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方法論記事

自由に行動する カエノルハブディティス・エレガンス におけるカルシウムイメージングと、十分に制御された非局在振動

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DOI:

10.3791/61626

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2021年4月29日

 ,  ,  , 
1Program of Biomedical Science, Graduate School of Integrated Sciences for Life, Hiroshima University, 2Institute for Quantum Life Science, National Institute for Quantum and Radiological Science and Technology, 3National Institute for Radiological Sciences, National Institute for Quantum and Radiological Science and Technology, 4JST, PRESTO

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここで報告されたのは、よく制御された非局在振動を有する 自由に行動するCaenorhabditis elegans におけるカルシウムイメージングのためのシステムである。このシステムにより、研究者はナノスケールの変位で十分に制御された特性を持つ非局在振動を呼び起こし、振動に対する C. elegans の応答中のカルシウム電流を定量化することができます。

要約

振動や音波などの非局在的な機械的力は、発生から恒常性まで、さまざまな生物学的プロセスに影響を与えます。動物は行動を変えることによってこれらの刺激に対処します。このような行動修正の根底にあるメカニズムを理解するには、関心のある行動中の神経活動の定量化が必要です。ここでは、特定の周波数、変位、および持続時間の非局在振動を有する カエノラブディティス・エレガンス を自由に行動させる際のカルシウムイメージングの方法を報告する。この方法は、音響トランスデューサを使用して十分に制御された非局在振動を生成し、単一細胞分解能で誘発されたカルシウム応答を定量化することを可能にする。原理の証明として、振動に対する C.エレガンスの 脱出応答の間、単一の介在ニューロンAVAのカルシウム応答が実証される。このシステムは、機械的刺激に対する行動応答の根底にある神経メカニズムの理解を容易にする。

概要

動物はしばしば、振動や音響波などの非局在的な機械的刺激にさらされる1,2。これらの刺激は恒常性、発達、生殖に影響を与えるため、動物はそれらに対処するために行動を変えなければなりません3,4,5。しかし、そのような行動改変の根底にある神経回路およびメカニズムは、ほとんど理解されていない。

線虫のメカノセンティック行動、Caenorhabditis elegansは単純な行動パラダイムであり、ワームは通常、非局在的な振動に遭遇すると、前方の動きから後方の脱出応答に行動を変える6。この挙動の根底にある神経回路は、主に5つの感覚ニューロン、4対の介在ニューロン、および数種類の運動ニューロン7、8から構成される。さらに、ワームは、反復刺激9、10、11を含む間隔をあけた訓練の後、そのような機械的刺激に慣れる。したがって、この単純な行動応答は、非局在的な振動誘発行動と記憶の両方の根底にある神経メカニズムを調査するための理想的なシステムを構成する。非局在振動の影響下で自由に行動するワームにおけるカルシウムイメージングのためのプロトコルが示されている。以前に報告されたシステムと比較して、このシステムは追跡のために追加のカメラを必要としないという点で簡単です。ただし、非局在振動の周波数、変位、および持続時間を変更することができます。AVA介在ニューロンの活性化は後方脱出応答を誘導するため、AVA特異的プロモーターの制御下でカルシウム指示薬GCaMPとカルシウム非感受性蛍光タンパク質TagRFPを共発現するワームを例に挙げた(詳細は材料表参照)。このプロトコルは、ワームが前方から後方への移動に切り替える際のAVAニューロンの活性化を示しています。このプロトコルは、メカノ感覚行動の根底にある神経回路メカニズムの理解を容易にする。

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プロトコル

1. カルシウムイメージングまでのワームの培養

  1. カルシウムイメージング実験の4日前に、2匹の成虫ST12ワームを、エシェリヒア・コリOP50が正方形のパターン(約4mm x 4mm)に縞模様になっている新しい線虫増殖培地(材料表)に移し、細胞スプレッダーを用いて、ワームがカルシウムイメージング中に細菌にほとんどの時間を費やすようにする12。
  2. このNGMプレートをインキュベーター内で20°Cで4日間インキュベートする(材料表)。

2. ハードウェアのセットアップ

  1. 刺激用圧電デバイス13、2倍対物レンズ、高速sCMOSカメラ、画像分割光学系、x-y電動ステージ、励起用LED光源、コンピュータを搭載した顕微鏡を用意する(図1)。sCMOSカメラの必須仕様には、2560 x 2160アクティブピクセル、6.5μmのサイズ、インターフェースオプションとして10タップカメラリンクが含まれます。X-Y電動ステージの主な仕様には、110 mm x 75 mmの走行範囲、250 mm/秒の最大速度、2,000 mm/秒の2 つの最大加速度、および0.25 μmの一方向再現性が含まれます。
  2. コンピュータと x-y 電動ステージコントローラの電源を入れます。
  3. アンプの電源を入れ、 音量 アジャスターを 10 に、 低音 と 高音 アジャスターを 8 に設定します。
  4. GCaMP と TagRFP を励起するには、LED 光源の 488 nm および 560 nm のライトをオンにします。光源のコントロールポッドの470nmと550nmのゲージを5%に設定して、LEDライトの強度がイメージングに適するようにします。
    注:このLED強度では、GCaMPおよびTagRFP蛍光のフォトブリーチングは記録中に発生しません。

3. カルシウムイメージングのためのソフトウェアセットアップ

  1. Windowsでは、マウスマクロソフト、振動特性制御ソフト、トラッキングソフト実行ソフト、データ解析ソフトの3つのソフトウェアパッケージをダウンロードしてインストールします(材料表)。
  2. トラッキングソフトウェアファイルをダブルクリックします。
  3. Runボタンを押し、5分間待ってからソフトウェアを安定させます(図2A)。
  4. 露光時間とビニングに関する情報を提供します。0.033秒の露光時間を2 x 2ビニングで行い、スムーズな画像取得を保証します(図2B)。
    メモ:メモリ負荷を軽減するために、取得した10番目の 画像のみが表示されます。
  5. 画像取得用の情報を入力します(図2C)。たとえば、10 秒間隔で 500 枚の画像を 2 回記録する場合、[ 画像の合計 ] ボックスに 1,000 個、[ 画像 ] ボックスに 500 個、[ 間隔] ボックスに 10 と入力します。
  6. 集録ボタンをオンにします(図2D)。
  7. 蛍光画像を分割光学系を用いて分割し、2つの画像(GCaMPチャネル、500〜525nm(図2E)とする。TagRFPチャンネル、584-676nm(図2F))は、sCMOSカメラの2つの半分に投影されます。GCaMP チャネルと TagRFP チャネルの座標を較正します(図 2G)。ソフトウェア設定を保存します。
  8. データファイルを出力するディレクトリを設定します(図2H)。
  9. 集録ボタンをオフにします(図2D)。
  10. マウスマクロシステムソフトウェア(図3A)をダブルクリックし、振動プロパティを設定します(図3B)。マウスマクロシステムでAssay.txtファイルを読み込み、そのファイル内の座標とスケジュールに基づいてマウスカーソルが制御されるようにします(図3A)。マウスカーソルの座標(図3Aのマゼンタ四角)と、記録開始後の刺激までの待ち時間(図3Aのマゼンタ)を設定します。振動制御用のソフトウェアで周波数と振幅の値を設定します(図3B)。

4. カルシウムイメージングのためのワームの準備

  1. GCaMPとTagRFPの両方を発現する単一のワームを、インキュベートプレートから 、大腸菌 OP50がストリークされた新しい新鮮なNGMプレートに移す。
  2. 透明粘着テープを使用してNGMプレートを圧電音響変換器に取り付けます(図4)。プレートをアクチュエータに押し付けると振動周波数が変わるため、押し付けないでください。

5. 特定の振動特性を制御したカルシウムイメージング

  1. 集録ボタンをオンにします(図2D)。
  2. 明るい光と励起光(488 nmと560 nm)の下でワームを見つけます。
  3. 顕微鏡のズーム値を 2.5x に設定します。視野は1.1 mm x 1.1 mmで、解像度は2.6 μm/ピクセルです。
  4. 明るいライトをオフにし、ホーミングボタン(図2I)をオンにして、ワームの蛍光スポットを追跡します。このホーミングボタンは、X-Yステージの動きを開始し、ワームの最大強度領域をTagRFP画像の視野の中央に保ちます。
    注: flp-18 プロモーターに関しては、AVAニューロンの蛍光強度が最も強く、他のニューロンからの蛍光強度はかすか、または検出されない。したがって、低倍率システムはトラッキングに必要ではなく、ステージは記録中を移動します。
  5. 図 2E および 2F の強度バーの値が約 1,000 であることを確認します。そうでない場合は、光源のコントロールポッドの470 nmおよび550 nmゲージを微調整します。
  6. マウス・マクロ・システムの「 実行」 ボタンを押すと、 図 3A で説明したスケジュールに従ってマウス・カーソルを制御できます。これは、追跡ソフトウェアを使用して記録を開始し、ワームを追跡しながら波動遺伝子ソフトウェアによって刺激します。
  7. 出力 BMP ファイルが適切に作成されているかどうかを確認します。

6. データ解析

  1. デスクトップ上にフォルダを作成し、 CalciumImagingという名前を付けます。
  2. CalciumImaging フォルダ内にフォルダを作成し、出力結果ファイル用に CIResult という名前を付けます。
  3. Windows用のデータ分析ソフトウェアで書かれた DualViewImaging.nb ファイルをダブルクリックします。
  4. ファイルパスをCIResultフォルダに挿入します(例:DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf])。
  5. BMP ファイルを含むフォルダ (例: SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) へのファイル パスを挿入します (図 5) 。 XXX は BMP ファイルを含むフォルダ名を示します。
  6. Shift キーと Return キーを同時に押して、自動解析を開始します。この解析では、TagRFP画像内の最大強度視野領域の値を使用します(プログラム内の詳細な計算手順については、図6の凡例を参照してください)。
  7. CIResult フォルダーに次の出力ファイルが適切に作成されているかどうかを確認します。
    XXX-GCaMP.tif (すべての画像の GCaMP 強度の痕跡を示す画像ファイル)
    XXX-GCaMP.xls (すべての画像の GCaMP 強度をリストしたスプレッドシートファイル)
    XXX-TagRFP.tif (すべての画像に対する TagRFP の強度の痕跡を示す画像ファイル)
    XXX-TagRFP.xls (すべての画像の TagRFP 強度をリストしたスプレッドシートファイル)
    XXX-Ratio.tif (すべての画像の比率値のトレースを示す画像ファイル)
    XXX-Ratio.xls (すべての画像の比率値をリストしたスプレッドシートファイル)

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結果

ここでは、AVAインターニューロン特異的プロモーターの制御下でGCaMPとTagRFPの両方を発現するワームを、自由に振る舞う C.エレガンスにおけるカルシウムイメージングの一例として用いている。GCaMPおよびTagRFPチャネルデータは、一連の画像として得られ、その一部は 図6 およびムービーとして示されている(補足ムービー1)。当社の非局在振動システム(図7)によって誘導されるペトリプレートの変位も定量化されました。変位は、振動制御用のソフトウェア(図3B)とアンプの ボリューム アジャクタ(図4)で振幅値を設定することによって制御できますが、周波数はソフトウェア(図4)で周波数値を設定することによって調整されます。成功した実験では、周波数630Hzの...

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ディスカッション

一般に、神経活動の定量化には、プローブの導入および/または動物の身体運動に対する拘束が必要である。しかし、機械感覚行動の研究のために、プローブおよび拘束の侵襲的な導入自体が機械的刺激を構成する。 C. elegansは 、その特徴が透明であり、302個のニューロンのみからなる単純でコンパクトな神経回路を有するため、これらの問題を回避するシステムを提供する。これらの利点を、ナノスケール変位13の非局在振動を呼び起こす以前に開発された方法と組み合わせることは、制御された振動に応答する無拘束 C.エレガンスの 非侵襲的カルシウムイメージングのための方法である。

機械的刺激の特性は、周波数、変位、持続時間などのいくつかのパラメータによって定義されます。近年、生体動学が新たな研究分野として浮上しています1。このような研究の主な目的は、生物による機械的振動の生成、分散、受容の根底にあるメカニズムと、それらの振動が行動に及ぼす影響を理解することです。人間を含む多くの...

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開示事項

著者らは、開示する利益相反はありません。

謝辞

我々は、この研究で使用された株を提供してくれた Caenorhabditis Genetics Centerに感謝する。本誌は、日本学術振興会科学研究費補助金(基盤研究(B)の助成を受けて行われました(Grant no.JP18H02483)、革新的領域「ソフトロボットの科学」プロジェクト(助成金番号。JP18H05474)、国立研究開発法人日本医療研究開発機構(助成番号19gm6110022h001)、島津製作所よりPRIMEを運営。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Data anaylsis software
DualViewImaging.nb著者取得したデータの解析用
Mathematica12Wolframデータ解析ソフトウェアの実行用 DualViewImaging
Escherichia coli and C. elegans strains
大腸菌 OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314)Caenorhabditis Genetics CenterKG1180光非感受性変異体
lite-1(ce314)><><>-18 Promoter as an extrachoromosomal arrays
Laser Doppler vibrometer
Lase Doppler vibrometerポリテックジャパンIVS-500音響トランスデューサが生成する周波数と変位の定量化
Mouse macro system
Assay.txt著者Windows HiMacroEx
線虫成長培地プレート
マウスカーソルを制御するための無料ダウンロード
01162-15NGMプレートの調製
バクトペプトンベクトン ディキンソン211677NGMプレートの調製用
カルシウム和光036-00485NGMプレートの調製用
コレステロール和光034-03002NGMプレートの調製用
ジフォタシウム水素リン酸中雷テスク28727-95NGMプレートの調製用
LBブロス、レノックス中雷テスク20066-95大腸菌OP50
無水マグネシウム硫酸塩TGIM1890NGMプレートの調製用
二水素カリウム中雷テスク28720-65NGMプレートの調製用
塩化ナトリウム中雷テスク31320-05NGMプレートの調製用
ペトリ皿 (60 mm)Nunc150270NGMプレート調製用
<強>非局在振動装置増幅
器LEPYLP-A7USB振動制御型刺激用
音響変換器ミネベアミツミLVC25振動制御型刺激用
WaveGene Ver. 1.5Thrivehttp://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html振動特性を制御するための無料ダウンロードソフトウェア
非侵襲的カルシウムイメージング
2チャンネルベンチトップ3相ブラシレスDCサーボコントローラーThorlabsBBD202MLS203-1ステージ用互換コントローラー
479/585nm BrightLineデュアルバンドバンドパスフィルターSemrockFF01-479/585-252チャンネル画像取得用(GCaMPとTagRFP)
505/606 nm BrightLine デュアルエッジ標準落射蛍光ダイクロイックビームスプリッターSemrockFF505/606-Di01-25x362チャンネル画像取得用(GCaMPとTagRFP)
512/25 nm BrightLine シングルバンドバンドパスフィルターSemrockFF01-512/25-252チャンネル画像取得用(GCaMP と TagRFP)
630/92 nm BrightLine シングルバンドバンドパスフィルタSemrockFF01-630/92-252チャンネル画像(GCaMPおよびTagRFP)の取得用
DellPrecision T7600Windows7 Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM
x-y電動ステージThorlabsMLS203-1高速XYスキャニングステージ
画像分割光学浜松ホトニクスA12801-01W-VIEW GEMINI 画像分割光学
LED 光源CoolLEDpE-4000470 nm および 560 nm 励起光
顕微鏡オリンパスMVX10
sCMOS カメラAndorZyla
x 2 対物レンズオリンパスMVPLAPO2XC作動距離 20 mm および数値aperture 0.5
Plasmid
pKDK66 共注入マーカー
pTAK83 著者pTAK83Plasmid for expression of TagRFP for expression of TagRFP for the control of; the flp/em><-18 promoter
pTAK144 著者pTAK144NLS-GCaMP5G-NLSの発現用プラスミド the flp-18 promoter
Tracking softwarehomingback.vi
著者sCMOSカメラとx-y電動ステージのフィードバック制御を通じてワームの蛍光スポットを追跡するためのSubViファイル
LabVIEWNational instruments追跡ソフトウェアの実行用
Zyla Control ver.2.6CI.vi著者sCMOSカメラとx-y電動ステージのフィードバック制御により、線虫の蛍光スポットを追跡
に Vector https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html スクリプト寒天精製粉末中雷テスク 01162-15 のための スクリプトstrong線虫成長培地プレート/ストロング15に基づいて 塩化 リン酸コンピュータ 高速系 系 によって生成された 2 チャンネル画像 (GCaMP および TagRFP) の取得用

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