我々は、再プログラム化された末梢血細胞から神経表現型を有する細胞を得るための遺伝子組換え非遺伝子組換え(GMフリー)法を提示する。新規ヒトGPI結合タンパク質にリンクされたシグナル伝達経路の活性化は、ヒト多能性幹細胞を得るための効率的なGMフリーの方法を明らかにする。
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この記事について
サマリー
要約
多くの人間の神経疾患は、脳内のニューロンおよびグリア細胞の変性によって引き起こされる。薬理学的および他の治療戦略の制限により、現在、負傷または病気の脳に対して利用可能な治療法はありません。細胞置換は、神経変性状態の有望な治療戦略として表示されます。.今日まで、神経幹細胞(NSC)は、胎児組織、ヒト胚細胞(ES)または人工多能性幹細胞(iPSC)から正常に生成されています。脱分化のプロセスは、多能性幹細胞の生成につながる新しいヒトGPI結合糖タンパク質の活性化によって開始された。これらの血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)は、明視野および免疫蛍光顕微鏡で示されるように、神経表現型を有する細胞に インビトロで 分化する。電子顕微鏡によるこれらの細胞の超構造解析は、その原始構造、ならびに神経細胞様形態および細胞内特性を確認する。
概要
基礎的および前臨床幹細胞研究法の開発は、神経疾患に対する幹細胞ベースの治療法の臨床応用を促進する。このような潜在的な治療は、機能回復につながるヒト神経細胞の生成方法に大きく依存する1.
神経幹細胞(NSC)は、成人神経新生と呼ばれるプロセスで、生涯を通じて新しいニューロンに自己更新し、分化します。非常に制限された脳領域だけが、成人期に新生児ニューロンを生成する能力のあるNSCを抱えています。このようなNSCは、学習や記憶に関与する成熟したニューロンを生み出し、失われたニューロンや損傷したニューロンを置き換えることができます。残念ながら、これらのNSCは制限された量で存在し、この限られた神経新生は若年発達中に急速に減少する2。したがって、神経細胞の他の供給源は、細胞治療の目的で考慮されなければならない。
変性神経疾患は、標準的な薬理学的アプローチを用いて治癒することは困難である。多くの薬用神経疾患を受け入れるための新しい治療戦略は、病気および負傷した組織の細胞置換療法に基づいています。NSC移植は、損傷した細胞を置き換え、有益な効果を提供することができます。神経細胞置換の他の供給源としては、哺乳類胚盤胞3の内細胞塊に由来するヒト胚性幹細胞(ESC)や、ESCのような広範な自己再生能....
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プロトコル
実験を行う際に倫理承認を得た。
1. ヒト末梢血単核細胞(PBMNC)の単離
- すべてのドナーが、制度ガイドラインに従って血液を撤回する前に、インフォームド・コンセントに署名したことを確認してください。
- 標準的なプロトコルに従って訓練された医療関係者によって健康なドナーから血液の30 mLを取る。
- 密度勾配媒体によって PBMNC を分離します。リン酸緩衝塩水(PBS)で希釈した1:1の血液25mLの培地10mL、300xgの遠心分離機を30分間使用してください。
- プラズマと密度勾配媒体の間の相間層をピペット処理により分離する。5 mLの無菌PBSと遠心分離機で10分間300 x g で単離した細胞を洗浄し、2回繰り返します。
- カウントチャンバーを使用して標準的な方法で細胞の数を数えます。
2. PBMNCの表面上の抗体架橋によるヒトGPIアンカー糖タンパク質の活性化
- 6 x 106個 の単核細胞(MNC)を15 mLチューブに入れ、ヒトGPI結合膜タンパク質特異的抗体(30μg/mL)を30分間PBSで30分間、37°Cで1%の牛血清アルブミン(BSA)で培養して抗体架橋を行う。
- インキュベーション培地を、10%の....
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結果
この新しいGMフリー法は、ヒトゲノムに直接作用することなく、血液前駆細胞を最も原始的な状態に戻すことができるという証拠を提供する。
我々は以前、GPI結合タンパク質特異的抗体架橋が、WNT、NOTCH、C-Kitなどの高度に保存された発達関連遺伝子のPLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTENアップレギュレーションを介して開始することを示し、HSCの生成への第一歩とBD-PS-PSの第2段階につながる脱分化のプロセスを開始した。
活性化されたMNC培養物は、CD45マイクロビーズを用いて免疫磁気選別を行った。この方法では再プログラムできない成熟した血液細胞(例えば、CD45陽性細胞)をカラムに保持し、再プログラムされた細胞を含む負の分画(CD45陰性細胞)を種々の神経系統細胞の生成に用いた。
まず、光とTEMを用いて、末梢BD分解細胞の.......
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ディスカッション
本研究で説明されたヒト細胞をリプログラミングする非GM法は、非操作ヒト末梢血から得られた自己再生PSCの 元生体 生成および拡張につながる脱分化のプロセスを開始するGPI結合ヒト膜糖タンパク質の背後にあるシグナル伝達の核活性化に膜に基づいている。これらの細胞は、適切な培地で培養した場合には、異なる生殖層6に属する細胞への再分化が可能である。
この研究で発表されたデータは、神経分化培地で培養したGMフリーのBD-PSC細胞が全く異なる表現型を獲得し、細長い形状を有し、オルガネラの発達が高まり、細胞間のより複雑な相互作用を確立したことを示している。また、ここで説明した条件を用いた再分化は、種々の神経系統に対する神経分化を意味する。
再分化研究で使用するために最適な数と再プログラム化された細胞の最高の品質を得るために、新鮮なMNC製剤は、凍結MNC製剤と比較して有利である可能性があります。この方法では再プログラムできない末端分化細胞からBD-PSCを分離した免疫磁気選.......
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開示事項
対応する著者は、彼女が新しいヒトGPIにリンクされたタンパク質に関連する特許保有者であると宣言し、彼女はACA CELLバイオテックで共同設立し、働いています。他の著者は、彼らが利益相反を持っていないと宣言します。
謝辞
ライナー・サフリッチ博士の記憶に捧げ。
著者らは、比較神経生物学研究所、バレンシア大学CIBERNED、バレンシア、スペイン、プロメテオ・グラント・フォー・エクセレンス・リサーチ・グループPROMETEO/20190/077の研究資金によって支援された比較神経生物学研究所でEM実験と分析を行ったホセ・マヌエル・ガルシア=ヴェルドゥーゴとビセンテ・ヘランツ=ペレスに特に感謝している。この作品の残りの部分は、ACA CELLバイオテクノロジーGmbHハイデルベルク、ドイツによってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アルブミンフラクション V | Roth | T8444.4 | |
| 抗GFAP Cy3抱合体 | メルクミリポア | MAB3402C3 | |
| 抗MAP2 アレクサフルオMAB3418A5 | メルクミリポア | ||
| 反ネスチン アレクサフルオ 488 | メルクミリポア | MAB5326A4 | |
| アンチTuj1 アレクサフルオア 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym 販売終了。Logos Biosystemsが製造した製品です。 |
| アスコルビン酸 2-リン酸 sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 無血清 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| 基本 FGF 溶液 | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | ナノサイズの磁気ビーズ |
| セルカウンティングスライド Luna | Biozym | 872010 | Biozym 販売終了。Logos Biosystemsが製造した製品です。 |
| チャンバースライド Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | エポキシ樹脂 |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | 販売終了.以下で入手可能: TMS-013-B |
| GDNF 組換えヒト | フィッシャー・サイエンティフィック (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-グルタミン |
| グルタルアルデヒドグレード | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| ヘパリンナトリウム細胞 | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| ヒト BDNF | フィッシャー・サイエンティフィック (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| クエン酸鉛 | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym 販売終了。Logos Biosystemsが製造した製品です。 |
| MACS バッファ | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada デジタル カメラ | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| ポリ-L-オルニチン | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| 瞬間接着剤-3 ロックタイト | ヘンケル | ||
| TEM FEI テクナイ G2 スピリット | FEI ヨーロッパ | ||
| ウルトラカット UC-6 | ライカ | ||
| ウラニルアセテート C | EMS | 22400 |
参考文献
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neur....
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再版と許可
