法は、ラット内側胃腸筋の3種類の運動単位におけるけいれんおよびテタニック収縮および作用電位の力の記録を可能にする。単一のモーターユニットの機能的な分離は、軸索の電気刺激によって誘導される。
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方法論記事
ラット内側胃腸筋単一運動ユニットの機能的分離
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
この研究は、実験ラットにおける後肢筋(心胃頭筋、ソレウス、足底筋など)における運動ユニットの特性を決定するための標準的な電気生理学的方法である運動単位(MUs)の機能的分離を概説する。この方法の重要な要素は、腹側根から分離されたモーター軸索に送達される電気刺激の適用である。刺激は、一定または可変的なパルス間間隔で送達され得る。この方法は、成熟期の様々な段階(若い、大人または老人)での動物の実験に適しています。さらに、このプロトコルは、介入の大きなスペクトルによって誘発される運動単位の変動性および可塑性を研究する実験で使用することができる。これらの実験の結果は、両方の筋肉生理学の基本的な知識を増強し、実用的なアプリケーションに翻訳することができます。この手順は、MUsの記録および刺激のための外科的製剤に焦点を当て、結果の調製安定性および再現性を達成するために必要なステップに重点を置いた。
概要
運動単位(M)は骨格筋の最小機能単位です。したがって、その機能、可塑性および収縮特性、ならびにそれらの力調節のメカニズムを理解することは、筋肉生理学の進歩にとって極めて重要である。MUsの基本的な収縮特性とその生理学的タイプの割合は、実験動物の主に後肢の筋肉である多数の筋肉について文書化されている。しかし、MU特性の可塑性とMU力調節のメカニズムの両方はまだ完全には理解されていない。
記載された方法の原理は、腰椎骨で調査されたものとラミネクトミーを除く後肢筋の広範な脱毛であり、それぞれが単一の「機能的」運動軸索を含み、それぞれを有する単一の「機能的」運動軸索を、MUの力および作用電位を記録するために電気的に刺激される。本論文に記載された技術を用いて、実験に成功した中胃腸筋のMUsの半分以上を単離することが可能である。ラットの内側胃腸は、平均52個のM(女性)または57個のMUs(オス)の3つの生理学的タイプで構成される:S(遅い)、FR(速抵抗性)およびFF(速い脂肪性)1、2、および可変収縮特性を有する3。制御群と実験群におけるMUsの平均値を比較する実験では、これらのグループごとに10~30個のMUsの分離と記録が必要です。重要なことに、個々のMUsは、1時間を超える期間の刺激のためにアクセス可能である可能性があります。また、この手法は、MU力と作用電位の両方を記録することができるため、力の生成に関連する現象の研究、疲労の影響評価、および力と作用電位の関係の観察に適しています。
これまでの研究では、MU収縮特性はプラスチックであり、多数の介入によって変調される可能性があることを確認している。ここで説明する技術を用いた実験は、ラットの内側胃腸4またはラット5、6の他の後肢筋、ならびに猫の筋肉7に対して、同様の単一MU単離法を用いて行われている。可変パルス間隔で送達される刺激の系列を用いた別の一連の実験は、モータ制御プロセスに関する観察を提供し、一般的に刺激の歴史に注意を向ける結果は、一つの刺激の時間スケールの変化のかなりの効果を含む、力の生産8、9にとって重要である。
また、別の方法を用いて研究してもよい。第一に、1つの方法は、モトニューロンの直接刺激である。バークは、これらのニューロン1,10の電気生理学的特性を決定するために並行して使用されるガラス微小電極を用いた猫の内側胃腸およびソレウスにおけるモトニューロンの細胞内刺激を用いた。他の方法は、かなり低い介入を必要とするヒト筋肉のMUsを研究するために提案されている。これらの方法の全てについて、刺激および記録電極は筋肉または神経に挿入され、力は指または足から記録される。これらの方法の最初は、最初の背部間筋の中での修行に使用されました。この筋肉に対しては、低力で収縮し、針電極を筋肉に挿入して記録した筋電図において、1つの活動運動部のみの作用電位が同定された。その後、平行に記録された筋肉力の断片を、各作用電位に従って平均化した(スパイク誘発平均)。この方法は、筋力記録11から1つの運動ユニットの力の抽出を可能にする。しかし、この手順の方法論的弱点は、単一のけいれん力はなく、むしろテタニック収縮の断片が平均化されたということです。ヒトのMUsはまた、筋肉12に挿入された電極を用いて筋肉内電気微小刺激の第2の方法を用いて研究され得るが、これは軸索木の断片を刺激し、単一の運動ユニットの活性化につながる。第3の方法は、電極を神経に挿入した微小刺激である。電極が神経中の1つの運動軸索だけを作動させると、1つの運動単位だけが13を収縮させる。これらの最後の方法には、記録の安定性と品質、倫理的な制限、実験材料へのアクセスなど、いくつかの制限があります。このプロトコルは、70年代と80年代の14の猫で広く使用されています。
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プロトコル
すべての手続きは、地元の倫理委員会によって承認され、動物のケアに関する欧州連合のガイドラインと動物の保護に関する国内法に従う必要があります。
注:この手順に関与する各実験者は、基本的な外科的処置の訓練を受け、動物実験を行うための有効なライセンスを取得する必要があります。
1. 麻酔
- ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射でラットを麻酔する (初期用量は 60 mg·kg-1)。
- 約5分後、ラットの耳または前肢を鈍い鉗子でつまんで麻酔の深さを確認します。反射アクションが見られない場合にのみ、プロトコルの次のステップに進みます。
- 手術中、動物が動きのピンチに反応する場合は、10〜15分ごとに動物の反射作用をチェックし、麻酔を補います(通常、10 mg·kg-1·h-1 -1ペントバルビタールナトリウム、IP)。
2. 手術
- かかとから股関節(第1のセグメント、筋肉および神経の孤立)、かかとから股関節への右後肢(第2セグメント、地上電極)、尾から胸部セグメント(第3セグメント、ラミネ切除)に向けて毛皮を剃って、動物を外科的処置に備える。実験の急性の性質のために、消毒剤は必要ありません。
- ラットを腹部に加熱パッド(37 °C±1 °C)に置きます。
- ラミネ切れ
- 鋭い鈍いはさみを使用して、脊柱に沿って胸柱に沿って胸部の椎骨まで切断します。
- 根底にある筋肉から皮膚を分離します。
- 鈍い先端のはさみを使用して、仙乳と腰椎の棘プロセスの両側の長軸筋を切り取ります。
- S1椎骨を最も低いセグメントとして識別します。シャープな鈍いはさみを使用して、L6からL2椎骨までの棘プロセスを切断して取り除きます。次に、細かい回転器を使用して、横プロセスL6-L2を除去し、L6-L2セグメント(最初の横プロセス、次にラミナ、L6椎骨セグメントで始まる)上のラミネクトミーを行い、硬膜で覆われた脊髄の腰部セグメントを露出させます。動物固定化の固定点として使用される仙骨とL1棘プロセスを切断しないように注意してください。
- 鋭利なはさみを使用して、椎骨切除術の上部境界で、脊髄(その尾骨の断片)と側側と腹側の根をL2椎骨セグメントレベルで切断する。乾燥したゲルフォームの小片を置いて出血を止めます。次に、露出した脊髄セグメントの上に薄い生理用綿毛を置きます。
- 内側胃腸筋とその神経の分離
- 鋭い鈍いはさみを使用して、アキレス腱から股関節まで、左後肢の後部側に縦切りを作ります。
- 鉗子で皮膚をつかみ、切開の両側の下の筋肉から皮膚を分離する。
- 上腕二頭筋で覆われている膝関節の後ろのポピタル窩を見つけます。はさみを使用して、この筋肉の前部と後部の間に切り取りを行います。
- 上に移動し、上腕二頭筋の2つの頭を股関節まで切り、坐骨神経を露出させる。
- 鈍い鉗子とはさみを使用して、胃頭の内側頭から側面を分離し、内側胃頭筋の遠位挿入(アキレス腱)を切断する。力トランスデューサに接続するためにそれを使用するために、できるだけ長くアキレス腱の断片を保存します。
- 内側胃腸(MG)神経を特定する。鉗子とはさみを使用して、後二頭筋と半腱症への担保を含む坐骨神経の残りの担保をすべて切断する。供給血管を内側胃腸管腫にそのまま残す。
- アキレス腱を通して非弾性合字を通し、3つの結び目を作ります。
- 露出した神経と筋肉の下に生理に浸した綿毛を置きます。
- 鋸歯状鉗子を使用して、操作された領域の上に皮膚を閉じる。
- シャープな鈍いはさみを使用して、金属クランプ(3.1.6.)で固定化するために、左後肢の前部側に沿って皮膚と根底にある結合組織に2cmの切開を行います。
3. 記録と刺激の準備
- 椎骨柱と脚の固定と筋肉の配置
- スチール製のクランプを使用して、脛骨にクランプを置いて左後肢を固定します。
- カスタムメイドの調整可能なフレーム(分離銅線、1mm)にラットを配置し、4つの合字を使用してラミネクトミーの周りの皮膚フラップを引き上げ、露出した脊髄の上にパラフィン油(サイズ約50mm x 50mm)のプールを形成するために、皮膚をフレームに縫合します。
- デュモン#55鉗子を使用して、脊髄の交差点で硬膜を持ち上げ、仙骨の骨までそれを切り取り、それを引き込む。
- 鈍いガラス棒を使用して、それらを損傷しないように注意して、連続したレベルで左右の側側および腹側の根を分離する。
- 露出した腹側と側側根を覆う温かい(37°C)パラフィン油で脊髄の上のプールを満たします。
- カスタムメイドのアルミニウムプレート(長さ260mm、幅120mm、高さ80mm)に、クローズドループ加熱システムに接続された後肢用のプール(長さ135mm、幅100mm、深さ45mm)を付けてラットを置きます。プレートは、動物が固定化され、実験が行われる場所です。
- ヒンディムを固定するために金属バーで左後肢に置かれたクランプを固定します。
- 動物の体を固定し、呼吸の動きに関連する力の記録のアーティファクトを排除するために、仙骨とL1椎骨にスチールクランプを置くことによって椎柱を固定します。
- アキレス腱を介して、非弾性合字を持つ左内側の胃腸筋を力トランスデューサー(50 μm/250 mNのコンプライアンス、測定範囲0~1000mN)に接続します。
- 温かい(37°C)パラフィンオイルで後肢のチャンバーを充填し、内胃腸筋を覆い、温度プローブと自動システムを使用して37°C±1°Cで油温を維持します。
- 活動電位記録と刺激のための電極の配置
- 長い軸に垂直な、内側胃腸筋の中央部分を通して双極性銀線電極を挿入する。筋肉の長い軸に沿って位置する2つの電極間の約5mmの距離を維持する。これらの電極は、モータユニットの作用電位(MUAP)を記録するために使用されます。低ノイズアンプに電極を接続します。
- 力トランスデューサによって制御される100 mNの受動的な緊張に作動させた筋肉を伸ばす。このストレッチでラット内側胃腸の場合、3種類のMUsは最高のけいれん力15を開発する。
- シャープな鈍いはさみを使用して、右後肢の皮膚に2cmの切開を行い、参照電極として使用する銀線電極を挿入します。
- 露出した脊柱根の上にカスタムメイドの絶縁金属板(サイズ30 mm x 13 mm)を置き、固定します。左の腹側と裏根(L4、L5、L6)をプレートに置きます。
- ラミネクトミーの周りの皮膚によって形成されたプールに生理し過ごします。生理液量は断熱板の下にあるべきだ。
- 露出した脊柱根の上に銀線刺激電極(2本の銀線、直径0.5mm、長さ50mm)を置き、油でプレートの上に3mmの正極を置き、生理食い物のマイナス極(プレートの下のプールに追加)を配置し、刺激器に接続します。
4. モータユニットの録音
- 電気矩形パルス(0.1 msの持続時間、0.5Vまでの振幅)で刺激し、腹側根(L4、L5およびL6)を選択します。腹側根刺激は筋肉の収縮を呼び起こすが、後根にはそのような効果はない。プレートから裏根を除去します。内側胃腸の場合、ほとんどの軸索はL5腹側根にある。
- デュモン#55鉗子と拡大鏡を使用して、L5またはL4腹側根を非常に細かい軸索の束に分割します(両鉗子で腹側根のカット端をつかみ、根を引き剥がします)。これらのバンドルの1つを銀線電極に置き、1つのMUの活性を達成するために(0.1ミリ秒の振幅の矩形パルス)を刺激します。固体支持体(金属棒)は鉗子を使用するための手のサポートとして使用することができる軸索の薄い束を操作するために非常に有用である。また、追加の光源が必要であることにも注意してください。
- 刺激の強度を徐々に増加させることによって、けいれん収縮および作用電位刺激の呼び起こされる「オールまたはなし」の特徴に基づいて単一のMUを同定する。閾値の周りの刺激で呼び起こされる活動を注意深くテストする。
- 研究した筋肉で複数のMUが収縮し、力のレベルが上昇し、振幅が増加したり、作用電位の形状が変化することが目に見える場合は、ステップ4.2に戻り、軸索の束を再び分割する。なお、ラット内側胃腸内で最も強いMUは、最も弱い力よりも約70倍大きなツイッチ力を有し、非常に強いMUが第2の力を引き付けるとき、弱いMUは明らかでないかもしれない。また、一部のミューマは、電極の記録領域から筋線維を持っており、筋電図では見えないことに注意してください。このような場合には、刺激振幅の変化は力に影響を与えるが、作用電位には影響を与えない。
- 実験の目的に必要な刺激プロトコルで運動ユニットを刺激する。基本的な運動ユニットの収縮性および作用電位特性を計算するために必要な基本的な刺激プロトコルについては、以下を含む。
- 1 Hzで5つの刺激を含める(5つの単一のツイッチが記録され、平均化され、平均化はノイズを排除することであり、これは最も弱いMUsにとって特に重要である)。
- 10、20、30、40、50、60、75、100、150 Hzの周波数で500ミリ秒の一連の刺激を含める(これらの記録は、力と周波数の関係、150Hzの最大テタニック力、20〜40Hzの刺激でのたるみの計算を可能にする)。
- 疲労試験(40Hz周波数で14回の刺激の列車によって誘発されるテタニ、毎秒4分間繰り返す)を含む)。
- 上記のプロトコルのすべての要素の間に少なくとも 10 s の時間間隔を含めます。
- 連続する絶縁されたモーターユニットでプロセスを繰り返します。
- 実験を終了し、ペントバルビタールナトリウム(180mg·kg-1)の致死量の腹腔内投与を使用して動物を安楽死させる。
5. 電子機器
注:カスタムメイドのコンピュータプログラムは、刺激の可変パターンを作成する可能性を提供し、ステップ4.4で示されたものを含む、刺激装置を制御します。プログラムはアナログデジタルコンバータ(MUAPと力の記録のために少なくとも10 kHz)と協力します。
- アナログデジタルコンバータでコンピュータにACアンプを接続し、オシロスコープに並列接続します。
- アナログデジタルコンバータで、オシロスコープに並列して、力トランスデューサをコンピュータに接続します。実験中に受動的な筋肉の力を制御するために力のトランスデューサーを使用してください。実験中は、受動的な力が低下する可能性があることに注意してください。したがって、受動的な筋肉力を一定に保つために筋肉の長さを増やす必要があります。
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結果
モータユニットの収縮と作用電位のパラメータは、記録の安定した条件が確保されたときに記録に基づいて計算することができます。 図1 は、高速MUの単一のツイッチの代表的な記録を示す。上のトレースは、モータユニットの動作ポテンシャルを示します。刺激送達と運動ユニットの発症の起こり得る間の遅延は、腹側根から筋肉への伝導時間によるものである。 図2 は、高速MUの未注入破傷風力と運動ユニットの作用電位の列車の代表的な記録を示す。
図1:高速MUの単一のツイッチの代表的な記録。フォーストラックの上には、モーターユニットのアクションポテンシャルがあります。
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ディスカッション
経験豊富な科学者によって正しく行われる場合、記述されたプロトコルの外科コンポーネントは約2時間以内に完了する必要があります。手術中の動物の安定した生理学的状態、特に体温と麻酔の深さを維持するために特に注意を払う必要があり、これはピナと離脱反射を評価することによって体系的に制御されるべきである。手術後、少なくとも6時間は安定した記録状態を維持することができるはずである。
重要な実験手順は、研究した筋肉に単一の運動軸索を単一に分離することにつながる非常に薄いフィラメントに腹側根の分割から始まります。実際には、 腹側根の薄いフィラメントは、後肢の異なる筋肉を内面する軸索のグループを含む;しかし、研究された筋肉を除くすべての筋肉が否定されるため、刺激された軸索の束が研究された内側胃腸に1本の軸索しか含まなかった場合、この研究された筋肉でのみ単一のMU収縮を呼び起こすることができる。単一のMU収縮として呼び起こされる活性の識別に成功した後、3つの生理学的タイプの1つとしてMUの分類に重要な一連の力記録(単一のけいれん、融合していない破傷風、疲労試験)を記録することができる。この手法の利点は、...
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開示事項
著者は開示する利益相反はありません。
謝辞
この研究は、ポーランド国立研究センター助成金2018/31/B/NZ7/01028によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| フォーストランスデューサ | カスタムメイド | ||
| 鉗子 | ファインサイエンスツール | No.11255-20 | モン#55エクストラライトとファインシャンク |
| 鉗子 | ファインサイエンスツール | No.11150-10 | ファイングリーフェ鉗子 |
| 鉗子 | ファインサイエンスツール | No.11026-15 | グリップのための特別なカップパターン |
| 鉗子 | ファインサイエンスツール | 番号11023-10 | 1x2歯 |
| 鉗子 | サイエンスツール | 番号11251-20 | モン#5 |
| 血ファイン | サイエンスツール | 番号13003-10 | マン |
| アイソレーションユニット | グラスインスツルメンツ | S1U5A | |
| 低ノイズバイオアンプリファー | ワールド精密機器オーダー | コード74030 | |
| ドルホルダー | ファイン科学ツール | No. 12503-15 | タングステンカーバイド顎付き |
| Rongeurs | ファインサイエンスツール | No. 16021-14 | フリードマン・ピアソン |
| はさみ | ファインサイエンスツール | No. 14101-14 | 大きな指のループを持つストレートシャープ/ブラント |
| さみ | ファインサイエンスツール | No. 14075-11 | 湾曲した鈍い/鈍い |
| ハサミ | ファインサイエンスツール | No. 14084-08 | エクストラファインボン |
| さみ | ファインサイエンスツール | No.15000-00 | 、神経切断に最適 |
| 刺激装置 | グラスインスツルメンツ | S88 | デュアル出力矩形パルス刺激装置 |
参考文献
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