エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略

サマリー

ここでは、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりを組み合わせて、遺伝子トランスフェクションやレトロウイルスベクターを必要とせずに哺乳類の多能性細胞を効率的に生成する方法を紹介します。したがって、この戦略はトランスレーショナル医療にとって有望であり、幹細胞オルガノイド技術の顕著な進歩を表しています。

要約

細胞表現型は、各技術に固有の利点および制限を有する、異なる方法で逆転または改変することができる。ここでは、哺乳類の多能性細胞を生成するために、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりを組み合わせた新しい戦略について説明します。主に 2 つの手順が必要です。第1のステップでは、成体成熟(末端分化)細胞をエピジェネティック消しゴム5-アザ-シチジンに曝露し、多能性状態に駆動する。プロトコルのこの部分は、細胞の運命と分化を制御するエピジェネティックなメカニズムの理解の高まりに基づいて開発され、エピジェネティック修飾剤を使用して細胞の分化状態を消去し、その後、一時的な高可塑性ウィンドウに駆動することを含む。

第2のステップでは、消去された細胞は、液体大理石としても知られるポリテトラフルオロエチレン(PTFE)マイクロバイオリアクターに封入され、3D細胞の再配列を促進し、獲得した高い可塑性を伸長および安定に維持する。PTFEは非反応性疎水性合成化合物であり、その使用は、従来の2D培養システムでは達成できない細胞微小環境の創出を可能にする。このシステムは、バイオメカノセンシング関連の手がかりを通じて多能性の維持を奨励し、促進する。

ここで説明する技術的手順は、成体体細胞における高い可塑性状態の誘導および維持を可能にするための単純な戦略である。このプロトコルは、試験したすべての哺乳動物種における可塑性の高い細胞の誘導を可能にした。遺伝子トランスフェクションの使用を伴わず、ウイルスベクターを含まないため、トランスレーショナルメディシンアプリケーションにとって顕著な技術的進歩を表す可能性があります。さらに、マイクロバイオリアクターシステムは、可塑性の高い細胞、すなわちESC、iPSC、エピジェネティックに消去された細胞およびMSCの長期培養を可能にする特定の微小環境をin vitroで再現することにより、幹細胞オルガノイド技術の顕著な進歩を提供する。

概要

過去数十年間、細胞の関与と分化に向けた一方向の進行という広く受け入れられている概念は完全に改訂されました。セルの仕様を逆転させることができ、最終分化したセルを、異なる方法を使用して、あまりコミットされず、より高い許容状態にプッシュできることが実証されています。

提案されているいくつかの方法の中で、最も有望な方法の1つは、いわゆる化学的に誘導された多能性に細胞を誘導するための化合物の使用を含む。このアプローチで使用される小分子は、成体成熟細胞のエピジェネティックなシグネチャーと相互作用および修飾することができ、トランスジェニックおよび/またはウイルス^{ベクター1}、²、³、⁴、⁵、⁶、⁷、^8、9、10の必要性を回避することができる。.多数の研究が最近、高メチル化遺伝子の再活性化を誘導する特定の生化学的および生物学的刺激を提供することによって、細胞をある表現型から別の表現型に切り替えることが可能であることを示している¹¹、12、13^、14、15。これらの脱メチル化事象は、最終分化細胞を原始的前駆細胞、多能性または高可塑性/多能性細胞¹、²、³、⁴、⁵、^6、7、⁸、^9、10に変換することを可能にする。

並行して、多くの研究は最近、機械化関連の手がかりの理解、より具体的には、機械的力を使用して細胞の可塑性および/または分化に直接影響を与える可能性に焦点を当てている^16,17,18,19。実際、細胞外マトリックス(ECM)が細胞運命の制御において重要な役割を果たしていることが明確に実証されている。特に、ECMによって産生される生体力学的および生物物理学的シグナルは、分子機構およびシグナル伝達経路を直接調節し、細胞の挙動および機能に影響を及ぼす^20、21。これらの最近のデータは、in vivo細胞微小環境をより厳密に模倣し、細胞挙動を駆動する機械的および物理的刺激を複製する新しい3D培養システムの開発への道を開いた。

ここでは、哺乳類の多能性細胞を生成するために、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりの使用を組み合わせた2段階のプロトコルについて説明します。第1の工程では、細胞を脱メチル化分子5−アザ−シチジン(5−アザ−CR)と共にインキュベートする。この薬剤は、直接テン-イレブン転座2(TET2)媒介作用^8,10およびDNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)^22,23の間接阻害の併用効果を通じて、有意なグローバルDNA脱メチル化を誘導することができる。この工程は、多能性関連遺伝子発現のその後の再活性化を伴うエピジェネティックブロックの除去を誘導し、したがって、可塑性の高い細胞¹、²、³、^8、10、以下「エピジェネティック消去細胞」という。第2のステップでは、細胞は3D培養系に封入される。この目的のために、非反応性疎水性合成化合物ポリテトラフルオロエチレン(PTFE;粒径1μm)がマイクロバイオリアクターとして使用され、従来の2D培養システム¹⁰の使用によって達成不可能な細胞微小環境の創造を可能にする。PTFE粉末粒子は、細胞が再懸濁され、液体コアを支持表面から隔離する液体滴の表面に付着し、内部液体と周囲環境²⁴との間のガス交換を可能にする。このようにして得られた「PTFEマイクロバイオリアクター」は、「液体大理石」とも呼ばれ、細胞同士の自由な相互作用を促し、3D細胞再構成^25,26,27を促進し、バイオメカノセンシング関連の手がかり¹⁰を通じて獲得した高い可塑性状態を延長し、安定に維持する。

プロトコル

すべての研究は、ミラノ大学の倫理委員会によってレビューされ、承認されました。すべての動物実験は、米国国立衛生研究所(NIH)が発行した実験動物のケアと使用のためのガイドに従って実施されました。健康な成人からのヒト細胞単離は、ミラノのマッジョーレ・ポリクリニコの倫理委員会によって承認された。我々の研究におけるすべての方法は、承認されたガイドラインに従って実施された。

1. 皮膚線維芽細胞の単離

注:以下に記載するすべての手順は、マウス、ブタ、およびヒトを含む異なる哺乳動物種から単離された線維芽細胞に適用することができる。7週齢の雄マウスからマウス細胞を単離し、ブタ皮膚組織を地元の屠殺場で採取した。ヒト細胞は、書面によるインフォームドコンセントの後、成人患者から単離した。

1. 1%ブタゼラチン溶液を調製する。
   1. ブタゼラチン0.1gの重さを量り、100mLの水に溶かす。ゼラチン溶液は、使用前にオートクレーブ処理で滅菌してください。
   2. 調製した溶液1.5mLを加えることによって0.1%ブタゼラチンで35mmシャーレをコーティングする。室温で2時間インキュベートする。
2. 哺乳動物(マウス、ブタ、およびヒト)の皮膚生検を長さ約2〜5cm切断し、2%抗生物質抗真菌溶液を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れる。使用時まで+ 4°Cで保存してください。
   注:生検の収集は、確立されたガイドラインに従って、倫理委員会の承認を得て実施する必要があります。
3. 採取した生検を2%抗生物質抗真菌溶液を含む新鮮な滅菌PBSで3回広範囲に洗浄する。
4. 最後の洗浄から生検を収集し、滅菌された100mmのペトリ皿に入れる。滅菌メスを使用して、それらを約^2mm3 サイズの断片に切断する。
5. 2時間のインキュベーションの終わりに、35mmペトリ皿から過剰のゼラチン溶液を除去し(ステップ1.1.2に記載)、滅菌手術ピンセットを使用して、直ちに5〜6個の皮膚断片を各プレコーティング培養皿に入れる。
6. 線維芽細胞分離培地(表1)の液滴をそれぞれに100μL加えて断片を湿潤させた。5%_CO2 インキュベーター中で37°Cで培養する。
   注:培地が蒸発するのを防ぐため、35 mmのペトリ皿を滅菌水を含む100 mm以上のペトリ皿の中に置きます。両方のペトリ皿をキャップするようにしてください。
7. 24時間培養後、35mm培養シャーレ内の培地の量を確認する。必要に応じて、500 μLの線維芽細胞分離培地を加えて断片を濡らしておく。
8. 培地を慎重に取り出し、ピペットを使用して培養の少なくとも2日ごとにそれをリフレッシュする。
9. 線維芽細胞が35mmシャーレに置かれた皮膚断片から成長し始めると(ステップ1.5に記載)、細胞単層を形成し始める(通常6日間)。滅菌外科用ピンセットを用いて皮膚片を取り出し、2mLの線維芽細胞単離培地中で培養した。
10. 細胞単層を5%_CO2 インキュベーター内で37°Cで80%コンフルエントになるまで培養し続け、1日おきに培地をリフレッシュした。

線維芽細胞初代細胞株培養

1. 線維芽細胞が80%コンフルエントに達したら、線維芽細胞単離培地を慎重に除去し、1%抗生物質抗真菌溶液を含むPBS3mLで細胞を3回洗浄する。
2. 細胞剥離のために、培養皿に600 μLの0.25%トリプシン-EDTA溶液を加え、37°Cで3〜5分間インキュベートする。
3. 5.4 mLの線維芽細胞培養培地を加え、細胞が培養皿から剥離し始めたときにトリプシンを中和した(表1)。
4. 反復的かつ穏やかなピペッティングによって細胞を脱落させる。プレート細胞を新しい培養皿(ゼラチンなし)に入れ、継代比を1:2〜1:4(増殖速度に依存する)に保つ。
   注:遠心分離は必要ありません。
5. 培養中の細胞を維持し、それらが80%のコンフルエントに達するまで2日ごとに培地を交換し、それらを継代する。
   注:線維芽細胞を週に2回増殖させ、活発な成長を維持します。

3. 5-アザ-CRへの線維芽細胞曝露

1. 新鮮な1 mM 5-アザ-CRストック溶液を調製する。
   1. 2.44mgの5-アザ-CRの重量を量り、10mLのDMEM高グルコースに溶解する。渦巻きによって粉末を再懸濁させる。溶液を0.22μmフィルターで滅菌する。
      注:5-aza-CRストック溶液は、使用直前に調製する必要があります。
   2. 5-aza-CRストック溶液(3.1.1.1.)を1 mLの線維芽細胞培養液で1 μL希釈して5-aza-CR作業溶液を調製する。
      注:5-アザ-CR作動溶液の濃度は1μM 1,2,3,8,9である。
2. 前述のように細胞をトリプシン処理し(2.1.-2.3.)、繰り返し穏やかにピペッティングすることによって細胞を取り除きます。
3. 細胞懸濁液を収集し、円錐形のチューブに移す。
4. 室温で光学顕微鏡下の計数チャンバを用いて細胞を計数する。細胞を再懸濁するのに必要な培地の体積を計算し、1 μM 5-aza-CRを添加した30 μLの線維芽細胞培養培地中の^{4 x 104} 細胞を得た(ステップ3.1.2参照)。
   メモ: 使用する式は、チャンバーの特定のタイプによって異なります。
   
5. 細胞懸濁液を室温で5分間150 x g で遠心分離する。上清を除去し、ペレットを1μM 5-aza-CRを添加した線維芽細胞培養培地で再懸濁した(ステップ3.1.2参照。使用する線維芽細胞培養液の容量については、工程3.4を参照されたい。
   注:ネガティブコントロールとして、5-aza-CRを含まない線維芽細胞培養培地に同じ濃度の細胞を再懸濁し、PTFE粉末への細胞封入を進める(ステップ4.1.-4.13。

4. PTFEマイクロバイオリアクターにおける線維芽細胞のカプセル化

1. 35mmのシャーレにポリテトラフルオロエチレン(PTFE)粉末を充填し、ベッドを製造した(図1A)。
   注:液体大理石の付着を避けるために、35mmの細菌学ペトリ皿を使用してください。薄い疎水性および多孔質シェルを得るためには、平均粒径1μmのPTFE粉末を使用し、最大粉砕物2.0NPIRIで製造する。これにより、気体透過性の液体大理石の作成が可能になります。さらに、透光性コーティングは、リアルタイムでの細胞凝集プロセスの観察を容易にし、より大きな粒径は、蒸発の上昇、変形および球形の喪失、ならびにマイクロバイオリアクターの早期溶解を引き起こす可能性がある高い多分散性をもたらす。
2. 4 x 104^個の細胞 を含む 30 μL の単一液滴 (ステップ 3.4.-3.5 を参照) を粉末床に分注します (図 1B)。
3. 35mmのシャーレを円運動で静かに回転させ、PFTE粉末が液体滴の表面を完全に覆うようにして、液体大理石のマイクロバイオリアクターを形成します(図1C)。
4. 1,000 μLのピペットチップを使用して液体大理石マイクロバイオリアクターを拾い上げ、エッジで切断し、大理石の直径を収容する(図1D、E)。液体大理石のマイクロバイオリアクターを清潔な細菌学ペトリ皿にプレートして安定化させます(図1F)。
   メモ: 先端の内側の大理石をつかむための摩擦を引き起こすには、液体大理石の直径よりわずかに小さい直径のピペットチップを切断します。
5. 液体大理石マイクロバイオリアクターをペトリ皿から96ウェルプレート(1つの大理石/ウェル)に移します(図1G)。
6. ウェルの縁から100μLの培地をゆっくりと加える。マイクロバイオリアクターは、培地の上に浮かび始めます(図1H)。
   注:マイクロバイオリアクターは、PTFE疎水性の破壊のために、直接液体接触で壊れる。代替アプローチとして、液体大理石マイクロバイオリアクターを35mmの細菌学培養皿に個々に配置することができる。この場合、液体大理石の蒸発を防ぐために、マイクロバイオリアクターを含む35mmのシャーレを100mmのシャーレに挿入し、滅菌水で事前に割り振る必要があります。
7. 液体大理石マイクロバイオリアクターを5%_CO2インキュベーター1、2、3、8^、9中で³⁷°Cで¹⁸時間インキュベートする。
   注:1μmのPTFE粒径は、内部液体と周辺環境との間の最適なガス交換を保証することができる。
8. 5-aza-CRインキュベーションを18時間行った後、エッジで切断した1,000 μLのピペットチップを用いて液体大理石マイクロバイオリアクターを回収する(ステップ4.5参照)。
9. マイクロバイオリアクターを新しい35mm細菌学ペトリ皿に入れる(図1D-F)。
10. 針を使って液体大理石を穿刺し、それを壊す。
11. 形成されたスフェロイドを200 μLのピペットチップで回収し、エッジで切断し、実体顕微鏡下で(図1I、J)。
    注:PTFEに封入されたエピジェネティックに消去された細胞は、3D球状構造(各液体大理石に1つの凝集体)を形成する。
12. 5-aza-CRに応答した多能性状態の獲得を評価するために、定性PCRにより、多能性関連遺伝子発現OCT4、NANOG、REX1、およびSOX2の発症を確認する(表2)。
13. 以下で説明するように、プロトコルの 2 番目のステップに進みます。

5. エピジェネティック消去細胞のPTFEマイクロバイオリアクターでの培養

1. 新鮮なESC培養液を調製する(表1)。
2. オルガノイドを、5−アザ−CR残留物を洗浄するためのESC培地を含むシャーレに移す(ステップ5.1.〜5.2を参照されたい)。
3. PTFEパウダーベッドを含む新しい35mm細菌学ペトリ皿を準備する(ステップ4.1も参照のこと)。
4. 200 μL のピペットチップを使用して、30 μL の ESC 培養培地の液滴中の単一のオルガノイドを粉末床に分注し、端で切断します (ステップ 4.9 を参照。5.3.).
5. 35mmのシャーレを円運動で静かに回転させて新しい液体大理石マイクロバイオリアクターを形成し、1,000μLのピペットチップを使用してそれを拾い上げ、端で切断し、新しく形成されたマイクロバイオリアクターを96ウェルプレート(1つの大理石/ウェル)のウェルに入れます(ステップ4.3.-4.6を参照)。
6. マイクロバイオリアクターを浮かべるには、ウェルの縁から100μLの培地を加えて大理石をゆっくりと浸します(注4.7参照)。
7. 培養液は大理石マイクロバイオリアクターで37°Cで、必要な限り5%_CO2 インキュベーター内で培養する。5.3.-5.7で説明されている手順に従って、1日おきに培地を交換してください。
   注:本原稿では、オルガノイドを28日間培養して得られた結果を提供する。ただし、必要に応じてより長い培養期間を行うことができる。

結果

本プロトコールは、成体体細胞から哺乳動物多能性細胞を生成しかつ安定に維持するために行われるべき全てのステップを記載する。この方法は、異なる哺乳動物種、すなわちマウス、ブタおよびヒトから単離された線維芽細胞で成功している。ここで報告される代表的な結果は、起源の種のそれぞれにかかわらず、すべての細胞株から得られている。

形態学的分析は、脱メチル化剤5-aza-CRとの18時間のインキュベーション後、PTFEマイクロバイオリアクター(3D Post 5-aza-CR)に封入された線維芽細胞が凝集し、考慮された3つの種すべてにおいて、均一なサイズの幾何学的形状を示す3D球状構造を形成したことを示している。(図2A-C、3Dポスト5-アザ-CR)。86.31±封入された細胞の4.13%がそれらの表現型を著しく改変し、典型的には高い可塑性表現型に関連する特徴を示す⁸。対照的に、2D標準条件に培養した後の5−aza−CR細胞は、典型的な線維芽細胞細長い形状...

ディスカッション

過去数十年間、いくつかの研究は、終末分化した細胞をあまりコミットされておらず、より高い許容状態に戻すための戦略の開発に焦点を当てていました。ここに記載されるプロトコルは、成体成熟末端分化細胞から始まる多能性細胞の生成および長期維持を可能にする。この方法は、化学的エピジェネティック消去およびその後の3D培養システムを使用して保証されるその維持によって達成される高い許容状態の誘導を含む2つの独立したステップを組み合わせる。

PTFE内包細胞で観察された3Dスフェロイド構造の形成(図2)は、細胞凝集を効率的に促進するPTFEの能力を実証する他の研究と一致し、嗅覚被覆細胞(OEC)スフェロイド構造²⁵の確立または3Dトロイダル凝集体²⁶の形成を促進する。これらの形態学的変化は、多能性関連遺伝子発現の発症(図3、図4、図5)と平行しており、2D後5-aza-CR細胞(図3、図

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-メルカプトエタノール	Sigma-Aldrich	M7522	ESC培地の成分
5-アザシチジン	Sigma-Aldrich	A2385	5-aza-CR、線維芽細胞エピジェネティック消去用
アデノシン	Sigma-Aldrich	A4036	ESC培地用ヌクレオシドミックスの成分
抗生物質 抗真菌剤溶液 (100回;)	Sigma-Aldrich	A5955	線維芽細胞およびESC培地の成分
CFX96 リアルタイムPCR	バイオ・ラッド・ラボラトリーズ	NA	定量PCR用サーマルサイクラー
シチジン	Sigma-Aldrich	C4654	ESC培地用ヌクレオシドミックスの成分
DMEM、高グルコース、ピルビン酸	サーモフィッシャーサイエンティフィック	41966052	線維芽細胞の単離および培養培地用
DMEM、低グルコース、ピルビン酸	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31885023	ESCミディアム
ダルベッコ用S Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D5652	PBS; for biopsy and cell wash and solution
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit	Thermo Fisher Scientific	61021	mRNA estraction
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein	Sigma-Aldrich	ESG1106	Component of ESC medium
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10500064	線維芽細胞およびESC培地の成分
FGF-Basic (AA10-155) 組換えヒトタンパク質	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PHG0024	ESC培地の成分
豚皮からのゼラチン	Sigma-Aldrich	G1890	ディッシュコーティング用
GeneAmp PCRシステム 2700	Applied Biosystems	NA	定性的PCR用サーマルサイクラー
グローバルDNAメチル化 ELISAキット	CELL BIOLABS	STA-380	メチル化研究
GoTaq G2 Flexi DNA ポリメラーゼ	Promega	M7801	定性的PCR
グアノシン	Sigma-Aldrich	G6264	ESC用ヌクレオシドミックスの成分
ハムのF-10栄養ミックス	サーモフィッシャーサイエンティフィ	31550031	ESC用ミディア
ノックアウト血清交換	サーモフィッシャー科学	10828028	ESC培地の成分
KOVA グリッド付きガラススライド10	Hycor Biomedical	87144	細胞計数用
ライカMZ APO 実体顕微鏡	ライカ	NA	オルガノイド観察用
L-グルタミン溶液	Sigma-Aldrich	G7513	線維芽細胞およびESC培地の成分
MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11140035	ESCミディアムのコンポーネント
Millex-GS 0.22 µmポアフィルター	ミリポア	SLGS033SB	溶液滅菌用
M-MLV 逆転写酵素、RNase H マイナス、点変異体	プロメガ	M3681	mRNA 逆転写
ムルチスカン FC マイクロプレート 光度計	サーモフィッシャーサイエンティフィック	51119000	ELISAプレート読み取り用
ニコンエクリプス TE300 逆位相コントラスト顕微鏡	ニコン	NA	細胞用観察
パーキン・エルマー サーマルサイクラー 480	パーキン・エルマーNA		逆転写用サーマルサイクラー
ポリ(テトラフルオロエチレン) 1 μm 粒径	Sigma-Aldrich	430935	マイクロバイオリアクターの生成用
PureLink Genomic DNA Mini Kit	サーモフィッシャーサイエンティフィック	K182001	ゲノムDNAエストラクション
TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AM1728	定量PCR
チミジン	Sigma-Aldrich	T1895	ESC培地用ヌクレオシドミックスの成分
組織培養ディッシュ100X20 mm、標準	Sarstedt	833902	線維芽細胞分離用
組織培養ディッシュ35X10 mm、	Sarstedt	833900	線維芽細胞分離
用組織培養ディッシュ35X10 mm、懸濁液	Sarstedt	833900500	Bacteriologyペトリ皿液体大理石培養
用組織培養プレート96ウェル、標準、F	Sarstedt	833924005	液体大理石培養用
トリプシン-EDTA溶液	Sigma-Aldrich	T3924	線維芽細胞解離
用 チューブ 15ml、120x17mm、PS	Sarstedt	62553041	細胞懸濁液遠心分離用
Uridine	Sigma-Aldrich	U3003	ESC培地用ヌクレオシドミックスの成分