Method Article

土壌中の不安定な植物、無機植物の栄養素および汚染物質の二次元可視化と定量化

DOI:

10.3791/61661

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September 1st, 2020

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1Department General, Analytical and Physical Chemistry, Chair of General and Analytical Chemistry, Montanuniversität Leoben, 2Department of Forest and Soil Sciences, Institute of Soil Research, Rhizosphere Ecology and Biogeochemistry Group, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, 3Department of Crop Sciences, Institute of Agronomy, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、質量分析イメージングと組み合わせた薄膜(DGT)の拡散勾配を用いた複数の不安定な無機栄養素および汚染物質溶質種のサブmm2D視覚化のワークフローを提示する。地表植物の根層圏における溶質の定量的マッピングについては、溶質サンプリングおよび高解像度の化学分析について詳細に説明します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、2次元(2D)の視覚化及び、亜硝子体(すなわち、可逆吸着)無機栄養(例えば、P、Fe、Mn)および汚染物質(例えば、A、Cd、Pb)の植物根に隣接する土壌中の溶質種(10μmの空間空間)における分布の可視化と定量化の方法を記述する。この方法は、薄膜(DGT)技術における拡散勾配によるシンクベースの溶質サンプリングと、レーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析(LA-ICP-MS)による空間的に解決された化学分析を組み合わせたものです。DGT技術は、均質に分布した分析物選択的結合相を有する薄いヒドロゲルに基づいている。様々な結合段階により、簡単なゲル製造手順に従って、異なるDGTゲルタイプの調製が可能になります。根球のDGTゲルの展開のために、植物は平らで透明な成長容器(根茎)で成長し、土壌成長した根系への最低侵襲的アクセスを可能にする。成長前の期間の後、DGTゲルは根茎の皮質のサンプリングで興味のある選択された領域に適用される。その後、DGTゲルを回収し、LA-ICP-MSラインスキャンイメージングを使用して結合された溶質のその後の化学分析のために調製される。マトリックスマッチゲル規格を用いた 13Cと外部キャリブレーションを使用した内部正規化の適用により、2D溶質フラックスの定量化がさらに可能になります。この方法は、土壌プラント環境における多元質溶質フラックスの定量的なサブmmスケール2D画像を生成する能力においてユニークであり、根峡の溶質勾配を実質的に測定するための他の方法の達成可能な空間分解能を超える。我々は、地上植物の根層圏における複数のカチオンおよびアニオン性溶質種をイメージングする方法の応用と評価を提示し、この方法を相補的な溶質イメージング技術と組み合わせる可能性を強調する。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作物植物による栄養摂取は、作物の生産性を決定する上で重要な要素です。作物による栄養素の効率的な取り込みを支配するプロセスは、特に土壌根界面の根根に対する栄養供給を制御するメカニズムと、根茎水層の栄養素の摂取におけるその役割について認識されている。植物の栄養素の取り込みのための重要なプロセスが含まれます: 根に向かって栄養輸送;土壌の細孔水に溶解した種と固体土壌表面に結合された種との間の動的な吸収平衡;栄養素のための微生物の競争;土壌有機物に含まれる栄養素の微生物のミネラル化;そして根のシンプラスムへの栄養の内在化。無機微量金属(oid)汚染物質の取り込みは、同じメカニズムによって大きく制御されます。

土壌中の栄養成分や汚染物の入手可能性、植物需要、拡散性に応じて、根層圏の微分栄養パターンが観察されます。比較的高い内在化率(例えば、P、Fe、Mn、Zn、As、Cd、Pb)を持つ強くソービング要素については、バルク土壌と比較した不安定な(すなわち、可逆吸着された)元素分率の枯渇が見つかり、枯渇ゾーンの幅はしばしば≤1mmであり、NO 3のようなより移動性の栄養素の場合は、枯渇ゾーンは数センチメートルまで拡張できる。さらに、AlやCdなどの要素の蓄積は、利用可能性が植物の取り込み率2,3を超えたときに観察されている。

栄養素および汚染物質循環における根圏プロセスの重要性を考えると、植物利用可能な要素分率を高い空間分解能で測定するためのいくつかの技術が4,5に開発された。しかし、小規模な不安定な溶質分布の測定は、いくつかの理由で困難であることが証明されています。主な難点は、根茎の急な栄養勾配を解決するために、生きている植物の根に隣接する定義された位置で、非常に小さな(低μL範囲)の土壌および/または細孔水の量をサンプリングすることです。この問題に対処するための1つのアプローチは、細孔水サンプル6の抽出にマイクロ吸引カップを使用することです。この方法により、A.ギョットリン、A.ハイム、E.マッツナー7は、ケルカス・ロバー L.根付近の土壌ポア水栄養濃度を、約1cmの空間分解能で測定した。土壌や土壌溶液のμL量を分析することの難しさは、これらの小さなサンプル量は、主要な栄養種を除くすべての低濃度と組み合わせて、高感度な化学分析技術を必要とすることです。

〜0.5mmまでの分解能で栄養勾配を解決することができる代替システムは、土壌ブロックの表面に根マットを成長させ、根8,9から土壌を分離する薄い親水性膜層を有することである。この構成では、溶質は膜を通過することができ、根は土壌から栄養素や汚染物質を取り込み、根が滲出して土壌に拡散する可能性があります。密な根層の確立後、土壌ブロックをサンプリングし、その後の要素画分の抽出のために得られた土壌サンプルにスライスすることができます。このようにして、一次元栄養素、および汚染勾配は、比較的大きな領域(〜100cm2)にわたって平均化して分析することができる。

さらに課題は、ほとんどの化学土壌抽出技術が植物が栄養素や汚染物質を取り込むメカニズムと比較して非常に異なって動作するため、不安定な植物利用可能な要素分率のサンプルを取得することです。多くの土壌抽出プロトコルでは、土壌は、溶解し、ソルベッド要素分率の間の(疑似)平衡を確立することを目的として抽出液と混合されます。しかし、植物は継続的に栄養素を内部化し、したがって、多くの場合、根茎の土壌を徐々に枯渇させます。平衡抽出プロトコルは、実施が容易であるため土壌試験として広く採用されているが、抽出された分画は、植物利用可能な分画ウェル10、11、12、13を表さないことが多い。栄養物のサンプリングされた土壌を連続的に枯渇させるシンク法は、有利な方法として提案されており、根取り取りプロセス10、11、14、15を模倣することによって、基礎となる栄養取り込み機構に似ている可能性がある。

上記の方法に加えて、本物のイメージングアプリケーションは、数cm2の視野を越えて解像度≤100 μmの連続的なパラメータマップを測定することができるが、特定の元素および土壌(生物)化学パラメータ5のために開発されている。オートラジオグラフィーは、適切な放射性同位元素が利用可能である場合には根圏の要素分布を画像化するために使用することができます16.平面光はpHおよびpO217、18、19のような重要な土壌化学パラメータの視覚化を可能にし、酵素活性または全タンパク質分布は、土壌ザイモグラフィ20、21、22、23および/またはルートブロット法などの蛍光指標イメージング技術を用いてマッピングすることができる。ザイモグラフィーとオートラジオグラフィーは一度に1つのパラメータの測定に制限されていますが、平面光素を用いたpHとpO2イメージングは同時に行うことができます。従来のルートマット技術では1D情報のみが提供され、マイクロ吸引カップは点数計測や低解像度の2D情報を提供しますが、どちらの方法でも多要素解析が可能です。最近では、P. D.Ilhardt,ら25は、レーザー誘導分解分光法(LIBS)を用いて、2Dの全多元分布を、慎重なサンプル調製によって自然元素分布が保存された土壌根コアサンプル中の~100 μmの分解能でマッピングする新しいアプローチを提示した。

高い空間分解能で複数の栄養素および汚染物質の溶質を2Dサンプリングする唯一の技術は、薄膜(DGT)技術における拡散勾配であり、ヒドロゲル層26,27に埋め込まれた結合材料に陰唇微量金属(loid)種をその場で固定化するシンクベースのサンプリング法である。DGTは、堆積物および海域中の不安定な溶物を測定するための化学種分化技術として導入され、すぐに土壌28での使用に採用された。これは、最初に川の堆積物29で実証されたサブmmスケール多元溶質イメージングを可能にし、さらに植物根球30、31、32、33でその適用のために開発された。

DGTサンプリングの場合、約3cm x 5cmの大きさのゲルシートを、土壌ブロックの表層に成長している単一の植物根に塗布し、ゲルを土壌から分離する親水性膜を使用します。接触時間中、不安定な栄養素および/または汚染物質はゲルに向かって拡散し、ゲルに組み込まれた結合材料によって直ちに結合されます。このようにして、濃度勾配、およびこのようにゲルに向かって連続的なネットフラックスが確立され、サンプリング時間の間に優勢になる。サンプリング後、ハイドロゲルを除去し、空間的に解決された分析を可能にする分析化学技術を使用して分析することができます。この目的のために非常に専門化され、頻繁に使用される技術は、誘導結合プラズマ質量分析(LA-ICP-MS)であるレーザーアブレーションです。初期の研究では、マイクロ粒子誘導X線放射(PIXE)も29.29を用いた。DGTサンプリングとLA-ICP-MS分析を組み合わせることで、100μmの空間分解能で多元的な化学イメージングが可能です。高感度ICP-MS技術(例えば、セクターフィールドICP-MS)が採用されている場合、検出の極めて低い限界を達成することができます。トウモロコシ15によるZnとCd取り込みへのリミングの影響に関する研究では、汚染されていない土壌中のトウモロコシ層根圏の不安定なCdを、ゲル面積当たりCdの38pgcm-2の検出限界でマッピングすることができました。DGT、平面オプトデス、およびザイモグラフィーは、土壌からゲル層へのターゲット要素の拡散に依存しており、植物の栄養素および汚染物質の取り込みに関連する多数のパラメータを同時に、または連続的に画像化するために、これらの方法の組み合わせ用途に利用することができます。DGTイメージングの分析的化学的側面に関する詳細な情報、DGTと他のイメージング方法を組み合わせる可能性、およびその用途については、ref.34,35で総合的にレビューされています。

本稿では、不飽和土壌環境における陸上植物の根に対して、植物栽培、ゲル製造、ゲル化、ゲル分析、画像生成などのDGT技術を用いて溶質イメージング実験を行う方法について説明します。重要なステップや実験的な代替手段に関する注意事項を含め、すべてのステップについて詳しく説明しています。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. DGTゲルの製造

注:いくつかのDGTゲルタイプは、高い(サブmm)空間分解能35での不安定溶質種の2Dイメージングに利用できます。ここで、溶質イメージング用途で用いられる3つの十分に特徴付けられる高分解能(HR)-DGT結合ゲルの製造を簡単にまとめた。トレース要素分析の実験室手順、および提示されたすべてのHR-DGTゲルの詳細な製造手順については、 サポート情報(SI)セクションS1およびS2に記載されています。

  1. ポリウレタンベースの混合アニオンとカチオン結合ゲル(HR-MBG;SI S2.1)31
    1. 均質に分散したジルコニウム(IV)水酸化物およびイミノオオ酢酸塩(IDA)相でポリウレタンゲル懸濁液を調製する。
    2. 薄膜のゲル懸濁液をガラス板にコーティングし、溶媒蒸発によりゲル形成を開始し、0.1mm薄く涙気に満たない混合アニオンおよびカチオン結合ゲル(HR-MBG)を得る。
  2. ポリアクリルアミドジルコニアアニオン結合ゲル (HR-ABG;SI S2.2)36
    1. 0.4mmの薄いアガロース・アガロース・ポリアクリルアミドゲル(APA)を確立されたゲル鋳造手順37に従って製造する(APA製造の詳細なプロトコルについてはSI S2.4を参照)。
    2. ジルコニウム(IV)水酸化物をプレキャストAPAゲルに析出し、0.4mmの薄アニオン結合ゲル(HR-ABG)を得た。
  3. ポリアクリルアミドイミノオ酢酸カチオン酸カチオングゲル (HR-CBG;SI S2.3)38
    1. 均質に分散したIDA相を用いてポリアクリルアミドゲル懸濁液を調製します。
    2. 2枚のガラス板の間にゲルをキャストし、重合反応を開始して、IDA相がゲルの片側に落ち着いた0.4mm-シンカチオン結合ゲル(HR-CBG)を得る。

2. 植物栽培

注:実験システムは、溶質イメージングのために不飽和土壌で植物を育てるため、根茎4(図1)を使用しています。まず、根ツォトロン土の充填と水を挙げ、次に実験植物の成長に関する詳細が与えられる。根茎に充填する前の根茎の設計と土壌基質の調製に関する詳細は、SIセクションS3に記載されています。

figure-protocol-1
図1:リゾトロンの設計(スケールしない)。(A) 根茎成長容器の分解図。(B)植物の成長中に組み立てられた根ゾン。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 根ゾトロン土壌充填
    1. リゾトロンを湿潤土壌(重量測定水分量、既知)で満たす前に figure-protocol-2 (SI S3.2を参照)、粘着テープを使用して根茎の後ろの散水穴を閉じ、フロントプレートとその固定レールとネジを取り外します。
    2. 空の根茎(前面板、レール、ネジを除く)、8つの5 cm x 11 cmのアクリルプレート、16個のクランプ(材料表)を計量し、重量の合計を記録します。
    3. 根茎の底に小さなアクリル板を1枚取り付け、両側に2つのクランプを使用して、クランプの圧力を根茎フレームに向けて取り付け、プレートが内側に曲がらず、体積が一定になるようにします。
    4. 小さなプラスチック板に向かって根茎をわずかに傾斜させ、あらかじめ湿らせた土を~4cmの高さまで充填する(図2A)。根茎を少し攪拌して根茎の中の土を分配し、圧縮ツールで数mmずつ静かに圧縮する(図2B)。
    5. 根茎が土で満たされるまで2.1.3-2.1.4を繰り返す(図2C)。根茎に苗を植え付けるための上に〜3cmの隙間を残します。
    6. 土壌で満たされた根茎(8枚の小皿と16個のクランプを含む)の重量を量り、重量を記録します。この中から、2.1.2で得られた空の根元子重量を差し引き、重量差、すなわち湿潤土壌の質量 figure-protocol-3 (g)を根茎に記録する。
    7. Eq. 1に従って、根茎の乾燥土の質量を計算 figure-protocol-4 し、(g)、Eq.2に figure-protocol-5 従って根茎の乾燥土のかさ密度(gcm-3)を計算する。
      figure-protocol-6
      figure-protocol-7
      ここで figure-protocol-8 、(cm3)は根茎の総内容量である。
      注意: figure-protocol-9 根茎の典型的な値は1.0-1.4g cm-3の間にある。ルートの成長がこの値を超えて妨げられる可能性があるため、1.5 g cm-3 を超えないでください。
    8. 支え箱の上に土で満たされた根茎を置き、根茎からすべてのクランプと小皿を取り除く(図2D)。フレーム上の土壌粒子が漏れを引き起こす可能性がありますので、ティッシュペーパーを使用して慎重に根茎フレーム(すなわち、エッジ)をきれいにします。
      注:露出した土壌表面は均質で、亀裂や隙間のない根茎フレームで平準化する必要があります。ない場合は、根茎を空にし、2.1.2 - 2.1.8を繰り返します。
    9. ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)(材料表)箔を22cm×13cmに2個カットします。また、プラスチック箔を46cm×15cmに切ります。PTFEとプラスチック箔の重量の合計を記録します。PTFE箔の最初の部分を根茎の露出した土壌表面の上半分に置き、根茎の上部の土壌レベルを約1cm伸ばします。
    10. 粘着テープを使用して、PTFE箔を根茎フレームに慎重に固定します(図2E)。最初に根茎の上部にある1つのコーナーを固定し、次に反対側のコーナーを固定し、最後に2つのコーナーを根茎をさらに下に置きます。コーナー2~4を固定する際に張力を適用し、平らな箔面を確保します。折り目が現れた場合は、すべての折り目が取り除かれ、PTFEホイルが平らで土壌表面と連続するまで、テープを個々のコーナー(一度にすべてではない)で開いて再固定します。
    11. 2番目のPTFE箔を根茎の下端に置き、上のPTFE箔を約1cm重ね、2番目のPTFE箔を根茎に固定するために2.1.10を繰り返します。
    12. プラスチックホイル(46cm x 15 cm)をPTFEホイルの上に置きます。2.1.10で詳述されているように固定手順を使用してプラスチックホイルを固定します。
    13. 土で満たされたホイルで覆われた根茎にフロントプレートを置きます。根茎の両側にレールを1つ置き、ネジを手で締めてレールを固定し、それによりフロントプレートを根茎に固定します。ねじは、根茎の閉じた側、すなわち、散水穴のある側に向かって配置される(図1A)。

figure-protocol-10
図2:根茎の溶質イメージング用土壌中の植物を育てる根ゾトロンアセンブリと充填。(A)根茎に充填土壌.(B)圧縮ツールを使用して、充填土の圧縮。(C)小さなアクリル板とクランプを備えた土壌で満たされた根支。(D)土壌表面を露出した土壌で満たされた根ツォトロン。(E)土壌に満ちた根茎は、保護PTFE箔で部分的に覆われている。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-11
図3:リゾトロンの取り扱いおよびDGTゲル塗布。(A)根茎の裏面の散水穴に10mLピペットチップを使用した土壌散水。(B)土で満たされ閉じた根茎に苗(緑の斑点として示される)を植える。(C)リゾトロンはサリックス・スミシアナの切り抜きで植え、フロントプレートとプラスチック箔カバーを取り外した。(D) DGTゲル塗布前にPTFE箔カバーを慎重に剥がします。(E) 土壌根界面ROIの高解像度写真。(F)DGTゲルを搭載したフロントプレートを根茎に塗布する。(G)溶質サンプリング中に適用されるDGTゲルを用いたROIの写真。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 土壌に水をやる
    1. 根茎の実験土壌の保水能力(WHC)を決定します。この結果、開いた底を持つ2つの根茎を製造し、セクション2.1で規定されているように土壌で満たします。16時間水容器に浸漬して、これらの開いた、土壌で満たされた根茎を十分に飽和させ、8時間根茎を排出します。
    2. オープンボトム根茎のランダムな位置から〜50gの複合土壌サンプルを採取し、105°Cで乾燥させて figure-protocol-12 Eq. S1に従って決定します。決定された figure-protocol-13 物は、土壌のWHCに対応し、したがって figure-protocol-14 、(g-1)として表される。
    3. figure-protocol-15実験根茎でターゲットを定義します。成長段階では figure-protocol-16 、WHCの60%(すなわち、WHC因子) figure-protocol-17 を設定し、根茎の無酸素状態を避けながら十分な量の水を植物に供給する。
    4. figure-protocol-18Eq. 3に従ってターゲットで根茎の土壌を灌漑するために、添加される水の総質量 figure-protocol-19 (g)を計算する。根茎の土壌中に存在する水の質量を説明します figure-protocol-20 , (g).
      figure-protocol-21
    5. figure-protocol-22根ゾン散水穴の数(ここでは14)で割って、各散水穴に添加する水の質量を求める。10 mLピペットチップを散水穴に押し込み、水を重力で土壌中に流し込ませて水を加える(図3A)。
  2. 植物の成長
    1. ラジクルが出現するまでの特定の種子の発芽要件に従って、実験植物の種子(例えば、湿式ろ紙上)の前発芽(長さ1cmまで)。。
    2. 図3Bに示すように、最大2本の苗を根茎に植え付ける。植え付け時には、約5mLの水を苗に直接加え、その成長を支えます。透明な保湿フィルム(材料表)で植え付けた後、最初〜2日間根茎の上部開口部を覆う。マイクロフィジックの成長を防ぐために、根茎をアルミニウム箔で包みます。
      注意:苗木とは別に、植物の挿し木も根茎で栽培することができます。
    3. 植えられた根茎を成長室に移し、環境条件(温度、湿度、光強度)を特定の植物の要件に設定します。25°-35°で根茎を傾け、重力を介して前板と並んで根の発達を確実にする。
    4. 植物の成長中、2.2.5で詳述されているように根茎の散水穴を使用して2〜4日ごとに定期的に水を与えることによって、根茎の目標水分量を重力的に維持する。土壌表面をトップ開口部に湿潤させ、通常の5mL水を加えます。
      注意:植物が長期間栽培され、植物バイオマスが提案された方法によって根茎に加わる水の量を大幅に減少させると予想される場合、植物を別々の根茎に成長させ、植物組織を一定の間隔で採取して計量することによって植物バイオマスの重量を考慮する。
    5. 根が前板に沿って適切な位置に到達したら、根茎の中央に優先的に、根茎溶質分布をサンプリングするためのDGTゲルを適用する。

3. 溶質分布のサンプリング

  1. ゲル塗布
    1. figure-protocol-23 figure-protocol-24 figure-protocol-25 2.2.4.-2.2.5で詳述したようにゲル塗布前に根茎の増加60%から80$時間。これは良い土壌ゲル接触を保障し、溶質のサンプルの間に無酸素の土の条件を避けながらゲルに溶質拡散を可能にする。
    2. 新しい酸洗浄フロントプレートを取り、サンプリングに使用される根茎に合わせて配置し、プレート上の関心領域(ROI)をマークします。プレートを積層フローベンチまたはその他のダストや金属のない環境に移し、無印の側面を上に向けます。
    3. PTFEコーティングカミソリブレードを使用して、ROIに対応する必要な長方形のサイズ(通常は約3cm×5cm)にアクリル支持体のDGT結合ゲルをカットします。カミソリの刃を滑らなく押して、明確なカットを確保します。プレートのマークされていない側の ROI のマークされた位置に長方形のゲルピースを置きます。
      注意:HR-MBGを使用する場合、ゲルの下に100 μmの薄いスペーサーホイルを加えて、ゲルが土壌根システムと接触していることを確認してください。
    4. 10 μmの薄いポリカーボネート膜(0.2 μmの細孔サイズ)をカットします。 資料一覧)各側面で≥1cmずつのサイズを拡張するサイズにし、膜をゲルの上に置きます。水を塗布して、泡を積み重ねてから取り除きます。
    5. ビニール電気テープを使用して、すべての4つのエッジに沿って膜を固定します (材料のテーブル).その過程で、プラスチック製のピンセットを使用してゲルと膜の間に閉じ込められた気泡を慎重に除去します。テープは、ゲルではなく、膜と接触する必要があります。
      注:テープがゲルに接触した場合、気泡がゲルと膜の間に閉じ込められたり、最終膜表面に折り目が付いている場合、ゲルへの溶質の拡散流束を35(3.1.3~3.1.5を繰り返す)として再組み立てる必要があります。
    6. スタンドに根茎を置き、レールを取り外し、正面プレートを慎重に持ち上げます(図3C)。プラスチック箔を取り外し、根茎根の縁でPTFE箔を切断し、土壌根系の乱れを避けるためにPTFE箔をゆっくりと剥がします(図3D)。
    7. デジタル一眼レフ反射(DSLR)カメラ(材料表)を使用してROIの直交写真を撮り、土壌構造と根形態に基づく溶質分布の解釈と提示を容易にする(図3E)。カメラスタンドを使用し、可能であればマクロレンズを使用します。写真の中心が ROI の中心に対応し、カメラのフォーカス平面が土面に平行になるようにカメラを位置合わせします。写真にスケールバー(定規など)を含めます。
    8. 開いた根茎にゲル/膜スタックを装着したプレートを取り付けます(図3F)。したがって、プレートの 1 つのエッジを根茎の端に合わせ、プレートを土に向かってそっと「曲げる」。このアプリケーションモードは、ゲル/膜スタックと土壌根システムとの間の気泡を避けるのに役立ちます。レールとネジを使用してフロントプレートを固定します。
      注: この手順は重要であり、慎重に実行する必要があります。プレートは、土壌や根を置き換えることなく、ゲル/膜スタックと土壌根系との接触を確立した後に移動することはできません。
    9. ゲル展開の正確な開始時刻を記録し、3.1.7 に示された ROI で展開されたゲルの写真を撮ります (図 3G)。根茎をアルミホイルで包み、溶質サンプリング期間の終わりまで成長室に移します(しばしば24時間)。
  2. ゲル検索
    1. サポートボックスに根茎を置き、慎重に前部プレートを持ち上げ、ゲル/膜スタックを水でプレートに洗い流して、付着粒子を洗い流します(図4A)。ゲル展開の正確な終了時刻を記録します。ROIから土壌をサンプルし、Eq. S1に従って根茎の実際の w土壌 を決定する。
    2. 前板を層流のベンチに移し、ゲル/膜スタックを上に向けます。最初に4つのエッジすべてに沿ってテープを慎重に取り出し、次にゲルを覆うポリカーボネート膜を取り除くことによって、フロントプレートからゲルを取り出します(図4B)。水を塗布して、土壌接触側を上に向けてプレート上の薄い水のフィルムに自由に浮かべるゲルを助けます。
      注: ゲルの向きを追跡することが重要です。土壌や根に露出したゲル側は、常に(ユーザに向かって)上向きでなければなりません。
  3. ゲル乾燥
    1. ゲルブロッティング紙(材料表)の長方形の部分をカットし、ポリエーテルサルホン膜の少し小さな部分を配置します (0.45 μmの細孔サイズ). 資料一覧)上に。
    2. プラスチックピンセット、土壌接触側を上に向けて、プレートからゲルブロッティングペーパー/膜スタックにゲルを移します。ゲルは、ゲルと膜の間に気泡を持たずに、リラックスして(すなわち、伸ばされていない)完全に平らでなければならない。ゲルの移動と位置を容易にするために、ゲルブロッティング紙/膜スタックに水を塗布します。
    3. ゲルブロッティングペーパー/膜/ゲルスタックをプラスチック箔で完全に覆い、ゲルサンプルとその向きをプラスチック箔にラベル付けします(図4C)。ゲルブロッティングペーパー/膜/ゲル/プラスチック箔スタックを真空ゲルドライヤー(材料表)に入れ、スタックが完全に乾燥するまで乾燥させます(通常は48-72時間)。HR-MBGの場合は、HR-ABGとHR-CBGの場合は室温で最高の乾燥度で50〜55°Cに設定します。
    4. 乾燥したスタックからゲルブロッティングペーパーを取り出し、ポリエーテルサルホン膜と切ってもマージされたゲルをジップバッグに移します。プラスチックホイルカバーはLA-ICP-MS分析の直前までゲルに留まる。
    5. 土壌に曝されない方法ブランクとして、元のゲルシートからゲル片を含める。3.3.2 ~ 3.3.4 に続くサンプルゲルと同じブランクゲルの方法を処理します。

figure-protocol-26
図4:溶質サンプリング時のDGTゲルの回収と乾燥の準備(溶質サンプリング直後にDGTゲルと根茎を用いたプレート。(B)層流ベンチ内のプレートからのDGTゲルの回収。(C)ゲル乾燥用ゲルブロッティング紙/ポリエーテルサルホン膜/DGTゲル/プラスチック箔カバーのスタック。ゲルは根層の土に配置後にわずかに着色されることに注意してください。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

4. DGT結合ゲルの化学分析

注: このプロトコルでは、DGT結合ゲル上の溶質分布の解析は、4重極ICP-MSに結合された2体積アブレーションセルを搭載したナノ秒の193 nm ArFエキシマLAシステムを使用して、LA-ICP-MSによって達成される(図5)。すべてのインストゥルメントは、一覧の一覧を「材料表」に示しています。あるいは、ナノ秒213 nmまたは266 nmの固体LAシステムは、36、39、40、41、42、43を適用することができる。高められた感受性または質量分解能が要求される場合、セクターフィールドICP-MSは四重極ICP-MS15、44に代わる。LAシステムと四重極ICP-MSへの外部較正およびカップリングのためのDGTゲル標準の調製の詳細は、SIセクションS4およびS5に記載されている。

figure-protocol-27
図 5: DGT ゲル分析用の LA-ICP-MS セットアップ(A)ナノ秒 193 nm ArF エキシマー LA システムと四重極 ICP-MS.(B)ガラス板に取り付けられた乾燥ゲルをLAサンプルステージに固定してアブレーションセルに導入する準備ができた。(C) ネブライザーガス(Ar)ICP-MSとエアロゾルキャリアガス(HeまたはAr)は、双方向Yスプリッターとトーチアダプタフィッティングを介してICPに接続されたアブレーションセルから。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. LA-ICP-MS のサンプル準備
    1. 乾燥したゲルサンプル、標準、およびブランク(ポリエーテルサルホンの膜支持体と結合される)を両面粘着テープ(材料表)の個々の部分に移し、ゲル側を上に向けます。余分なテープパーツを切り抜き、アブレーションセルのスペースを節約します。
    2. 乾燥したゲルをガラス板に取り付けます。LAサンプルステージ(10cm×10cm)で柔軟な配置を可能にするために、各ゲルサンプル、標準シリーズ、またはブランクの方法ごとに個々のガラスプレートを使用してください。ガラスカッターを使用して、必要に応じてガラス板のサイズを調整します。プラスチック(材料表)を使用して、LAサンプルステージ(図5B)上のゲルでガラスプレートを固定します。ステージの床を調整してゲル表面をレベル調整し、サンプルステージをアブレーションセルにロックします。
  2. LA-ICP-MS ラインスキャン分析
    1. SI セクション S5に指定されているとおりに、LA システムを ICP-MS に結合します。LA ソフトウェア (材料表) で、カメラのライト設定 (リング'、同軸' および '送信') を設定して、アブレーションセルのゲル表面を照らし、Z 軸の距離を調整してゲル表面に焦点を合わせます。セル全体のランダムな位置に移動して、すべてのゲル表面に焦点を合わせます。
    2. LA ソフトウェアの [レーザー セットアップ] ウィンドウで LA パラメータを設定します。DGTゲルのLA-ICP-MSラインスキャン分析で使用される典型的な設定は次のとおりです: モード連続;エネルギー出力 20-30%;繰り返しレート10-20 Hz;スポット直径100-200 μm;スキャン速度 150-250 μm s-1.
      注: 使用するゲルの種類に合わせてパラメータを最適化する必要があり、異なる場合があります。また、パラメータを拡張して、信号対ノイズ比、空間分解能を高めたり、実験や機器の設定に応じて取得時間を短縮したりできます。比較的低いエネルギー出力を使用する(≤40%)そして繰り返し率(≤25 Hz)は、ゲルを通してバッキング材料39に貫通することを避ける。レーザースキャン速度が、データポイントの圧縮を避けるために、スポット径を全ICP-MSスキャンサイクル期間(4.2.6)で割≤されていることを確認し、スキャン方向45の分解能を失うことを避ける。たとえば、スポット直径を 200 μm に設定し、ICP-MS スキャンサイクルの全時間を 0.25 秒に設定する場合、スキャン速度は ≤800 μm s-1になります。
    3. ラインツールを選択し、ゲル規格全体で1mmの線パターンを描きます。[スキャンパターン] ウィンドウでライン パターンを右クリックし、LA パラメータが 4.2.3 で設定されていることを確認します。採用されています。[重複スキャン] ツールを使用して、このラインを 4 回複製し、インターライン距離 (ラインの中心間の距離) をスポット直径より大きくします (図 6)。このアプローチは、ゲル標準(n = 5)あたり合計5本の平行線を提供します。各ゲル標準、キャリブレーションブランク、およびメソッドブランクに対してこのステップを繰り返します。
    4. ゲルサンプルに移動し、分析する矩形領域の上端に沿って 1 本の線を引きます。4.2.3 で指定したサンプル領域全体に対して平行線を作成するには、ラインを複製します。300~400 μm のインターライン距離を使用してください。各線の始点と終点ごとに、フォーカス(Z軸の距離)が正しく設定されていることを確認します。
      注: 解析の空間分解能は、インターライン距離と比較してスキャン方向に沿って高くなります。したがって、線の始点と終点は、アナライトの勾配の方向に最も適している場合があります。根球勾配の場合、通常は根軸に対して垂直です(図6)。
    5. ICP-MS ソフトウェア (資料表) では、 'メソッド' ] 画面で時間分解型の 'データのみ' メソッドを設定し、すべての分析対象に適した 1 つ以上の同位体を選択し、内部正規化基準 31、36、40、41、42として 13C を含めます。干渉46によって同位体の検出が損なわれないことを確認する。
    6. ICP-MS メソッドのスキャン サイクルの合計時間('Est. 読み取り時間') を、同位体当たりの適切なドウェル時間 (通常は 10 ~ 50 ミリ秒) で ≤0.5 秒に設定します。ICP-MS '測定値' を 1 に設定し、'測定値/反復' 値を変更して、サンプルごとの合計測定時間('Est. Sampling Time') 、つまり個々のアブレーション ラインごとに設定します。これは、4.2.2 ~ 4.2.4 で設定された特定の LA パラメータとラインの距離によって異なります。
    7. データ レポートの場合は、強度と時間のデータ収集モードを使用し、'File Write Option'新しい Per Sample' に設定して、各アブレーション行に対して個別のデータ ファイル (ここでは .xl) を作成します。
    8. ICP-MS'サンプル' 画面で、各サンプルエントリを 4.2.3 ~ 4.2.4 の個別のアブレーションラインに対応するサンプルエントリで設定します。
    9. [バッチの分析] をクリックして ICP-MS のサンプル シーケンスを開始します。
    10. LA ソフトウェアでは、分析するすべての行を選択し、ICP-MS メソッド('Est. Sampling Time'、4.2.6.を参照)が個々のライン アブレーションの期間と一致することを確認します。4.2.6 を繰り返します。をクリックして、必要に応じて ICP-MS メソッドを調整します。
    11. レーザーエネルギーウィンドウで [放出] をクリックしてレーザー ヘッドを充電し、[実行] をクリックして [実行実験] ウィンドウを開きます。ここで、[選択したパターンのみ] を選択し、[ウォッシュアウト遅延] を 20 ~30 s に設定し、[ スキャン中にレーザーを有効にする] チェック ボックスをオンにして、[ レーザーウォームアップ時間] を 10 s に設定します。
    12. [実行実験] ウィンドウで [実行] をクリックして、ライン スキャン分析を開始し、ICP-MS の各同位体の 1 秒あたりの数 (cps) の生信号強度をリアルタイムで監視します。各行は、ガスブランクで開始する必要があります('レーザーウォームアップ時間'、10 s)と終了('ウォッシュアウト遅延'、20-30 s)。
    13. 分析中にレーザーフルエンス(Jcm-2)を監視し、レーザー安定性を評価します。フルーションが大きく異なる場合は、解析を中止し、レーザー光源および/またはそのミラーシステムが完全に機能していることを確認します。
    14. 分析の後、ICP-MSプラズマを停止し、LAシステムのキャリアガスの流量を0 mL min-1に設定します。アブレーションセルからゲルを取り出し、さらに使用するためにジップバッグに保管してください。

figure-protocol-28
図 6: DGT LA-ICP-MS 実験計画の概略 (スケールしない)。この図は、根層圏におけるDGTベースの溶質サンプリングと、ゲル表面上の溶質分布のLA-ICP-MSマッピングを示しています。DGTゲルの下隅の長方形の位置によって示されるように、DGTゲルは、根球の土壌からガラス板に移すときに水平に反転されることに注意してください。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. データ処理と校正
    1. スプレッドシート ソフトウェア (表) の各簡略化された行の生データ ファイル (.xl) をインポートします。生データテーブルは、cps の各同位体の ICP-MS 読み取り値 (データポイント) と s の対応する時間ポイントを示しています。すべての行を別々の列に並べ替えます。
    2. 内部標準(13C)の信号安定性と適切な洗浄時間のラインスキャンデータを評価します。
    3. ラインアブレーションの前に記録されたすべてのガスブランク値(すなわち、レーザーウォームアップ時間中)から各同位体の平均ガスブランクを計算し、背景信号を補正するために各同位体の対応する生の強度から平均ガスブランクを差し引きます。
    4. 各同位体(cps)の信号強度をデータポイントごとに内部標準(cps)の信号強度で割って内部正規化を適用し、材料のアブレート量とインストゥルメンタルドリフトの変動を補正します。
    5. 開始前と各アブスレートラインの終了後にデータを切り抜き、バックグラウンド信号を削除します。データ テーブルを転置して、各行がアブレートされた線に対応し、各列が正規化された同位体強度値に対応するグリッド 行列を取得します。各同位体の行列を個別のワークシートに分けます。
    6. キャリブレーション標準とキャリブレーションブランクの同位体あたりの平均正規化された信号強度比を計算し、x値としてゲル標準分析物の負荷(μg cm-2;SI S4を参照)を使用して、キャリブレーション関数(y = ax + b)を計算します。線形性47に対する各同位体の較正関数を評価する。
    7. サンプルデータマトリックスにキャリブレーション関数を適用します。正規化された信号強度比 figure-protocol-29 を figure-protocol-30 、(μg cm-2)ゲル分析物負荷に変換し、その後 figure-protocol-31 、Eq. 4およびEqに従って各同位体およびデータポイントの時間平均溶出束(pg cm-2 s-1)に変換します。
      figure-protocol-32
      figure-protocol-33
      ここで 、a はキャリブレーションラインの傾き 、b はキャリブレーションラインの切片 、t(s) は溶質サンプリング中のゲル導入時間である。
    8. 各分析対象の校正済みサンプル データ マトリックスを txt ファイルとして保存します。
  2. 画像生成
    注: 結果の画像では、合成された溶質の流束勾配が生じる可能性があるため、画像生成のすべてのステップでピクセル補間操作を避けるようにしてください。
    1. 校正済みのサンプル データ マトリックス (.txt) を、イメージ解析ソフトウェア (表) のテキスト イメージとしてインポートします。
    2. レーザースキャン速度と ICP-MS スキャンサイクルの全長を乗算して x 方向のピクセルあたりの距離(すなわち、横方向の解像度)を計算します(例えば、スキャン速度が 200 μm s-1で、スキャンサイクルの全長が 0.25 s であると仮定すると、横方向の解像度は 50 μm に相当します)。y 方向のピクセルあたりの距離は、インターライン距離に相当します (図 6)。
    3. 画像の縦横比補正係数を計算します。したがって、x 方向のピクセルあたりの距離 (例えば、50 μm) で、1 ピクセル当たりの距離を y 方向 (例: 300 μm) で除算します。取得した y/x 補正係数 (この例では 6) を'Scale' の下に適用します。ピクセルあたりの距離(μmまたはmm)をx方向に適用し、「スケールを設定」でスケールします。
    4. 「検索テーブル」、すなわち、溶質画像の化学勾配をより良く視覚化するための擬似色のスケールを適用し、表示範囲の下限/上限を制御するために画像の「カラーバランス」を調整します。'キャリブレーションバー' を追加し、溶質のイメージを tiff-ファイルとして保存します。
    5. イメージ解析ソフトウェアの [システムにコピー] コマンドを使用して溶質イメージをコピーし、デスクトップ パブリッシング ソフトウェア (資料一覧) に貼り付けます。スケールマッチ、整列し、3.1.7で得られたROIの写真と溶質画像を構成します。
      注 : コピーする前に、たとえば、XScale10 を適用して、解像度の高いパブリッシュに十分なピクセルを確保するために、10 の X Scale を適用し、'Y Scale'を 10 アンダースケールに設定して、セルの解像度イメージのサイズを変更します。
DGTゲル製造植物栽培その中で溶質のサンプリング溶質フラックスマッピング
HR-MBG
1週間 		土壌準備
1週間 		ゲル塗布
ゲルあたり1時間 		サンプル準備
ゲルあたり1時間
HR-ABG
3日間 		リゾトロンアセンブリ
1 回のレプリケートにつき 2 時間 		溶質サンプリング期間
変数(通常は24時間) 		LA-ICP-MS分析
ゲルあたり1日
人事-CBG
3日間 		植物の成長
研究に依存 		ゲル検索
ゲルあたり1時間 		データ処理
ゲルあたり4時間
ゲル乾燥
2~3日 		画像生成
画像あたり10分

表 1: DGT LA-ICP-MS 手法の一般的な手順の概算時間。

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DGTイメージング法の能力とデータの詳細を示すために、ファゴピラム・エスキュレンタムとサリックス・スミシアナの根に隣接する土壌中の複数の不安定な栄養素および汚染物質溶質種のサブmm、2Dフラックス分布をまとめました(図7)。プロトコルの一般的な手順の概算時間を表 1に示します。

図7の溶質画像は、HR-MBGまたはHR-CBG結合ゲルのいずれかを使用して3つの異なる試験で生成された。化学画像は、使用するLA-ICP-MSパラメータに応じて、X軸に沿って82〜120μm、y軸に沿って300〜400μmの空間解像度での2D溶質フラックス分布を示しています。画像のキャリブレーションとサイズ変更の間に補間が適用されなかったため、単一ピクセルは測定されたデータポイントを表します。ROIの写真画像との溶質画像の位置合わせは、異なる要素のサブmm、2D溶質フラックス分布が土壌構造および根形態に応じて非常に可変であることを明らかにします。これは、土壌根圏植物系の元素の差動生物化学的挙動と、土壌マトリックスおよび植物根との相互作用に起因する可能性があります。

図7Aでは、不安定な無機Mg、Al、P、MnおよびFe溶質フラックスを、NH4NO3で受精した炭酸塩を含まない土壌で成長した若いF.エスカレントの根の周りに視覚化した。サブmm溶質分布は、根取りによる古い根部と並んでAl、P、Feフラックスのゾーンが減少し、F.esculentum根の局所的なP動員プロセスのために根頂部でMg、Al、P、MnおよびFeフラックスが非常に増加することを示した。根先は土面の後方に位置しているため、写真画像にはほとんど見えないことに注意してください。図7Bは、Zn、CdおよびPbで適度に汚染された土壌で成長した金属耐性S.スミシアナの根の周りを含むMn、Fe、Zn、CdおよびPbを含む不安定な微量金属の分布を示す。溶質画像は、特にZn、Cd、Pbの固有の枯渇を直近の根の位置に視覚化し、S.スミシアナの根が汚染された土壌中の陰唇微量金属の局所的な流しとして機能することを示した。また、局在化したZn、CdおよびPbフラックスの増加が観察され、即時の土壌根界面でのこれらの微量金属の蓄積を示す。

多元素溶質イメージングに加えて、提示された方法は、平面光素34のような相補的な拡散ベースのイメージング技術と組み合わせることもできます。これは、図7Cにおいて、S.スミシアナの根層圏における不安定微量金属の分布が、結合された単層平坦なオプトナードDGTカチオン結合ゲル33を用いてpHの分布と共局化したところである。土壌基材を(NH4)2SO4で受精し、バルク土に比べて根軸に沿ってpH減少を〜1単位に導いた。pH減少は、Mn、Fe、Co、Ni、CuおよびPbの溶質フラックスの増加と共局化し、pH誘導金属可溶化を示唆した。

また、これらの結果の例は、得られる可能性のあるイメージングアーティファクトの一部を示す。例えば、構造土の不均質性、例えば、 図7AのROI画像の下3分の1に水平線として観察され、この位置で結合ゲルへの拡散が限定的になる土壌ゲル接触不連続性を引き起こす可能性がある。逆に、根茎の過度の土壌圧密は、無酸素症に向けて土壌酸化還元状態の人工的なシフトをもたらす貧しい気孔率につながることができます。これは 図7Bに示されており、溶質画像の高い高いMnおよびFeフラックスの広範な領域がROI画像の土壌の密集した層と視覚的に一致する。これは、高い土壌圧縮による土壌酸化還元電位の低下を示唆し、その結果、還元溶解および酸化還元感受性要素の可溶化が生じる。従って充填後に土壌表面の慎重な根茎の充填と目視検査が推奨されます。

figure-results-1
図7:異なる土壌根のインターフェース間での不安定な栄養素と汚染物質溶質種の2Dサブmm分布。(A) 若いF.エスカレンタム根の周りにアニオン性PとカチオンMg、Al、Mn、およびFe溶出物の分布。アニオン性およびカチオン性溶質の共局的なサンプリングは、約75%WHCの土壌水飽和度で24時間のHR-MBGを使用して達成された。Al、P、Mn の画像は、キャリブレーション済みのfDGT値 (pg cm-2 s-1)として表示されますが、Mg および Fe イメージは13C 正規化された強度を示します。スケールバーは1cmを表します。この図はref.48から適応される。(B)Zn、Cd、Pbで適度に汚染された土壌で成長したS.スミシアナ根の周りのMn、Fe、Zn、CdおよびPbの分布は、約80%WHCの土壌水飽和度で20時間のHR-CBGを用いて試料採取した。すべての画像は、較正されたfDGT値(pg cm-2 s-1)として表示されます。スケールバーは0.5cmを表します。この図はref.3から適応されます。(C)PHとS.スミシアナ根の周りに成長したS.スミシアナ根の周りにpHと複数のカチオニック溶質の分布は、Cd.と共局在化pHと溶質ダイナミクスの共局在化をHR-MBGプロトコルの改変を用いて達成され、同時溶質サンプリングおよび平面光イメージング33を可能にする。Mn、Cu、Zn、およびCd画像は、較正されたfDGT値(pg cm-2 s-1)として表示され、Fe、Co、NiおよびPb画像は13のC正規化された強度を示す。スケールバーは1cmを表します。この図はref.33から適応しています。提示された数字はCC BYの下でライセンスされている引用された記事3、33、48から複製される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 1.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで紹介する溶質イメージングプロトコルは、土壌植物環境における2D栄養および汚染フラックスを可視化し、定量化するための多目的な方法です。それは、土壌根界面で陰唇溶質種のサブmmスケール多元素画像を生成する能力において独特であり、根層圏における溶質勾配を実質的に4に測定するための代替方法の達成可能な空間分解能を超える。DGTのインテク・サンプリング手法を対象とし、LA-ICP-MSのような高感度な化学分析法と組み合わせて、土壌または類似の基質で成長した個々の植物根の周りの溶質フラックスダイナミクスの詳細な調査を容易にします。シンクベースのサンプリングプロセスのために、得られた画像は視覚化された溶物の可否を反映し、したがって植物の利用可能性10の推定である。溶質フラックスの方法固有の測定は、植物が入手可能な栄養素画分としての解釈性のようなかなりの利点を有するが、フラックス測定は、孔水濃度測定よりも理解する方がはるかに簡単ではない。バルク土壌用途の標準的なDGTサンプリング幾何学(具体的には、その設定で使用される0.8 mm-厚の拡散ゲル)は、実際の孔水濃度、csoln、バルクDGT測定による時間平均の孔水濃度推定値cDGT、および溶質種の再供給ダイナミクスに関するこれらのパラメータの解釈を比較することができます。しかし、このような比較は、非常に薄い拡散層を持つDGTアプリケーションをイメージングに基づいて行うことはできません。したがって、DGTイメージングの結果は、常に単純で解釈が速いとは限らず、従来の孔水濃度測定に直接匹敵するわけではありません。

この方法を適用する場合、根茎成長容器の充填と水を主に行う重要なステップを慎重に検討する必要があります。土壌を根茎に充填する際には、植物の根が強く圧縮された土壌に浸透できず、根の成長が阻害されることから、土壌をあまり圧縮しないようにすることが非常に重要です。私たちは、強く圧縮された土壌を避け、土壌が通常あまり圧縮されていない根ツォトロン成長容器の内側の端に沿って成長する根を観察しました。この場合、根茎の中央に位置する個々の根は、DGTゲルを簡便に塗布することができ、全く現れず、ゲルの塗布を効果的に阻害する。我々の研究室では、経験は1.0-1.4 g cm-3の乾燥した土壌かさ密度が妨げられない根の開発を可能にすることを示した。さらに、過剰な土壌圧縮は、酸化還元に敏感な元素および生物地球化学的に関連する種の溶解性に関するアーティファクトの潜在的な供給源でもある。総孔容積が減少し、細孔径分布が高度に圧縮された土壌で低径に向かってシフトすると、空気充填された大口径の細孔体積が少なくなり、局所的に還元条件を引き起こし得る。その結果、MnIII/IV-およびFeIII-オキシドが減少し、Mn2+およびFe2+フラックスが増加する可能性があります。例えば、リン酸塩や微量栄養素に対して重要な吸収部位であるFe-オキシドの溶解は、ソルベッドおよび/または共沈殿種を解放し、それによって生物地球化学的に関連する種の束束を人為的に上昇させる可能性がある。同様の問題は、成長容器に水を与えすぎると発生する可能性があります。成長容器の上部にある小さな土壌表面積を介した蒸発は低く、土壌は植え付け後数週間まで水飽和状態のままであり、酸化還元物を引き起こす可能性もあります。

もう一つの重要な考慮事項は、製造されたHR-DGT結合ゲルの化学的機能性である。プロトコルに従うことによって、結合相の均質な分布を有する薄いゲルが得られる。ゲルが不均一な材料分布の領域(例えば、ゲルの穴または結合相の凝集部)を有する場合、これらの領域を除去するか、または、あまりにも広範な場合は、ゲル製造プロトコルを繰り返す必要がある。正しく調製されれば、ゲルは直ちにゲルに拡散する標的溶質種を結合できなければならないし、定量的に27は、分析物特異的なゲル結合能力によって決定される。ゲル容量を超えると汚染されていない土壌ではあまり問題はありませんが、金属汚染土壌や生理食類土壌環境で考慮する必要があります。ゲル結合相の飽和は、定量的な溶質サンプリングを損なうだけでなく、ゲル中の結合相間の溶質の横方向拡散をもたらし、小規模な溶質フラックス特徴の不定の局在化をもたらす。したがって、標的土壌環境において非常に多量の不安定な栄養素/汚染物質が予想される場合は、予備試験を行う必要があります。予想されるDGT負荷を推定するために、バルク土壌DGTピストンサンプリング後にゲル溶出および湿式化学分析を15,49に適用することができる。必要に応じて、DGTの展開時間を調整してゲル接触時間を短縮し、したがって、容量閾値を超えるゲル飽和を回避することができます。逆に、予備試験は、極めて低い溶質荷重が予想される場合に必要なゲル接触時間および/またはLA-ICP-MS感度を同定するのにも役立つ可能性があり、これは天然土壌背景レベル15で微量元素溶質をマッピングするために重要である可能性がある。また、正しいDGTゲル機能は、DGT LA-ICP-MSキャリブレーション標準の調製において、ゲルの制御ローディングを介して実験アプリケーションの前に検証する必要があります。このゲル標準は、LA-ICP-MSによって決定されるサンプルゲルローディングが期待される範囲内にあるかどうかを評価するために使用できる、マトリックスマッチ参照ゲル検体ローディングを提供します。ガスとメソッドブランクのバックグラウンドノイズと異なる信号を得ることができない場合、オペレータは、トレース要素解析のための実験室の手順が実装され、すべてのプロトコルステップが正しく実行されたことを確認する必要があります。時には、DGTゲルは、土壌露出、レーザービームではなくガラス板に向かってロードされた側で溶質サンプリング後に誤って反転し、最終的な溶質フラックス画像で低信号強度と誤って反転された特徴をもたらします。

LA-ICP-MS 分析の間に大量のデータが生成され、評価にかなりの時間がかかります。当研究室では、標準のスプレッドシートソフトウェアを使用して、ターゲットデータ出力形式に合わせた社内データ評価スクリプトを使用しています。半自動の並べ替えとキャリブレーションの後、画像プロットはオープンソースのオープンアクセス画像解析ツール(ImageJ、フィジー50)を使用して行われます。この方法では、データの並べ替え、評価、および表示を完全に制御できます。さらに、データ処理時には、ピクセルの補間は慎重に避けるべきです。ピクセル補間は、化学画像の勾配を平滑化し、その結果、しばしば円形の要素分布特徴が軟化し、したがって、元のデータの望ましくない変化をもたらす。ピクセル補間は、多くの画像処理ソフトウェア製品での再スケーリングと再フォーマット操作の標準的な手順ですが、通常は選択解除できます。

結論として、この方法は、天然土壌根球植物系における栄養素および汚染ダイナミクスを理解するための重要な進歩である。DGTのみの用途に加えて、この方法は、平面光変換3、33、42、43、48、51およびzymography 20、21、22、23、24のような他の拡散ベースのイメージング技術と組み合わせることができ、さらに追加の要素および土壌パラメータを含むために開発され得る。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、オーストリア科学基金(FWF):P30085-N28(トーマス・プロハスカ)とオーストリア科学基金(FWF)とオーストリア連邦科学基金(FWF)と連邦オーストリア州:P27571-BBL(ヤコブ・サントナー)によって共同出資されました。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(NH4)2S2O8(過硫酸アンモニウム;APS)VWR21300.260≥98.0%、分析試薬
2-(N-モルホリノ)-エタンスルホン酸(MES)Sigma-AldrichM8250-100G≥99.5%
アクリルアミド溶液Sigma-AldrichA4058-100ML40%、電気泳動用
分析物塩n/an/a分析グレード以上の水溶性分析物塩を使用
Buechner漏斗VWR511-006513 cm プレート径
化学平衡モデリングソフトウェアKTH スウェーデンn/aビジュアル MINTEQ
クランプローカルウェアハウスn/a
デスクトップパブリッシングソフトウェアAdobe Inc.n/aInDesign CS6
DGT 架橋剤DGT Research Ltdn/a2%, アガロース誘導体
DGTピストンサンプラーDGT Research Ltdn/a直径2cm露光窓
デジタル一眼レフ(DSLR)カメラキヤノン株式会社n/aキヤノン EOS 1000D
分散装置IKA3737000Ultra-Turrax T10 Basic
両面テープテサ56171
エタノールSigma-Aldrich34923Puriss. p.a., absolute, ≥99.8%
ゲルあぶらとり紙Whatman10426981Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm
thickness Gel dryerUniEquipn/aUNIGELDRYER 3545
高圧マイクロ波システムAnton Paarn/aMultiwave 3000
HNO3VWR1.00456.2500P65%, ISO for analysis
水平シェーカーGFL305
HydroMed D4AdvanSource Biomaterials Corp.n/aエーテル系親水性ウレタン
ICP-MS ソフトウェアPerkin Elmern/aSyngistix
画像解析ソフトウェア国立衛生研究所 (NIH)n/aImageJ フィジー,
https://fiji.sc/ Knife-coating deviceBYK5561Single Bar 6″, 0.5 mils
LA softwareElemental Scientific Lasersn/a で自由に入手可能ActiveView
LAシステム、Elemental Scientific Lasers、n/aNWR193
層流ベンチTelstar Laboratory Equipment B.V.n/aクラスII生物学的安全キャビネット
マグネチックスターラーIKA0003582400C-MAG MS 7
保湿フィルムBemis Company, Inc.PM999パラフィルム M、4" x 250'N,N,N
',N'-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)Sigma-AldrichT9281-50MLBioReagent、電気泳動に最適、~99%
NaNO3Sigma-Aldrich229938-10G99.995% 微量金属ベース
NaOHSigma-Aldrich1064980500分析用
ペレットオーバーヘッドシェーカーGFL3040
パーフルオロアルコキシアルカン(PFA)バイアルSavillex200-015-2015 mL 標準バイアル、丸みを帯びた内部
pH メーターThermo Scientific13-644-928Orion 3-Star 卓上 pH メーター
pH プローブThermo Scientific8157BNUMDOrion ROSS Ultra pH/ATC Triode
Plastic cutterDGT Research Ltdn/aDGT research Ltdの空の架橋剤バイアルを使用
プラスチックピンセットSemadeni602
Plasticine地元の文房具店n/aパラフィンワックスと増量剤に基づく非乾燥プラスチックモデリング質量
ポリカーボネート膜ディスクWhatman110606Nuclepore 親水性膜、直径25 mm、0.2 & マイクロ;m孔径、10&マイクロ;mの厚さ
ポリカーボネート膜シートWhatman113506Nuclepore親水性膜、8 × 10 in、0.2 µm孔径、10&マイクロ;m厚さ
ポリエーテルスルホンメンブレンディスクポールコーポレーション60172ア450メンブレンディスクフィルター、直径25mm、0.45µm孔径、厚さ0.14mm
ポリエーテルスルホン膜シートポールコーポレーション、60179Supor 450、膜ディスクフィルター、直径293mm、0.45&マイクロ;m孔径、厚さ0.14 mm
PTFEホイルHaberkornn/a50 & micro;m 厚さ
PTFEスペーサーHaberkornn/a可変厚さあり
PTFEコーティングされたカミソリの刃Personna GEM62-0178ステンレス製シングルエッジブレード(コーティング)
PTFEコーティングされたタイゴンチューブS-prep GmbHSP8180径0.32cm
四重極 ICP-MSパーキン・エルマーN8150044NexION 2000B
定量的濾紙、454VWR516-0854粒子保持12-15&マイクロ;m
表計算ソフトマイクロソフト株式会社n/aMicrosoft Excel 2016 (v16.0)
ステンレス製カッター地元の鍵屋n/a直径 2.5 cm
懸濁粒子試薬-イミノジアセテート (SPR-IDA)Teledyne CETAC Technologiesn/a10 & micro;m直径ポリスチレンビーズ、10%(w / v)ビーズサスペンション
トランジスタトランジスタロジック(TTL)ケーブルn/an/a機器に適したTTLケーブルを特定するためにICP-MS技術者に相談してください
2ボリュームセル元素科学レーザーn/a2ボリュームセル 1
ビニール電気テープ3Mn/aスコッチスーパー33+
浄水システムテルモElectron LED GmbHn/aTKA-GenPure
ZrOCl2 × 8H2OAlfa Aesar86108.3099.9 %, 金属ベース
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