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方法論記事

免疫反応向上技術を用いた超高速ウェスタンブロット

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DOI:

10.3791/61657

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2020年9月26日

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1Laboratory of Developmental Neurobiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2United Graduate School of Drug Discovery and Medical Information Sciences, Gifu University

この記事について

サマリー

超高速ウェスタンブロッティング技術は、免疫反応促進剤と組み合わせて、環状ドレインおよび補充(CDR)技術を介して抗原抗体結合の運動を改善することによって開発される。

要約

ウェスタンブロット(免疫ブロットとも呼ばれる)は、生物医学研究のための正規の方法です。これは、特定のタンパク質の相対的なサイズと存在量だけでなく、翻訳後のタンパク質修飾を決定するために一般的に使用されます。この技術は豊かな歴史を持ち、そのシンプルさのために広く使用されています。しかし、ウェスタンブロッティング手順は、スループットを制限する長いインキュベーション時間であるという重大なボトルネックで、完了までに数時間、さらには数日かかることで有名です。これらのインキュベーションステップは、バルク溶液から膜上の固定化された抗原への抗体の拡散が遅いために必要とされる:膜付近の抗体濃度はバルク濃度よりもはるかに低い。ここでは、抗体溶液の循環ドレインおよび補充(CDR)による抗原結合を改善することにより、これらのインキュベーション間隔を劇的に短縮するイノベーションを提示する。また、免疫反応増強技術を用いて、アッセイの感度を維持しました。市販の免疫反応増強剤とのCDR法の組合せは、出力シグナルを高め、抗体インキュベーション時間を実質的に短縮した。得られた超高速のウェスタンブロットは感受性の損失なしで20分で達成することができる。この方法は、化学発光と蛍光検出の両方を使用してウェスタンブロットに適用することができます。この簡単なプロトコルにより、研究者は多くのサンプルでタンパク質発現の分析をよりよく探求することができます。

概要

ウェスタンブロット(イムノブロットとも呼ばれる)は、幅広い科学的および臨床的分野にわたる強力で基本的な技術です。この技術は、タンパク質1の存在、相対的存在量、相対分子質量、および翻訳後修飾を調べるために使用される。デジタル画像解析と組み合わせることで、この方法はタンパク質およびタンパク質修飾の豊富さを確実に分析することができます2.ウェスタンブロットは日常的に行われますが、時間と労力を要する方法です。膜を有する抗体の長いインキュベーションが必要です。ここでは、感度を犠牲にすることなくこの制限を克服するインキュベーション法の改変について述べる。

膜のインキュベーション中、抗体は溶液中に浮遊し、抗原は膜上に固定化される。その高い親和性のために、抗体が抗原に結合する速度は、バルク溶液から膜への抗体の拡散よりも速い。これにより、低濃度の「枯渇層」が作成されます(図1)。この技術では、より遠い抗体が受動的拡散によって膜に到達するまでに数時間かかることがあります。この効果は、大量輸送制限(MTL)3と呼ばれます。抗体含有溶液の繰り返しの排水と補充は、枯渇層を破壊し、MTL4を克服する可能性が提案されている。ここでは、従来のウェスタンブロッティングプロトコルにおけるMTLの効果を減少させ、必要な潜伏期間を顕著に短縮するために、この循環ドレインおよび補充(CDR)概念を実装する独自の技術を考案しました。

短時間で検出感度を維持するために、抗原抗体反応を加速する免疫反応増強技術を用いて、シグナル対ノイズ比5を向上させた。市販の免疫反応増強剤(IRE)の多くは2成分から構成されている(溶液1および2、表の材料表参照)。IREの独自の組成または作用機序は明らかにされていないが、固相結合アッセイにおいてIREが抗原と抗体との間の解離定数を低下させることを以前に発見したが、少なくとも部分的には、IRE6の増強効果を担う親和性の増加を示す。CDRとIREの組み合わせは、感度を犠牲にすることなく、手順全体の時間を短縮する超高速ウェスタンブロッティングプロトコルを生み出します。

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プロトコル

1. SDS-ページとPVDF膜への転送

  1. 相対サイズに基づいてタンパク質を分離するためにSDS-PAGEを行います。
    注:商用または自家製のゲルシステムは問題ありません。製造元のプロトコルに従ってください。
  2. 分離したタンパク質をゲルからPVDF膜に移す。
    注:一般的な転送方法(半乾式または湿式転送)が適しています。製造元のプロトコルに従ってください。

2. PVDF膜の遮断

  1. 膜を室温で撹拌して1時間適切なブロッキングバッファーにインキュベートします。
    注:一次抗体および検出システムに応じて、適切なブロッキングバッファを選択する必要があります。例えば、最も典型的なブロッカーはBSA、非脂肪乾燥乳、カゼイン、および市販の合成ポリマーである。Tween20 が 0.1% の PBS および TBS は、最も一般的に使用されるバッファーです。このブロッキング工程は、4°Cで一晩行なわれてもよい。

3. 一次抗体によるインキュベーション

  1. 蒸留水で10%免疫反応増強剤-1溶液(IRE-1)を調製する。渦はよく。
  2. 10%IRE-1で希釈された一次抗体を調製します。やさしく、十分に混ぜます。
  3. より大きな膜(4 cm x 8 cm - 8 cm x 8 cm)を使用する場合は、抗体溶液の8 mLを50 mL円錐形遠心分離管に加えます。より小さい膜(2 cm x 8 cm - 4 cm x 8 cm)を使用する場合、抗体溶液の3 mLを14 mLの丸底ポリプロピレンチューブ(材料表)に加える。
  4. ピンセットでPVDF膜を拾い、ブロッキング溶液を簡単に排出します。PVDF膜を手袋をした指でこのチューブに挿入し、膜全体がチューブの壁に付着していることを確認します。PVDF膜をチューブに挿入すると、もともとゲルに接触していた膜の「タンパク質側」に向かって、内側に向かいます。キャップをしっかりと閉じます。
  5. 50 mLチューブをガラス瓶に入れます。
    注:このインキュベーションに14 mLチューブを使用する場合は、50 mLチューブの中央にインナーチューブを保持するためにプラスチックリングホルダーのペアを使用して、50 mLチューブに14 mLチューブを挿入します。
  6. ハイブリダイゼーションオーブンをオンにします。
  7. 少なくとも5分間、6rpm回転で膜をインキュベートする。
    注:膜が常に壁に付着していること、および(内側の)チューブが抗体溶液で膜を均等に覆うために水平であることを確認してください。実際の実験の前に抗体の希釈とインキュベーション時間を較正します。

4. 膜洗浄

  1. 回転を停止します。
  2. ピンセットでチューブからPVDF膜を慎重に取り出し、50 mLのPBS-Tの容器に入れます。
  3. 膜をPBS-Tで短時間すすいでください。
  4. 気泡が出なくなるまで、蒸留水で容器内の膜をすすいでください。これは抗体の大部分を除去する。
  5. PVDF膜を容器から250 mLのPBS-Tを含むサラダスピナーに移します。
  6. ストレーナーバスケットをスピナーに入れます。蓋がしっかりと付けられていたことを確認します。
  7. スピナーをアクティブにし、約20〜30 sでそれを実行します。
  8. 溶液を捨て、蒸留水でスピナーの内側を簡単にすすきます。
  9. 250 mL の PBS-T を再度スピナーに加えます。
  10. 手順 4.6 と 4.7 を繰り返します。

5. 二次抗体を用いてインキュベーション

  1. 蒸留水で10%免疫反応増強剤-2溶液(IRE-2)を調製する。渦はよく。
  2. 10%IRE-2で希釈された二次抗体を調製します。やさしく、十分に混ぜます。
  3. ステップ3.3に記載されている抗体溶液およびチューブの体積を選択します。
  4. ピンセットでPVDF膜を拾い、溶液を簡単に排出します。手順 3.4 に記載されているように、PVDF 膜をチューブに挿入します。
  5. 50 mLチューブをガラス瓶に入れます。
  6. ハイブリダイゼーションオーブンをオンにします。
  7. 少なくとも5分間、6rpm回転で膜をインキュベートする。膜が常に壁に付着していること、および(内側の)チューブが抗体溶液で膜を均等に覆うために水平であることを確認してください。
    注: 実際の実験の前にインキュベーション時間を調整します。二次抗体が蛍光結合されると、暗所でインキュベーションを行う。

6. 膜洗浄

  1. 手順 4.1 ~ 4.10 に従います。

7. 画像の取得

  1. 化学発光検出
    1. 半移植柔軟フィルム(10 cm x 15 cm)を平らな表面に置きます。
    2. 5 mL チューブに化学発光基材の 2 つの成分を混合します。
    3. 混合基材の1.5mLを半移植柔軟なフィルムに直ちに移し、PVDF膜をその上に置きます。次いで、残りの基質溶液を膜上に移す。
    4. 半透明のフレキシブルフィルム上に混合基材を用いてPVDF膜を1分間インキュベートします。
    5. ピンセットでPVDF膜をピックアップし、基質溶液を簡単に排出します。
    6. 透明フィルムのペアの間に膜を挟みます。
    7. 化学発光モードで画像を取得します。
  2. 蛍光検出
    1. ピンセットでPVDF膜を拾い、溶液を簡単に排出します。
    2. 透明フィルムのペアの間に膜を挟みます。
    3. 蛍光モードで画像を取得します。
      メモ:ステップ7.1と7.2は、最大感度を確保するために、イメージングマシンに近接して実行する必要があります。
    4. バックグラウンドシグナルが高い場合、PBS-Tの80〜100 mLの容器内で洗浄工程を行い、10分リンスを一次抗体に対して3回、2次抗体に対して5分リンスを6回行う。
      注:10%のIRE溶液で希釈された一次抗体と二次抗体の両方を、感度6を失うことなく最大8〜10回使用できます。溶液は、最大1ヶ月間4°Cに保つ必要があります。

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結果

この例は、ウェスタンブロット上の免疫増強技術と共にCDR法の有効性を示す。スタティックインキュベーションは、PVDF膜を抗体溶液と共にインキュベートした半透明のフレキシブルフィルムに対して行ったのに対し、CDRインキュベーションは膜および抗体溶液を含む回転チューブによるハイブリダイゼーションオーブン中であった(Movie)。 図2 は、ウェスタンブロット上の化学発光検出に必要な抗原量および抗体をそれぞれ示した。静的およびCDRインキュベーションの両方で、IRE溶液の使用は感度を高めました:IREは、静的条件下でß-アクチンを検出するために必要な細胞溶解物(抗原)の最小量を2.2μgから1.1μgに減少させ、CDRを使用して1.1 μgから0.275 μgにさらに減少しました(図2A)。同様に、抗6x Hisタグ抗体の最小濃度は、静的条件下では100 ng/mLから50ng/mLに、CDR条件下では100 ng/mLから12.5ng/mLに低下した(図2B)。5...

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ディスカッション

ウェスタンブロットは、約40年前に開発された特定のタンパク質を検出するために広く使用されている分析技術です7,8.それ以来、技術は進化し続けており、その後の技術革新により、技術2、9、10、11、12、13の感度、速度、定量性が向上しています。ここで紹介する強化された超高速ウェスタンブロッティングプロトコルは、既存の技術にいくつかの大幅な強化を行います。IREによる検出閾値を下げることにより、感度を犠牲にすることなくインキュベーション時間を短縮します。特別なまたは高価な機器は必要ありません:ハイブリダイゼーションオーブンでチューブ...

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開示事項

著者らは、この記事の内容に直接関係する競合する利益を宣言していません。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所の国立心臓・肺・血液研究所の壁内研究部門によって支援されました。S.H.は日本の官民パートナーシップ学生留学プログラムの支援を受け、H.N.とK.Y.は武勇とVドラッグ海外研修奨学金を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
14 mL丸底高透明度PP試験管、目盛り付き、スナップキャップ付き、ファルコン352059
アポロ透明フィルム、レーザープリンター用N/AN/Aレーザープリンター透明フィルムは問題ありません。
Azure Imaging System 600Azure BiosystemsAzure 600化学発光および/または蛍光検出には、あらゆる種類の画像取得システムに適しています。
シグナル免疫反応増強剤溶液東洋紡NKB-101
CARNATION インスタント無脂肪ドライミルクカーネーションN/A
ECL 抗マウス IgG、西洋わさびペルオキシダーゼ リンク F(ab')ヒツジからの2つの断片HealthcareNA9310V
ECL抗ウサギIgG、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合F(ab')ロバからの2つのフラグメントヘルスケアNA9340V
HYBAID Micro-4N/AN/A チューブが水平位置で均等に回転している限り、任意のハイブリダイゼーションオーブンで問題ありません。
Immobilon-P PVDFメンブレン、0.45 µm 細孔サイズミリポアシグマIPVH304F0
IRDye 680RD ヤギ抗マウスIgG二次抗体LICOR926-68070
IRDye 800CW ヤギ抗ウサギIgG二次抗体LICOR926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrateseracare5430-0049
マウス抗-szlig;アクチン抗体ミリポアシグマA5316
オデッセイ ブロッキングバッファー (PBS)LICOR927-40100蛍光検出用ブロッキングバッファー
OXO サラダスピナーOXO32480V2BPVDF 膜が破れることなく激しくすすがれている限り、どんなサラダスピナーでも問題ありません。
パラフィルムシーリングフィルムBemisParafilm M PM996半透明フレキシブルフィルム
ポリエチレン フラットトップスクリューキャップ 50 mL 円錐底遠心分離チューブ用ファルコン352070
リング 50 ml チューブの中心に 14 ml チューブを保持するリングN/AN/A機械工場で準備
ウサギ anti-6X 彼のタグ抗体Abcamab9108
Tween20ミリポアシグマP2287
あらゆる種類のGE GE

参考文献

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