キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ

サマリー

個々の翻訳イベントを追跡することで、キャップ依存翻訳メカニズムの高解像度の運動研究が可能になります。ここでは、蛍光標識抗体とエピトープタグ付き新生ペプチドとのイメージング相互作用に基づく インビトロ 単分子アッセイを示す。この方法は、 インビトロ キャップ依存的なアクティブな翻訳中の開始およびペプチド伸長性キネティクスの単一分子特性を可能にする。

要約

キャップ依存性タンパク質合成は、真核細胞における主要な翻訳経路である。様々な生化学的および遺伝的アプローチにより、キャップ依存翻訳とその調節に関する広範な研究が可能になっているが、この翻訳経路の高解像度運動特性は依然として欠けている。最近では、キャップ依存性翻訳キネティクスを単一分子分解能で測定する インビトロ アッセイを開発しました。このアッセイは、蛍光標識された抗体が、新生エピトープタグ付きポリペプチドに結合することに基づいている。新生ペプチド-リボソーム-mRNA複合体との抗体の結合および解離をイメージングすることにより、個々のmRNA上の翻訳進行を追跡することができます。ここでは、mRNAおよびPEGylatedスライド調製物、翻訳のリアルタイムイメージング、単一分子軌道の解析など、このアッセイを確立するためのプロトコルを提示する。このアッセイは、個々のキャップ依存翻訳イベントの追跡を可能にし、開始率や伸長率などの主要な翻訳キネティクスを解決します。このアッセイは、明確な翻訳システムに広く適用することができ、キャップ依存翻訳キネティクスおよび翻訳制御機構の インビトロ 研究に広く役立つべきである。

概要

真核生物系における翻訳は、主に7-メチルグアノシン^(m7G)キャップ依存経路¹を介して起こる。研究は、真核生物翻訳の開始段階がレート制限であり^{、規則2、3、4}の共通の目標であることを示している。キャップ依存性翻訳のメカニズムは、遺伝的^5、生化学的^6、7、8、構造^9、およびゲノム¹⁰バルクアプローチを用いて広範囲に研究されてきた。これらの方法は、キャップ依存の開始を制御する多様なメカニズムを特定しましたが、その解決は、異種および非同期開始イベントからの信号のアンサンブル平均に制限されます。さらに最近では、生体内翻訳イベントの個々の可視化は、新生ポリペプチド11、12、13、14上のエピトープに結合する蛍光抗体を測定する方法によって可視化されている。しかし、これらの新しいアプローチは、複数の蛍光抗体が新生ペプチドに結合して、単一の翻訳事象を高細胞内蛍光のバックグラウンドから解決できるようにするために、個々の開始事象を解決する能力にも限界があります。多くの生物学的相互作用において、解決された個々の運動事象は、分子レベルで同期することができない複雑な多段階および反復的な生物学的プロセスを理解するための重要な洞察を提供してきた。キャップ依存の開始と規制をより深く理解するためには、個々の翻訳イベントのダイナミクスを追跡できる新しい方法が必要です。

我々は最近、単一分子分解能¹⁵を有するキャップ依存性開始運動を測定するインビトロアッセイを開発した。この開始経路^3,16に関与する既知および未知のタンパク因子の多数を考慮すると、単一分子アッセイは、細胞因子および堅牢な翻訳活性17、18、19、20、21、22、23、24、25の保存の恩恵を受けるために^、既存のインビトロ無細胞翻訳系と互換性があるように開発された。さらに、無細胞翻訳システムを使用することで、単一分子観測と以前のバルク結果との比較がより互換性があります。このアプローチは、キャップ依存開始の既存の機械化フレームワークに新しい単一分子運動学的洞察を簡単に統合することを提供する。単一分子アッセイを確立するために、従来の無細胞翻訳システムは3つの方法で修飾されます:エピトープコード配列はレポーターmRNAのオープンリーディングフレーム(ORF)の最初に挿入されます。レポーターmRNAの3′末端は、単一分子検出表面へのmRNA末端テザリングを容易にするためにビオチン化される。蛍光標識抗体は翻訳抽出物に補足されます。これらの修飾は、基本的な分子生物学の技術と一般的に入手可能な試薬のみを必要とします。さらに、これらの改変および単一分子イメージング条件は、バルク無細胞翻訳反応¹⁵の翻訳動態を維持する。

このアッセイ(図1)において、5′末端キャップおよび3′末端ビオチン化レポーターmRNAは、流れチャンバ内のストレプトアビジン被覆検出面に固定化される。流れチャンバは、次いで蛍光標識抗体を補充した無細胞翻訳混合物で満たされる。エピトープ配列^26,27の下流にある約30~40コドンに対するmRNA翻訳が行われた後^、エピトープはリボソーム出口トンネルから出現し、蛍光標識抗体と相互作用するようになります。この相互作用は迅速であり、単一分子蛍光イメージング技術による検出により、活性無細胞翻訳中の単一分子分解能による翻訳キネティックスの追跡が可能になります。このアッセイは、キャップ依存翻訳キネティクスとその規制、特に働くバルクインビトロアッセイを有するシステムに関するインビトロ研究に大きく利益をもたらすべきである。

この単一分子アッセイを確立するための前提条件は、働くバルク無細胞翻訳アッセイであり、市販または前に述べた方法²⁸に記載された翻訳抽出物を使用して達成することができる。真核生物翻訳抽出物は、真菌、哺乳類、および植物²⁸を含む多様な細胞から得ることができる。イメージングのために、このアッセイは、調整可能なレーザー強度と入射角度、電動サンプルステージ、電動流体システム、およびサンプル温度制御装置を備えたTIRF顕微鏡を必要とします。このような要件は、現代 のインビトロ 単一分子TIRF実験に対して一般的であり、異なる方法で達成され得る。ここで紹介する実験では、市販の顕微鏡、ソフトウェア、および付属品から構成される客観的なタイプのTIRFシステムを使用して、すべての 材料表に記載されています。

プロトコル

1. レポーターmRNAの生成

1. N末端エピトープタグエンコーディング配列を挿入して「タグ付けされた」レポーターmRNAのDNA転写テンプレートを生成することによって、一括アッセイ「タグなし」レポーターmRNAをコードするDNA転写テンプレートを修正する(図2A)。
   注:3xFLAG/アンチフラッグの相互作用は、その優れた感度と短い3xFLAGタグ長のために、このアッセイのために推奨されています。しかし、アッセイは他のエピトープ/抗体対と互換性があります。
2. 線形化された DNA テンプレートと in vitro トランスクリプション キットを使用して、タグ付けされていない RNA とタグ付き RNA を合成します ( 表を参照)。典型的には、 インビトロ 転写されたRNAの10〜20 pmolは、体系的な単一分子研究を可能にするために、その後のRNA処理に十分である。
3. メーカーの推奨に従って、M⁷Gキャッピングキット(材料表を参照)でRNA 5′末端(図2B)をキャップします。
4. キットに付属するプロトコルに従って、バイオタイニル化キット(材料表を参照)を使用して、RNA 3′末端(図2B)をビオチン化します。フェノールクロロホルム抽出でRNAを精製し、続いてスピンカラムで精製します。RNaseフリー水の10〜20 μLのELUTE RNA。上限のない入力RNAの約40~50%が回収されます。
5. 前述の²⁹に記載したように、アクリルアミドゲル電気泳動およびRNA染色を変性することによってRNAの完全性および濃度を評価する。
6. 3′末端ビオチン化されたタグ付きレポーターmRNAを用いてバルク無細胞翻訳³⁰ を行い、改変されたmRNAが関心のある翻訳特性を保持することを確認する。例として、キャップ依存翻訳は、バルク無細胞翻訳反応におけるレポーター活動を、上限のない制限付きのレポーター mRNA と比較することで確認できます ( 代表的な結果を参照)。

2. フローチャンバーの準備

1. 顕微鏡の目的仕様シートで指定された適切なカバースリップ厚さを選択します。目的またはプリズム型の全内部反射蛍光(TIRF)イメージングシステム³¹に対して、ガラスまたはクォーツスライドをそれぞれ選択する。
2. チャンドラドスら³² で説明したプロトコルに従って、クリーニング、サリン化、PEGylation、およびカバースリップのチャンバーアセンブリを行い、以下の変更を行う。
   1. 超音波処理で20分間、10%アルカリ性液体洗剤(v/v)に穴を開けた洗浄スライド。残りのすべてのクリーニングステップにスライドとカバーリップを組み合わせます。
   2. アセトン洗浄のステップをスキップします。ピラニアエッチングインキュベーション時間を20分から1時間に延長します。第1ラウンドのPEGylationを3時間インキュベートする。MS(PEG)₄ で第 2 ラウンドの PEGYL 化を 3 時間インキュベートします。

3. 設備準備

1. 1分子実験を行う前に少なくとも3時間、顕微鏡インキュベーターをオンにし、実験の過度の音響妨害を避けるために低速度に気流を減らします。インキュベーター温度を無細胞翻訳システムの最適温度に設定します。
   注: 翻訳は温度に非常に敏感です。最適な反応温度は、各細胞抽出系に固有です。反応温度特性解析は、バルク無細胞翻訳システムの開発において重要なステップです。この単一分子アッセイは、対応するバルク変換条件と同じ最適温度で行う必要があります。
2. 単一分子実験を行う前に、レーザーボックスの後ろのレーザー電源ボタンを押してレーザーをオンにし、レーザーの安全キーを回し、スタートボタンを押します。顕微鏡をオンにし、タッチスクリーンコントロールパネルをタップして、イメージングモード、目的、およびフィルタセットを選択します。
3. EMCCDカメラ、前段コントローラ、シリンジポンプの電源ボタンを押して電源を入れます。コンピュータとオープンソフトウェア のAndor Solis( ソフトウェア1)の電源を入れ、EMCCDカメラを制御し 、TirfCtrl( ソフトウェア2)でレーザーを制御し 、PriorTest( ソフトウェア3)でモーターを使用して制御し、 冷却機 を使用してシリンジポンプを制御します。データ取得が始まる前に、カメラを冷却して指定された動作温度まで安定させます。
4. ソフトウェア2では、レーザー波長、客観的タイプ、ガラスおよびサンプルの屈折率に対して正しいパラメータが設定されていることを確認します。[接続] ボタンをクリックします。レーザー強度を設定するには、レーザー波長の横にあるコントロールボタンをクリックし、レーザーコントロールポップアップウィンドウで強度スライドバーをドラッグします。ファイバー位置スライドバーをドラッグするか、対応する貫入深度を入力して、レーザーを希望の角度に設定します。イメージングを行わないときに、レーザーをオフモードに保つために、シャッターボックスがチェックされていることを確認します。
   メモ: シャッターボックスを チェックして、レーザーシャッターを開閉します。アッセイを最初に確立する際には、最適な単一分子検出のために異なるレーザー強度と入射角度をテストする必要があります。最適なレーザー強度は、蛍光蛍光と蛍光の速い光の漂白のバランスをとります。入射角度は、mRNA結合抗体が明確に解決されるまで、拡散標識抗体から高い蛍光バックグラウンドを低減するために臨界角を超えて増加させるべきである。参考として、Cy3標識抗FLAGを使用した研究15では、抗体あたり2〜7色素の標識比を用いた研究¹⁵ では、レーザー入射角度を71.5°に設定した目的で、532 nmレーザーを目的で10μWに設定しました。
5. ソフトウェア 1 で、取得モードで[キネティック] を選択し、露出時間、キネティックシリーズ長、および EM ゲイン値のパラメータを入力します。ディレクトリを選択し、データイメージファイルを保存するためのファイル名を割り当てます。
6. シリンジポンプを、後続のチューブ洗浄工程で適度な流量から速い流量に設定します。
   70%エタノールのアリコートをマイクロフュージチューブに入れ、シリンジポンプチューブエンドをエタノール溶液に挿入し 、Coolterm を使用してシリンジポンプを引き出しモードとディスペンスモード間で3回切り替えてチューブを洗浄します。RNaseフリーの水を使用して繰り返します。
   注: チューブの長さは、ステップ 5 で変換ミックスを分配して、シリンジではなくチューブに接触するだけの長さでなければなりません。ここでのすす量は、ステップ5の翻訳ミックスがサニタイズチューブと接触したままであることを保証するために、分配された翻訳ミックスの量よりも大きくする必要があります。
7. 最終的な水のすすが分配された後、きれいなティッシュのふき取りに管端を手を出すことによって管の内部から残りの水を取り除く。チューブエンドをクリーンマイクロフュージチューブに入れ、乾燥状態に保ちます。

4. 3'終末ビオチン化mRNAの固定化

1. 細胞抽出物と翻訳ミックスを使用直前までドライアイスで凍結状態に保つ。残りの凍結試薬を解凍し、氷の上に維持します。
2. カバースリップ側を下に向けて顕微鏡サンプルホルダーにフローチャンバーを置き、テープで所定の位置に固定します。テープを使用して、使用されていないフローチャネルの入口と出口をカバーします。
3. ピペットは、0.2 mg/mLストレプトアビジンの1.5x体積(チャネル体積に対して、ステップ4およびステップ5の他のステップにも適用)を流れチャネルに入れ、室温で10分間インキュベートする。
4. アンバウンドストレプトアビジンを除去するには、T50洗浄バッファー(20 mM Tris HCl、pH 7.0、50 mM NaCl、0.2 U/μL RNase阻害試薬)を洗浄ごとに3倍の容量でピペット処理してチャネルを洗浄します。
   メモ:液体廃棄物がチャネルに戻ってくるのを防ぐことが重要です。流路の出口が廃棄物収集管に接続されていない場合は、流出口の近くに折り畳まれたティッシュペーパーを置き、流路から流れ出る液体を吸収する。
5. 翻訳抽出物を移し、ドライアイスから氷に混ぜて解凍します。
6. 目的に浸漬油の滴を置きます。フローチャンバー付きの顕微鏡サンプルホルダーを顕微鏡ステージに入れます。客観的な浸漬油がカバースリップに接触するまで、目的をカバースリップに近づけます。サンプルステージを移動して、流路の位置が対物レンズの真上になるようにします。
7. ソフトウェア2では、レーザーシャッターを開き、レーザー強度レベルを調整します。
8. 顕微鏡コントロールのタッチスクリーンで、[ フォーカス ]タブを選択し、[ フォーカス検索 と 開始 ]ボタンをクリックします。フォーカスプレーンが正常に達成されるとビープ音が鳴ります。
9. ソフトウェア 1 で ライブ モードでフロー チャネル サーフェスをイメージ化します。タッチスクリーン上の細かいステップコントロールで目標位置を調整することで、より鮮明な画像に焦点を最適化します。
10. ソフトウェア3では、フローチャネル検出面の様々な領域における蛍光背景のレベルを評価するためにステージを移動する。蛍光が低い場合は、実験を続けます。蛍光の背景が過度に高い場合は、流路を破棄することを検討してください。
11. ソフトウェア 2 で、レーザー シャッターを閉じます。
12. 流路からT50洗浄バッファーをピペットアウトし、すぐに2倍の量のビオチン化mRNA溶液を流路にピペットします。15分間インキュベートします。
    注: mRNA調製の各バッチについて、mRNA濃度およびインキュベーション時間をテストして、単一分子検出に必要なmRNA表面密度を達成する必要があります。適切なmRNA表面密度は、〜5%以下の重なり合った蛍光スポットを示す抗体結合を媒介する( 代表的な結果を参照)。出発点として、2~20 nMの濃度でのビオチン化mRNAが推奨されます。
13. 洗浄ごとに3倍の翻訳対応バッファをピペット処理して、チャネルを3回洗浄します。

5. 翻訳ミックス組み立てと単一分子検出のためのフローチャネルへの配信

1. 氷上では、ステップ1.7からのバルク翻訳プロトコルに従ってマイクロ遠心チューブに翻訳ミックス^30の3 倍の容積を組み立てますが、mRNAを省略し、蛍光標識抗体の最適化された濃度で補います。マイクロ遠心チューブを簡単に回転させ、チューブの底部の翻訳ミックスを収集します。
   注:アッセイを確立する際、異なる抗体濃度がテストされます。最適濃度は、検出表面に対する非特異的抗体の低量および新生ペプチドへの高速抗体結合を示す(アッセイ較正詳細については、ステップ7.1および7.2.をそれぞれ参照)。
2. 0.7 mLマイクロフュージチューブキャップの内側に翻訳ミックスを移します。シリンジポンプを引き出しモードに設定します。ポンプチューブの端を翻訳ミックスに挿入します。ポンプチューブに翻訳ミックスを収集するために、スポイトの撤退を開始します。シリンジポンプ設定をディスペンスモードに戻し、翻訳ミックス配信に最適なレートに流れを設定します。
   注: ポンプチューブに移動する場合は、変換ミックスで泡が発生しないようにします。手順 3.6 でサニタイズおよびすすぎなかったチューブの部分に、翻訳ミックスを深く引き抜かないようにします。アッセイを確立する際、異なる送達流量をテストして最適な速度を決定します(アッセイキャリブレーションの詳細については、ステップ6.2を参照)。
3. チューブエンドと翻訳混合物の間にギャップがある場合は、シリンジポンプを開始し、翻訳混合物がチューブエンドに到達できるようにしてから、シリンジポンプを停止します。
4. ポンプチューブの端を流路の入口に差し込みます。接続を行う際に、変換ミックスに気泡を導入しないようにしてください。カスタムメイドの金属ブラケットを顕微鏡サンプルホルダープレートにねじ込んで、接続を安定させます。顕微鏡焦点とイメージング領域の蛍光を評価します。
   注:チューブは、前述の³³のようにカスタムパーツでフローチャンバにクランプすることができます。他のタイプの流体システムも、このアッセイ³⁴に使用することができる。視野は、チューブを接続する前後に類似した表示されます。接続後にさらに蛍光スポットが現れる場合、翻訳ミックスは送達チューブから漏れている可能性が高い。アプリケーションによっては、リークされた翻訳ミックスを持つチャネルを破棄する必要があります。
5. ムービー取得パラメータが正しいこと、およびファイル保存用の適切なファイル名とディレクトリが入力されていることを確認します。
6. フロー チャネル検出サーフェスの中央にある領域をイメージ化するためにステージを移動します。顕微鏡コントロールのタッチスクリーンで、[ 連続AF] タブを選択し、[ フォーカス検索 と 開始 ]ボタンをクリックして、実験中の焦点位置を維持します。フォーカスプレーンが正常に達成されるとビープ音が鳴ります。
7. ソフトウェア2で、レーザーシャッターを開きます。ソフトウェア 1 で、[シグナルの受け取り] ボタンをクリックして、録音を開始します。約 5 回の録音が終了したら、Cooltermで実行コマンドを入力して、変換ミックスをフロー チャネルに配信します。0.5~2 s/frameの時間分解能で最大2時間の記録。
   注:データ取得の最大スパンは、翻訳抽出物が時間の経過とともに活動を失う速さに依存し、ルシファーゼレポーターmRNAでバルク無細胞翻訳を行い、異^{なる時点で}の翻訳反応でルシファーゼ活性を測定することによって便利に特徴づけることができる。
8. データ取得が完了したら、レーザーをオフにし、顕微鏡コントロールタッチスクリーンの 連続AF をオフにして、フローチャンバーからチューブを分解します。
9. 流路入口から翻訳混合物をピペットアウトし、マイクロフュージチューブに移し、液体窒素にチューブを入れることで溶液をスナップフリーズします。その後、-80°Cで保管。
10. 注射器ポンプチューブをRNaseフリー水で3回洗浄し、その後70%エタノールで3回洗浄します。70%エタノールをシリンジポンプチューブに引き出して保管します。
11. 顕微鏡とすべてのアクセサリーをオフにします。片付ける。

6. データ分析

注:このアッセイのデータ解析には、単一分子生物物理学研究における一般的な方法が必要です。計算に負荷のかかるすべてのステップは、既存のアルゴリズムとソフトウェアを使用して達成することができます(参照は、対応するステップで以下に含まれています)。

1. オプション: 必要に応じて、取得したイメージ・シリーズ・ファイルを、選択したイメージ処理ソフトウェアまたはプログラミング言語と互換性のある形式に変換します。
2. 翻訳反応開始点と試薬交換時間を決定します。
   注:翻訳ミックス中の蛍光抗体の拡散により、翻訳適合バッファーから翻訳ミックスへのインチャネル試薬交換時に、画像領域のバックグラウンド蛍光強度が増加します。翻訳反応開始点は、試薬交換が完了した時点に設定される。この完了点は、翻訳ミックス配信中のバックグラウンド蛍光強度を測定し、後述するとおりに蛍光強度が高まる時点^を特定することによって見られる。
   1. 画像フレームあたりの合計蛍光度数を計算し、対応する時間プロファイルをプロットします。時間プロファイルプロットにおける全蛍光の急激な増加を特定します。
      注:全蛍光増加は、試薬交換中に蛍光標識抗体の濃度が増加したためです。
   2. 全蛍光上昇相の終点を特定し、この時点を翻訳反応の開始点(すなわち時間0)として設定する。全蛍光上昇フェーズの開始点と終点の両方を特定し、試薬交換時間として時間差を設定します。
      注: 試薬交換の合計時間は、流路の寸法と選択した流量によって異なります。試薬交換が完了する前に、いくつかの翻訳因子がmRNAへの結合を開始する可能性があり、決定された第1ラウンド開始時間の分解能を低下させる可能性があります。したがって、アッセイを設定する際に異なる流量をテストし、試薬交換完了を3~4 s以内でデータ取得速度0.5~2 s/frameに設定するフローレートを選択することをお勧めします。
3. オプション: ムービーのドリフト補正を実行します。
   注: データ画像内の結合抗体の位置は、顕微鏡部品や付属品のドリフトにより、時間の経過とともに変化する場合があります。映画で視覚的に目立つドリフトは、データ分析をさらに進める前に修正する必要があります。いくつかの空間ドリフト補正アルゴリズムとスクリプトが利用できます^36,37,38.
   1. 各画像では、ピクセル数で局所最大を見つけ、ピクセルレベルの精度で各フレーム内の結合抗体の位置を決定します。背景ノイズの上に明瞭に上にあるスポットのみが選択されるようにピクセル数のしきい値を設定します。
   2. 2つの連続した画像フレーム間の各方向における個々の抗体位置の変化を計算する。
   3. 2つの連続したフレーム間の抗体の位置変化のヒストグラムをプロットし、各方向に対して別々に行います。ガウスは各ヒストグラムにフィットし、2つの連続したフレーム間の方向ドリフトとしてピークの中心位置を設定します。
   4. 観測されたドリフトを打ち消すために、各画像フレームを計算されたドリフト量で反対方向にシフトします。
4. 単一分子軌道を構築する。
   注:検出/追跡ソフトウェアは、明るいスポットを識別し、データ画像シリーズ^39、40からそれらの強度を抽出するために利用可能です。
   1. ステップ6.3.1に記載された抗体位置を特定する。
      注: 選択したしきい値によってパーティクルの過剰な過剰または過小ピッキングが発生しないように、目視検査をお勧めします。識別された重心位置を各画像フレームに重ねて、その合意を視覚的に評価することで、目視検査を行うことができます ( 代表結果を参照)。
   2. すべてのフレームから選択したパーティクルを結合し、冗長パーティクルの位置を削除します。
   3. 結合抗体の画像を視覚的に検査し、個別に結合した抗体の背景および代表の上に明らかに上にある数をピクセルに囲む正方形の領域を選択します。
      注:点広がり関数(すなわち、単一分子の正方形の大きさ)は、光学的なセットアップおよび検出器のピクセルサイズによって決定される。
   4. 各パーティクル位置について、粒子位置の周りの正方形の全ピクセルの総強度を計算して、単一分子の軌道を構築します。軌道は、各位置、フレームごとに、およびデータムービー全体のために構築されます。
5. オプション:非線形前方後方フィルタ⁴¹ を適用して、単一分子軌道におけるバックグラウンドノイズを低減する。
6. オプション: 既存のステップ検出アルゴリズム^{42、43、44、45}を使用して軌道をデジタイズします。
   注: ステップ検出アルゴリズムの選択は、単一分子ダイナミクスの複雑さに依存します。単離されたリボソーム翻訳(すなわちポリソーム形成なし)と良好な信号対雑音比の最も単純なシナリオでは、蛍光カウントに対する閾値適用は、単一分子軌道における抗体結合および解離事象のタイミングを同定するのに十分である。各条件に対して少なくとも100の軌道を目視検査し、ステップ検出戦略によって軌道ステップが適切に選択されていることを確認することをお勧めします。
7. 各軌道の最初の抗体結合イベントの時間(すなわち、最初の到着時間、t1)を決定し、デジタル化された軌道を使用するか、またはデジタル化されていない軌道にしきい値を適用する。
   注: 最初の到着時刻分布の中央値は、異なる変換条件間で比較できます。あるいは、最初の到着時間分布をシフト(3パラメータ)対数正規関数に適合して、平均値¹⁵ を決定することもできます。最初の到着時間分布は通常歪んでいて尾が長いため、観測された最初の到着時間を直接平均化して平均を計算しないでください。
8. 任意:ドウェル時間分析と平均ペプチド合成速度の計算。
   1. デジタル化された軌道を使用して、各軌道の単数(単一リボソーム)翻訳イベントを識別し、単一結合事象のドウェル時間を、対応する抗体結合と解離イベントの時間差として計算します。
      注: 複数の分子事象が時間に重なっている場合、軌道をデジタル化するためのステップ検出アルゴリズムは一般に信頼性が低くなります。従って、多項イベントを住時間解析から除外することが推奨されます。ポリサムイベントで富化され、あまり単一の事象を表示しない高活性翻訳系では、標識された抗体と標識されていない抗体の混合物を使用して、単一分子軌道における単離翻訳事象を観察する機会を増やすことができます。
   2. 分布を対数正規関数に適合させ、適合関数を使用して平均ドウェル時間を計算します。
      注: 観測されたドウェル時間を平均して平均化して平均値を計算することは、通常、長い尾で歪んでいるため、推奨されません。
   3. ORFコドンの総数からエピトープアミノ酸長と35(リボソーム出口トンネル内の新生ペプチドの平均アミノ酸長)の合計を差し引くことによって、抗体結合ドウェル時間中に翻訳されるアミノ酸の数を決定する。
   4. 平均ペプチド合成速度を決定するために、翻訳されたアミノ酸の数を平均ドウェル時間で割った。
9. オプション: 平均最初のラウンド開始時間 (<t_{1_I}> ) の計算。
   注: 開始部位のシーケンスコンテキストやコーディングシーケンスなどの開始および伸び条件は、一般的に開始動態の研究のために意図的に保存されます。したがって、ステップ 6.7 からの平均最初の到着時間 <t₁> です。異なる条件間の第1ラウンド開始運動学の変化を計算するために直接使用することができる。次の修正は、最初のラウンド開始時間の実際の値を決定する場合にのみ必要です。
   1. エピトープ長と35(リボソーム出口トンネル内の新生ペプチドの平均アミノ酸長)の合計を平均ペプチド合成速度(ステップ6.8.4から)で割り、このN末端領域の平均ペプチド伸長時間()を計算する。
   2. 最初の到着時刻は最初のラウンド開始時刻とt_{1_tag}の合計なので、平均最初の到着時間 <t₁> から <t_{1_tag}> を引いて平均 1 次開始時間 <t_{1_I}> 1_I 1_tag = <t₁> <> > >

7. アッセイキャリブレーション

注:アッセイを最初に確立する際には、次のキャリブレーション手順を実行します。

1. 抗体結合特異性を調べるには、タグなし mRNA とタグ付き mRNA について、セクション 4 と 5 のプロトコルステップを別々に実行します (図 2)。これらのそれぞれのmRNAを有するチャネルにおける抗体結合レベルは、検出表面および特異的抗体が新生ペプチドに結合する非特異的抗体の程度を表す。
   注: 非特異的結合比に固有の値は>10とすることが推奨され、異なる表面パッシベーション戦略、抗体濃度の低下、または高いmRNA表面密度で増加する可能性があります。
2. 抗体結合速度を測定するには、ステップ4とステップ5の間に追加のステップでプロトコルを実行します。
   1. ステップ4の後、mRNA/リボソーム/ペプチド複合体を前生成する抗体を欠いている翻訳混合物でチャネルをインキュベートする。
   2. その後、ステップ5に進み、抗体補充翻訳混合物をチャネルに流します。
   3. 最初の到着時ヒストグラムに指数的なフィッティングを用いて、前生成された新生ペプチドへの平均抗体結合率を定量化する。
      注:抗体は、事前に生成されたペプチドに対して迅速かつ迅速に、秒の順序で、翻訳の動態よりも速くする必要があります。より高い抗体濃度を用いてもよいし、抗体結合速度を高めるために使用されてもよい。
3. フルオロフォア標識抗体のフォトタビリティ
   1. ステップ 2 のプロトコルに従ってスライドを準備しますが、PEGylation ステップはスキップします。食合工程後に流れチャンバを組み立てます。シランコーティングにより、検出表面に対する効率的な非特異的抗体結合が可能になります。
   2. 蛍光標識抗体をチャネルに加えて、検出表面に結合する非特異的抗体の単一分子密度を達成します。T50洗浄バッファーで高希釈された蛍光標識抗体を添加し、所望の単一分子密度が達成されるまで徐々に抗体濃度を増加させます。
   3. 蛍光抗体の大部分が検出できなくなるまで、検出面を画像化する。
   4. 蛍光色素による抗体の蛍光損失率を評価するために、一定期間にわたって可視抗体の総数をプロットします。
      注:抗体標識は、通常、抗体ごとに複数のフルオロフォアを生み出します。個々の抗体は、すべての結合フルオロフォアフォトブリーチまで検出可能なままです。

結果

記載されたプロトコルに従って、3'末端テザリングレポーターmRNAの活性無細胞翻訳中に単一分子分解能を有する新生N末端タグ付きポリペプチドとの個々の抗体相互作用のイメージングを可能にする(図1)。最小の実証実験は、3つの合成mRNAを使用して報告されます: LUC (タグなしルシファーゼをコード化), LUC_FLAG (3xFLAGタグ付きルシファーゼをコード),およびhp-LUC_FLAG (5' リーダー領域で安定したステムループを持つLUC_FLAG) (図2C).ルシメラーゼコードmRNAを使用することで、単一分子観測とバルク発光測定の比較が可能になります。3'ビオチン化mRNAの完全性を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)およびRNA染色を変性することによって評価した。良質のmRNAは単一のクリーン...

ディスカッション

一般的なインビトロTIRF単一分子実験と比較して、ここで説明するアッセイによる単一分子イメージングは、細胞抽出物および蛍光標識抗体の高濃度の使用による追加的に複雑である。1ラウンドの表面PEGylationの一般的な手法と比較して、PEGylationの第2ラウンド(ステップ2)は、検出面¹⁵に結合する非特異的抗体を大幅に減少させる。蛍光性抗体の拡散濃度が高いと、極めて高い蛍光バックグラウンドが生じ、抗体結合の単一分子検出がマスクされます。この蛍光背景を低減するために、レーザー入射角度は臨界角より大きく増加する(ステップ3.4)。抗体検出は、過剰なフルオロフォア不安定性によっても減少し、住み込み時間を定量化する能力を制限する可能性があります。この問題が発生した場合、蛍光方を、三重状態のクエンチャー⁴⁷に結合したものなど、よりフォト可能な蛍光方に置き換えるか、レーザー照明強度を低下させる。酸素清掃システムは、フルオロフォア光化^を抑制するインビトロ単分子実験で一般...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100X オイル対物レンズ、N.A. 1.49	オリンパス	UAPON 100XOTIRF
アクリルミド/ビス (40%, 19:1)	バイオ・ラッド	161-0144
アルカリ性液体洗剤	デコン	5332
アミノシラン (N-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピルトリメトキシシラン)	UCT Specialties, LLC	A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD	Andor	DU-897U-CSO-#BV
Andor Solisソフトウェア	Andor		Andor EMCCD
バンドパスフィルター	Chroma	532/640/25
バンドパスフィルター	Chroma	NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA	Laysan Bio Inc	Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A 遊離酸	Prolume	309-250
Cooltermソフトウェア			シリンジポンプの制御用
デスクトップコンピュータ	Dell		顕微鏡、カメラ、ステージ、ポンプの制御用。
ダイクロイックミラー	Semrock	R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX	フィッシャーサイエンティフィック	NC1139450
デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム	Promega	E1910
エポキシ	Devcon	14250
ホタルルシフェリン D-ルシフェリン遊離酸	Prolume	306-250
氷酢酸	フィッシャーサイエンティフィック	BP1185500
ペリオキシド水素	シグマアルドリッチ	216763-500ML
浸漬油	オリンパス	Z-81226A	低自家蛍光
ルシフェラーゼアッセイシステム	プロメガ	E1500
スクリプトT7転写キット	サーモフィ	ッシャーAM1334
メタノール	フィッシャー科学	MMX04751
顕微鏡	オリンパス	IX83
顕微鏡スライド	Thermo Scientific	3048
モノクローナル抗FLAG M2-Cy3	Sigma-Aldrich	A9594
mPEG-SVA	Laysan Bio Inc	mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4	Thermo Scientific	22341
NaCl (5M)	Thermo Scientific	AM9760G
No 1.5 顕微鏡 カバーガラス	フィッシャーバンド	12-544-C
オリンパス レーザー、532nm 100mM	オリンパス デジタル レーザーシステム	CMR-LAS 532nm 100mW
オリンパス TirfCtrl ソフトウェア	オリンパス		レーザー強度と入射角の制御用
光学テーブル	TMC 振動制御	63-563	防振フェ
ノールクロロホルムイソアミルアルコールミックス	Sigma-Aldrich	77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit	Thermo Scientific	20160
水酸化カリウムペレット	Sigma-Aldrich	P1767-500G
Prior 電動XY翻訳ステージ	Prior	PS3J100
Prior PriorTestソフトウェア	前		以前の電動ステージを制御するため
組換えRNasin RNase阻害剤	Promega	N2515
ステージトップインキュベーター	生体内科学(世界の精密機器)	98710-1	カスタムメイドのアクリルケージ付き
染色ジャー	フィッシャーサイエンティフィ	08-817
ストレプトアビジン	サーモサイエンティフィック	43-4301
硫酸	フィッシャー・サイエンティフィック	A300212
SYBR グリーン II	フィッシャー・サイエンティフィック	S7564
シリンジ	ハミルトン	1725RN
シリンジ・ポンプ	ハーバード・デバイス	55-3333
トリス (1M)、pH = 7.0	サーモ・サイエンティフィック	AM9850G
超音波浴	ブランソン
尿素	Sigma-Aldrich	U5378-500G
ワクシニア キャッピング システム	ニューイングランド バイオラボ	M2080S
Zymo-Spin IC カラム	Zymo Research	C1004