CRISPR/Cas9ベース技術を用いたCD40アゴニスト抗体誘発性大腸炎モデルにおける標的遺伝子機能の解明

サマリー

ここでは、クラスター化された規則的な間隔を空けた短い回文反復法(CRISPR)/CRISPR関連エンドヌクレアーゼ(Cas9)ベースの技術を使用して免疫系の目的の遺伝子をノックアウトする方法と、分化クラスター40(CD40)アゴニスト抗体誘発性大腸炎モデルにおけるこれらのマウスの評価について説明します。

要約

免疫系は、細菌やウイルスなどの外来の侵入者から人間を守るために機能しています。しかし、免疫系の障害は、自己免疫、炎症性疾患、および癌につながる可能性があります。炎症性腸疾患(IBD)は、クローン病(CD)や潰瘍性大腸炎(UC)など、腸の炎症を再発する慢性疾患です。IBDは欧米諸国で最も蔓延していますが(1,000人に1人)、世界中で発症率は増加しています。関連研究を通じて、研究者は何百もの遺伝子をIBDの病理に関連付けてきました。しかし、IBDの背後にある精巧な病理と多数の潜在的な遺伝子は、最適な治療標的を見つける上で大きな課題を提起しています。さらに、各遺伝的関連を機能的に特徴付けるために必要なツールは、各遺伝子の遺伝子改変マウスの生成など、多くの律速制限因子を導入します。標的遺伝子の治療可能性を調べるために、クラスター化された規則的な間隔を空けた短い回文反復配列(CRISPR)/CRISPR関連エンドヌクレアーゼ(Cas9)ベースの技術と、分化クラスター40(CD40)アゴニスト抗体を使用してモデルシステムを開発しました。本研究は、免疫系におけるCRISPR/Cas9を介した編集が、in vivoでの遺伝子の影響を調査するために使用できることを示しています。造血コンパートメントに限定されたこのアプローチは、結果として再構成された免疫系を確実に編集します。CRISPR/Cas9編集マウスは、従来の遺伝子改変マウスよりも早く作製でき、はるかに安価です。さらに、マウスのCRISPR/Cas9編集は、遺伝子改変マウスを作製して育種する場合と比較して、胚致死的な標的を評価する能力など、科学的な利点も大きいです。本研究では、CD40アゴニスト抗体誘発性大腸炎モデルにおいて、CD40をモデルターゲットとして、このアプローチの実現可能性を実証しています。

概要

自己免疫疾患とは、患者の免疫系が自分の細胞や臓器を攻撃し、慢性的な炎症や組織損傷を引き起こす状態を指します。これまでに約100種類の自己免疫疾患が報告されており、人口の3〜5%が罹患しています¹。全身性エリテマトーデスやIBDなど、自己免疫疾患の多くは効果的な治療法がなく、アンメット・メディカル・ニーズが顕著です。現在、米国だけで約150万人が罹患しているIBDは、進行性、持続性、再発性の腸内炎症を特徴とする壊滅的な病気で、治療法はありません。IBD患者が必要とする新しい治療および予防戦略を提供するためには、根本的な病因と病態生理学を解明する必要があります^2,3。

ゲノムワイド関連解析(GWAS)⁴により、230種類以上のIBD遺伝子座が同定されています。これらの関連により、IBDの主要なメカニズムと経路において重要な役割を果たす可能性のある新しい遺伝子が解明されましたが、これらの遺伝子座からの遺伝子はごくわずかしか研究されていません。一部の遺伝子は、特定の経路に関与しています。例えば、微生物感知経路は、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有タンパク質2(NOD2)に関連しています。オートファジー経路は、オートファジー関連16 like 1(ATG16L1)、免疫関連GTPアーゼファミリーM(IRGM)、およびカスパーゼリクルートドメインファミリーメンバー9(CARD9)に関連しています。また、炎症誘発性経路は、インターロイキン(IL)-23駆動型T細胞応答に関連しています⁴。GWAS ^5,6を通じて同定された遺伝子を機能的に特徴付けるために、さまざまなin vivoマウスモデルが使用されています。

IBDの病因^{を研究する}ために使用された主要なモデルの1つは^、免疫不全マウス(T細胞およびB細胞)にCD40アゴニスト抗体を注射した後に自然免疫腸の炎症を誘発する大腸炎のCD40^{モデルです。}主にIBD(主にマクロファージおよび樹状細胞⁾9の自然免疫の発症への寄与を調べるために使用され、完全に免疫能の高い野生型(WT)マウスで疾患を誘発できるかどうかは不明である。動物モデルに加えて、化合物や生物製剤などの遺伝子の機能特性評価には、遺伝子特異的なツールも必要です。さらに重要なことは、遺伝子改変動物は特定の遺伝子の機能を明らかにするために不可欠であるということです。しかし、遺伝子組み換えマウスの胚注入と育種に通常使用される戦略は、多くの場合、1年以上かかり、多額の財政的コストを負担します。この律速プロセスは、GWASによって同定されたIBD関連遺伝子の機能を解明する上で大きな課題を提示しています。

ここで紹介するプロトコルは、遺伝子改変マウスの繁殖に代わる実行可能な代替手段を提供します。まず、 図1 の概略図に示すように、系統陰性、幹細胞抗原1陽性、受容体チロシンキナーゼKit陽性(lineage-Sca1+c-Kit+またはLSK)細胞を、特定の対立遺伝子(CD45.2)を有するCas9ノックイン(KI)マウスの骨髄から単離し、ドナー免疫細胞の追跡を可能にする。次に、これらの細胞を、異なるガイドRNA(gRNA)と蛍光マーカーである紫色励起緑色蛍光タンパク質(VexGFP)を持つレンチウイルスに曝露して、形質導入細胞の追跡を可能にします。2日後、VexGFP+細胞を選別し、致死的に照射したレシピエントLy5.1 Pep Boyマウス(CD45.1対立遺伝子を持つC57Bl/6マウス)に注入して、レシピエント免疫細胞の追跡を可能にします。12週間後、免疫系は完全に再構成され、マウスをin vivoモデルに登録することができます。

この方法論は、遺伝子組み換え動物の作製と育種と比較して、コスト削減と世代までの時間の短縮という利点に加えて、造血コンパートメントを特異的に標的とするため、胚致死的な標的に最適です。さらに、抗体などのツールが利用できないターゲットに対しても、このシステムは実現可能なアプローチを提供します。要約すると、これまでに述べた課題に対処するために、遺伝子改変動物モデル10,11,12,13,14を迅速に生成するために、in vivo CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集プラットフォームが開発された。この研究は、WT C57Bl/6マウスの腸内炎症がCD40アゴニスト抗体によって誘発されることを示しています。CD40は、このモデルでは疾患の重要な調節因子であるため、CRISPR/Cas9ベースのノックアウトと遺伝子機能の喪失を検証するためのモデルターゲットとして使用されました。

プロトコル

このプロトコルに従って行われるすべての動物実験は、それぞれの動物実験委員会(IACUC)によって承認されなければなりません。ここに記載されているすべての手順は、AbbVie IACUCによって承認されています。

1. 必要なレンチウイルスの作製とドナー・レシピエント動物の調達

注: 資料表 には、このプロトコルで使用されるすべての動物、器具、および試薬の供給元番号と注文番号の詳細が含まれています。

1. VexGFPまたはmCherryに修飾したlentiGuide-puroベクターを使用してプラスミドを構築します。
   1. スクランブルされた非標的gRNA(SgNone)またはCD40標的gRNAを修飾ベクターにクローニングします。
      注:この研究では、各gRNAの配列は次の通りでした:SgNone、CTATGATTGCAACTGTGCAG;SgCD40.1、AGCGAATCTCCCTGTTCCAC;SgCD40.2、GACAAACAGTACCTCCACGA;およびSgCD40.3、ACGTAACACACTGCCCTAGA。
   2. 前述したようにレンチウイルス粒子を作製する¹⁵。
      1. gRNAをコードするプラスミドをVSV-GおよびpLEXパッケージングプラスミドとともに293T細胞に同時トランスフェクションします。
      2. トランスフェクションの18時間後に培地を交換し、培地交換後24〜48時間後にウイルスを含む上清を回収します。
      3. CD40 gRNAの効率を評価するには、CD40をコードするpcDNA3.1プラスミドをトランスフェクションして、CD40安定な293T細胞株を作製します。
   3. 記載のレンチウイルスを用いて細胞をトランスフェクションし、2週間後に蛍光活性化セルソーティング(FACS)により評価します。
      注:Cas9 KIマウスをドナーマウスとして使用しました。C57Bl/6-Ly5.1 Pep Boyマウス(CD45.1対立遺伝子を発現)をレシピエントとして使用する場合は、Cas9 KIマウスがC57Bl/6バックグラウンド上にあること(およびCD45.2対立遺伝子を発現していること)を確認して、GvHDを回避し、ドナー細胞とレシピエント細胞を追跡します。
2. 実験を設計します。遺伝子ノックアウト(KO)には、遺伝子ごとに3〜6個のgRNAを使用します。各gRNAについて、移植中および移植後の動物損失を考慮して、レシピエントマウスを20%追加で調製します。
   注:CD40アゴニスト抗体誘発性大腸炎モデルでは、統計的検出のためにグループごとに最低8匹のマウスが必要です。したがって、この研究では、gRNAあたり10匹のマウスが調製されました。他のin vivoモデルに必要なマウスの数は、使用するモデルによって異なります。
3. 8〜12週齢の同性のドナーマウスとレシピエントマウスを使用します。
   注:マウスは、IACUCが承認したガイドラインの下で、最低5%のイソフルランを使用して安楽死させ、二次的な方法として子宮頸部脱臼で確認されました。

2. 骨髄採取と細胞選別の準備

1. 鉗子とハサミを使用して、各ドナーマウス(大腿骨、脛骨、上腕骨、尺骨)から骨を採取し、できるだけ多くの筋肉/組織を慎重に取り除きます。
2. 0.6 mLの微量遠心チューブの底に23 Gの針で穴を開け、チューブを1.5 mLの遠心チューブの中に入れます。動物ごとに2セットを作ります。
3. 骨の一端を切り開き、4〜8個の骨をマイクロ遠心チューブの内側に置き、開いた端を23Gの針穴に向けています。
   注:チューブあたりの骨の数は骨によって異なります、たとえば、8つの脛骨、上腕骨、尺骨、または4つの大腿骨が適合します。
4. チューブ(1.5 mL遠心チューブ内の骨を含む0.6 mLマイクロ遠心チューブを使用)を300 × g で室温(RT)で2分間遠心分離します。
5. 骨髄のない骨が入っている0.6mLの微量遠心チューブを廃棄し、1.5mLの遠心チューブだけが骨髄でいっぱいになります。各遠心チューブに1 mLの赤血球溶解バッファー(塩化アンモニウムを含む)を加え、ピペッティングで細胞ペレットを再懸濁します。室温で1分間インキュベートします。必要に応じて、溶解ステップを繰り返します。
6. 細胞懸濁液を50 mLの円錐管に移し、カルシウムとマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を添加します(細胞懸濁液の容量の少なくとも2倍)溶解緩衝液を中和します。細胞を300 × g で5分間ペレット化します。上清を完全に吸引します。
7. 50 mLのコニカルチューブに70 μmのフィルターをロードし、DPBSを使用してチューブとフィルターを洗浄し、細胞をろ過します。フィルターを破棄し、セルをカウントします。
   注:30匹のドナーマウス(12週齢)を使用すると、平均して200〜300×10個の⁶ 細胞が得られます。

3. 形質導入のためのLSK細胞を単離するためのセルソーティング

1. ステップ2.7でカウントした細胞を磁気セルソーティング(MACS)バッファー(DPBS、2 mMエチレンジアミン四酢酸、0.5%ウシ血清アルブミン、10 μg/mLペニシリン-ストレプトマイシン)で所望の容量(10^{7細胞あたり} 90 μL)に再懸濁します。
2. 10^{7細胞あたり} 10 μLのCD117+ビーズを添加します。よく混合し、光から保護し、4°Cで15分間インキュベートします。
3. MACS LSカラムを磁場に置き、MACSバッファーですすいで調製します。
4. ステップ3.2の細胞を適切な容量のMACSバッファー(容量の2倍以上)で洗浄し、300 × g で10分間遠心分離します。
5. 上清を完全に吸引します。ペレットを再懸濁して、最終濃度が500μLのMACSバッファー中の10⁸ 細胞になるようにします。
6. 細胞懸濁液をLSカラムに塗布します。3mLのMACSバッファーで3回洗浄します。
   注:1つのLSカラムには、最大10個の⁸ 個のラベル付きセルと、合計2個×10個の⁹ 個のセルを含めることができます。
7. カラムをマグネティックセパレーターから取り外し、適切な収集チューブに入れます。5 mLのMACSバッファーを加え、プランジャーをカラムにしっかりと押し込んで、磁気標識細胞をすぐに洗い流します。
8. 細胞を300 × g で10分間ペレット化します。上清を完全に吸引します。
9. 細胞を10^{7細胞あたり} 100 μLのMACSバッファーに再懸濁し、系統(CD3、B220、Ter119、Gr-1、CD11b)およびSca-1の染色抗体を添加します。
   注:30匹のドナーマウス(12週齢)を使用すると、平均して100〜180×10個の⁶ 細胞が得られます。
10. よく混合し、光から保護し、4°Cで20分間インキュベートします。
11. MACS緩衝液5〜10mLを加えて細胞を洗浄し、300 × g で10分間遠心分離します。上清を完全に吸引します。
12. 500 μL の MACS バッファーに最大 10 個の⁸ 細胞を再懸濁
13. 70 μmのセルストレーナーで細胞をろ過し、系統-Sca1+集団に対してFACSを実行します。
    注:人口の約1.8〜2.6%は系統-Sca1+である必要があります。
14. LSK培地(10,000細胞あたり100 μL)で細胞を回収します:無血清増殖培地、100 ng/mLトロンボポエチン、マウス幹細胞因子、Fms関連チロシンキナーゼ3リガンド、およびIL-7と100 μg/mLペニシリン-ストレプトマイシン。
15. ペレットセルを300 × g で10分間ペレット化します。上清を完全に吸引します。

4. LSK形質導入と培養による制御細胞とノックアウト細胞の作製

1. 細胞をLSK培地に再懸濁します。
2. LSK培地中の96ウェル平底組織培養(TC)プレートにウェルあたり10,000個の細胞を播種します。
3. 無菌条件下で、5% CO₂ 、湿度95%で37°Cで一晩インキュベートします。
4. DPBSに50 μg/mLのレトロネクチン溶液を調製し、TC処理されていない24ウェルポリスチレンプレートの各ウェルに300 μLを添加します。4°Cで一晩インキュベートします。
5. 翌日、レトロネクチン溶液を廃棄し、コーティングされたプレートを300μLのDPBSですすぎ、繰り返します。
6. 500 μLの培地(ステップ4.2の96ウェルプレートから5ウェル)中の50,000 LSK細胞を、ステップ4.4の24ウェルポリスチレンプレートの各レトロネクチンコーティングウェルに移します。5ウェルあたりさらに100 μLのLSK培地を使用して、96ウェルプレートに残っている余分な細胞をすすぎ、回収します。このステップに続いて、24 ウェルプレートのウェルあたりの容量が 600 μL であることを確認します (96 ウェルプレートから 100 μL ウェル 5 個 + 5 ウェルの洗浄に使用した 100 μL ×)。
   注:移載後、空になった24ウェルプレートを顕微鏡で見て、すべての細胞が収集されたことを確認します。LSK培地を使用して、この小さな集団からの細胞損失を最小限に抑えるために、移されなかった細胞を採取します。
7. 各ウェルに300 μLのウイルス上清を加え、プレートを設定値500で5分間振とうします。プレートを600 × g 、37°Cで20分間回転させます。mLあたり少なくとも5個×10個⁶ 個のウイルス粒子を使用してください。
   注:この研究では、pLentiPuroから改変されたベクターを使用し、ピューロマイシン耐性素子をVexGFPに交換しました。ウイルスは、50〜100人の感染の多様性で追加されました。
8. 1時間インキュベートします。予熱したLSK培地500μLを加えます。
9. 無菌条件下で、5% CO₂ 、湿度95%の37°Cで2日間インキュベートします。

5. ドナー幹細胞生着準備のための動物照射

1. 2日間のインキュベーション後、レシピエント動物に475cGyを4時間間隔で2回照射します。2回目の放射線照射後、動物をオートクレーブケージに入れ、免疫不全動物として12週間治療します。マウスは、エンリッチメント、ハイドロゲル、およびケージサイドモニタリングを受け、必要に応じて支持療法と介入を提供しました。マウスは、支持療法や介入方法に加えて、抗生物質の餌や水を受け取ることがあります。
   手記。照射量は、照射器によって異なる場合があります。照射器の用量漸増を行い、最適な投与量を特定します。C57Bl/6マウスに対する700〜1300cGyの線量は、さまざまな文献例¹⁷で有効であることがわかっています。この範囲で3〜4回の投与を選択し、生存率と生着について1回の投与につき5匹のマウスを評価します。生着がうまくいかなかったり、放射線量が高すぎたりすると、マウスは生着後3週間を過ぎると生きられません。生着後4週間で、生き残ったマウスを出血させて、FACSによる生着を評価します。私たちは、生着を評価するために、マウスあたり~50-100μLの眼窩後(RO)採血を行います。マウスは収集中に麻酔下(2〜3%イソフルラン)下にあり、RO採血後の支持療法として眼用潤滑剤と1.0mLの皮下生理食塩水を受け取りました。

6. 放射線照射を受けた動物への細胞調製と注入

1. ステップ4.9から各ウェルから細胞をピペットで取り出し、細胞に異なるgRNAを形質導入したのでグループを分離し、300 × g で10分間ペレット化します。
2. 細胞をMACSバッファーに再懸濁し、70 μmストレーナでろ過し、VexGFP+集団を選別します。
   注:細胞の約10〜15%がVexGFP+である必要があります。
3. 細胞を300 × g で10分間ペレット化します。それらをハンクの平衡塩溶液に再懸濁します:200μL中のマウスあたり5,000個以上の細胞。
   注:HBSSは非医薬品グレードです。また、注射には医薬品グレードの滅菌生理食塩水を使用することを検討することもできます。
4. 最後の照射の3時間後に細胞を静脈内注射します。
   注:12週間後、マウスは完全に生着した免疫システムを持ち、in vivoモデルに登録することができます。

7. 野生型マウスにおけるCD40アゴニスト抗体誘発性大腸炎モデル

注:動物を毎日体重を量り、評価してください。必要に応じて支持療法を提供します:10%の体重減少で1.0mLの皮下塩化ナトリウム溶液、または脱水状態の場合。このモデルのポジティブコントロールは、-1日目から週に2回、25 mg / kgで腹腔内に投与される抗p40です。

注:この研究では、実験グループには、ナイーブコントロール、ビヒクル(ネガティブ)コントロール、およびアンチp40(ポジティブ)コントロールグループが含まれていました。これらのグループは、CD40アゴニスト抗体誘発性大腸炎モデルの正常な挙動を制御します。ベクター、SgNone、およびSgRNAグループ:一般的なレンチウイルスベクターのベクターコントロール、SgNoneはスクランブルされたノンターゲティングガイドコントロールであり、SgRNAグループは標的gRNAの発現が低下した「治療」グループです。

1. 0日目:DPBSで腹腔内に10 mg / kgのCD40アゴニスト抗体を、ナイーブコントロールを除くすべての動物に注射します。
2. 3 日目と 6 日目: ビデオ内視鏡検査を実施して、前述のように疾患の進行を評価します¹⁶.
   1. マウスに2〜3%イソフルランを麻酔します。回復中は、内部麻酔器のメカニズムや外部ヒートパッドを介して熱サポートを提供します。
   2. マウスが麻酔下に入ったら、DPBS(カルシウムとマグネシウムを含まない)浣腸を投与して、内視鏡検査のために結腸を準備します。
      注:浣腸を行うには約1〜2mLが必要です。
   3. 浣腸後、麻酔下で、マウスを麻酔器のノーズコーンに移動します。
   4. 内視鏡を結腸にそっと挿入し、カメラを中央に配置し、結腸を空気で膨らませながら(付属のエアポンプを使用するか、チューブ/シリンジを取り付けて手動で膨らませます)、内視鏡をゆっくりと引き出し、肛門から3cm、2cm、1cmのところでビデオと画像を収集します。
      注:結腸の刺激を最小限に抑えるために、内視鏡の先端に滅菌潤滑剤を追加することができます。
   5. 表1に記載されているように、血管パターンと粘膜の肥厚に基づいて各画像を個別に採点します。マウスごとに3つの画像からのスコアを組み合わせて、各動物に合計スコアを割り当てます。
3. 7日目:イソフルランの過剰摂取またはCO₂ チャンバーによってすべてのマウスを安楽死させ、血清の心臓穿刺によってできるだけ多くの血液を採取します。脾臓の重量を量って脾腫を測定し、フローサイトメトリーのために収集し、組織病理学のために結腸を収集します。
   注:マウス結腸のホルマリン固定およびパラフィン包埋組織切片を調製し、Wangら¹⁹によって以前に報告されたように免疫組織化学(IHC)に使用した。

結果

上述の手順に従い、CD40を標的としたgRNAを発現するマウスを作製した。2週目までに、B細胞、CD11b+マクロファージ、およびCD11c+樹状細胞(DC)が生着しました(図2)。しかし、T細胞は、以前の文献¹⁸に基づいて予想されたように、完全に生着するまでに時間がかかり、生着後~90%に達するには生着後12週間を要しました(図2)。脾臓やリンパ節などの免疫器官は、ドナー由来の細胞の最も顕著な集団を持っていました。しかし、肝臓、肺、腸などの他の臓器でもドナー細胞の存在が示されました(図3)。CD40発現の大幅な減少は、CD40を標的とするgRNAを発現するマウスでのみ観察されました(図4)。

ディスカッション

今回紹介する結果は、このCD40アゴニスト抗体誘発性大腸炎モデルにおける遺伝子機能を調査できる、新しいCRISPR/Cas9ベースのゲノム編集プラットフォームを紹介するものです。セルソーティングにより、遺伝子改変LSK細胞のプールが濃縮され、再構成された動物内でのCD40発現がわずか4か月で90%以上減少しました。さらに、免疫系内でのCD40の発現の減少は、CD40アゴニスト抗体誘発性大腸炎モデル内で大きな影響を及ぼし、疾患のエンドポイントを大幅に減少させました。これらの結果に基づいて、in vivo CRISPR/Cas9ベースのプラットフォームが確立され、研究者は免疫系内の遺伝子の機能を研究するための強力なツールを得ることができます。この技術の進歩により、新たな標的生物学の検証プロセスが促進され、最終的には、必要とするIBD患者や自己免疫患者に革新的な治療法を提供する能力がもたらされます。

ここで紹介するCRISPR/Cas9ベースのプラットフォームは、WT C57Bl/6マウスにおける効率的かつ効果的な遺伝子...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6ウェル組織培養プレート	Corning/Costar	#3506
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR 2300/5/6
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)	Miltenyi Biotec	130-091-221
0.45 µm フィルターユニット	Millipore	#SLHV013SL
0.6 mL 微量遠心チューブ	Axygen	MCT-060-C-S
1.5 mL Eppendorf チューブ	Axygen	MCT-150-C-S
15mL コニカル	VWR	21008-918
23 G ニードル	VWR	#305145
24 ウェル ノン TC プレート	Falcon	#351147
24ウェルTCプレート	Falcon	#353047
50 mL コニカルチューブ	VWR	21008-951
5 mL Syringe	BD Biosciences	#309647
70 µm Filter	Miltenyi	#130-098-462
96-Well Flat Bottom Plates	Corning	#3599
96-Well U-Bottom Plates	Corning/Costar	#3365
Anesthesia Machine	VetEquip - COMPAC5	#901812
Anti-CD40 Agonist monoclonal antibody	BioXcell	BE-0016
Anti-p40 monoclonal antibody	BioXcell	BE-0051
B220 PE 抗体	BioLegend	#103208
ウシ血清アルブミン	Sigma Aldrich	A7906-100G
Cas9 ノックインマウス	Jackson Labs	#026179	C57Bl/6 バックグラウンド
CD117+ ビーズ	Miltenyi	#130-091-224
CD11b PE 抗体	BioLegend	#101208
CD3 PE 抗体	BD Biosciences	#553240
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6KR Centrifuge
Countertop Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424
DPBS	ThermoFisher	#14190136
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Mediatech	#10-013-CV
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)	Invitrogen	AM9260G
内視鏡	カールストルツ	N/A	Custom Coloview Tower
Flow cytometer	BD Biosciences	FACS Aria II
Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt-L)	PeproTech	#250-31L
Gr-1 PE 抗体	BD Biosciences	#553128
Hank's balanced salt solution (HBSS)	ThermoFisher	#14170120
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum	HyClone	#SH30071.03
IL-7	PeproTech	#217-17
Incubator	Binder	#9040-0116
Isoflurane	HenrySchein	#6679401710
LS Column	Miltenyi	#130-042-041
Ly5.1 Pepboy Mice	Jackson Labs	#002014	C57Bl/6
バックグラウンドマウス幹細胞因子 (mSCF)	PeproTech	#250-03
塩化ナトリウム (NaCl)	Hospira	#00409488850
OPTI-MEM 無血清培地	Invitrogen	#31985-070
Penicillin-streptomycin (PenStrep)	ThermoFisher	#15140-122
Plate Shaker	,	ThermoFisher#88880023
pLentiPuro	Addgene	#52963
Polybrene (10 µg/µL)	Sigma Aldrich	#TR-1003-G
赤血球溶解バッファー	eBioscience	#00-4333
レトロネクチン	Takarbio	#T100B
SCA-1 APC 抗体	BioLegend	#108112
StemSpan	StemCell Technologies	#09600
Ter119 PE 抗体	eBioscience	#12-5921
トロンボポエチン(TPO)	PeproTech	#315-14
X線照射器	精密X線	X-Rad 320