可溶性細胞外マトリックス(ECM)産生のためのヒト膵臓の界面活性剤フリー脱細胞化

サマリー

この原稿に記載されているプロトコルは、ヒト膵臓から可溶性細胞外マトリックス(ECM)を作製する手順を説明しています。このプロトコルを通じて得られた可溶化ECM粉末は、in vitroおよび場合によってはin vivo設定における膵島の微小環境の再現に使用できる。

要約

膵島移植(ITx)は、ベータ細胞置換術の標準治療となる可能性を秘めていますが、その結果は全膵移植で得られるものよりも劣っています。現在、ヒトの膵島隔離に使用されているプロトコルは、臓器の酵素的消化に基づいており、それによって膵臓が破壊され、体とのつながりが失われ、膵島が不可逆的に損傷を受けるため、精査されています。膵島の損傷は、膵島のニッチの3Dフレームワークを表し、その損失が膵島の真生理学と両立しない細胞外マトリックス(ECM)の破壊などの重要な要因によって特徴付けられます。研究者たちは、哺乳類の膵臓に由来するECMベースの足場を使用して、この問題に対処し、最終的に膵島の生存率、機能、および寿命を改善することを提案しています。このような足場を得るための現在利用可能な方法は、主に洗剤ベースであるため、過酷です。したがって、ECMの損傷が少なく、膵臓ECMの重要なコンポーネントを保存できる、洗剤を使用しない新しい方法を提案します。その結果、新たに開発された脱細胞化プロトコルにより、ECM成分を保持したまま完全なDNAクリアランスを達成できたことが示されています。得られたECMは、細胞毒性について試験され、グルコースチャレンジで刺激されるとインスリン分泌を伴う陽性の細胞挙動を示したヒト膵島にカプセル化されました。私たちは、従来のイオン性および非イオン性化学洗剤を使用せずに、ヒト膵臓の脱細胞化のための新しい方法を提案します。このプロトコールとそれを用いて得られたECMは、in vitroおよびin vivoの両方のアプリケーションに使用できる可能性があります。

概要

膵島の単離は、膵島とその周囲の細胞外支持構造との間の接続の酵素消化を通じて行われる細心のプロセスです。この細胞外マトリックス(ECM)の破壊は、単離プロセス中に起こる膵島の損傷を特徴付ける重要な要因の1つです1,2,3,4。膵島周囲ECMは、内分泌膵臓の必須無細胞成分です。それはタンパク質と多糖類で構成されており、それらが相互作用して架橋して、生理学的恒常性を構造的および生化学的に支える三次元ネットを形成し、このin vitro微小環境の再現に役立ちます^2,5,6。膵島とECMとの間の基本的なシグナル伝達プロセスの喪失は、in vitroおよびin vivoで膵島の生存を制限する要因の1つとして認識されています2,7,8,9,10。

動物由来およびヒト由来のECMは、膵島の微小環境11,12,13,14,15,16,17,18,19の再現に広く使用されている。ECMがラット膵島細胞の接着、増殖、および長期培養維持を強化する能力が文献²⁰で初めて報告されて以来、他の多くの研究が、ヒト膵島とのネイティブECM相互作用の回復が膵島機能を強化するという強力な証拠を提供してきた^21,22。例えば、最近のデータは、ECMでカプセル化された膵島が糖尿病マウスの血糖コントロールを有意に改善し、新しい細胞ベースのインスリン送達プラットフォーム²³におけるインスリンの送達を増強し、促進することを示している。さらに、研究は、膵臓ECMの重要な成分の取り込みが、β細胞^24,25,26,27の内分泌機能を有意に改善することができることを実証している。

文献に記載されているECM製造プロトコルは、Triton X-100やドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの化学洗剤の適用に基づいています。優れたDNAクリアランスを提供するにもかかわらず、脱細胞化プロセスで使用される化学物質は細胞毒性があり、高価であり、脱細胞化組織に残留することは、潜在的な臨床応用の観点から懸念をもたらします。

これらの観察に基づいて、この研究の目的は3つありました:まず、イオン性または非イオン性化学洗剤の使用を最小限に抑えたヒト膵臓の脱細胞化方法を開発すること。第二に、組織培養用の可溶性ECM足場を作製すること。第三に、膵臓ECMを特徴付けて、その細胞毒性と膵島細胞機能への影響を評価すること。この特性評価は、可溶化した膵臓ECMが単離された膵島の膵臓微小環境を再現するのに有益であることを示しているため、すべての細胞培養ベースのアプリケーションに必要です。本明細書に記載されているのは、ヒト膵臓に対する効果的で界面活性剤を含まない脱細胞化法、ECMの特性評価、およびカプセル化された単離されたヒト膵島の生存率および機能に対するECMの影響である。

プロトコル

この調査研究は、ウェイクフォレストバプテスト医療センターの人間研究委員会によって承認されました。ヒトの膵臓は、カロライナドナーサービスを通じて臓器提供者から倫理的に入手されました。臓器提供者は、UNOSの規則に従って、人間に関連する感染症のスクリーニングを受けました。臓器は滅菌保存液で受け取り、使用まで保管しました。ラボへの配送時に、すべての臓器が検査され、組織学的目的のために天然の膵臓のサンプルが収集されました。その後、臓器を凍結し、さらに使用するまで-20°Cの無菌状態で保存しました。

1. ヒト膵臓の外科的準備

注:凍結した膵臓を4°Cで一晩解凍しました。

1. ヒト ?? 臓の外科的解剖を開始する前に、950 mLの脱イオン水(dH₂O)、50 mLのヨウ素ベースの試薬、および1%ペン/連鎖球菌溶液からなる1 Lの洗浄液を準備します。.
2. 外科的解剖中は、滅菌手袋と白衣を着用してください。すべての手術は、汚染の可能性を避けるために、細胞培養グレードのフードの下で行ってください。
3. 滅菌輸送バッグから滅菌胎盤洗面器に ?? 臓を移します。.膵臓が臓器の頭を左に、尾を右に向けていることを確認します。
4. 滅菌ハサミと歯のない鉗子を使用して、膵臓の頭から十二指腸を慎重に解剖します。十二指腸に穴を開けると、汚染の可能性が高くなるため、注意してください。
   注:消化管に穴が開いている場合は、すぐに穴をクランプして、解剖を進めてください。
5. 膵頭部の解剖が完了したら、十二指腸を適切なバイオハザードバッグに廃棄し、その廃棄に関する施設のガイドラインに従ってください。.
6. 主要な血管や総胆管など、膵臓の頭部の周りに残っているすべての膵臓外組織を解剖して廃棄します。これらは通常、臓器調達時に非吸収性の縫合糸でマークされます。組織は機関のガイドラインに従って廃棄してください。
7. 膵臓の尾部を取り巻くすべての膵臓外組織と膵臓周囲脂肪組織を解剖して廃棄し、脾臓血管を露出させます。
8. 脾臓の血管茎が露出したら、脾臓を切除し、膵臓の後面(脾動脈と静脈)に付着しているものを含む脾臓血管全体を解剖します。脾臓を処分し、施設のガイドラインに従って組織を取り除きます。
9. はっきりと見える膵臓外脂肪、特に膵周囲脂肪を適切に解剖して処分します。
   注:膵臓の尾のレベルでは、後腹膜が見える場合があります。これは、歯のない鉗子で持ち上げ、それに応じて外科用鉗子で取り除き、適切に廃棄する必要があります。これで、膵臓には膵臓以外の組織がなくなります。
10. 膵臓を解剖し、手術用ハサミ、滅菌された組織学的ブレード、または外科用メスを使用して、1 cm³ キューブの膵臓組織を取得します。この解剖後に得られた膵臓組織キューブは、脱細胞化プロセスを経ます。脱細胞化を受ける膵臓キューブの平均数は、臓器の固有の特性に依存します。提示された研究では、平均して40〜60個の膵臓キューブが脱細胞化を受けました。
11. 手順2.1に進みます

2. 膵臓組織の脱細胞化

注:このプロトコルは、平均重量が100gの膵臓で使用されました。したがって、この脱細胞化技術を使用するときにこの重量を超えることはお勧めしません。

1. ステップ1.10で以前に解剖したすべての膵臓組織を、洗浄液と一緒に滅菌プラスチック容器( 材料表を参照)に入れ、室温(RT)で15分間インキュベートします。
2. 滅菌鉗子を使用して膵臓組織を取り出し、滅菌されたエンドトキシンフリーの脱イオン水が入った新しい滅菌容器に入れます。容器のキャップをしっかりと閉め、設定温度4°C、振とう速度180〜200rpmで24時間冷蔵オービタルシェーカーに置きます。
3. 膵臓組織の入った容器を取り外し、外側を適切に清掃してから、プロセスを続行するためにフードに入れます。
4. 外科用鉗子を使用して膵臓組織を切除し、1 Lの脱イオン水、50 mgのDNase I、および0.0025%塩化マグネシウムとともに、新しい滅菌容器に入れます。容器のキャップをしっかりと閉め、温度を37°Cに設定し、振とう速度を100rpmにして6時間、オービタルシェーカーに入れます。
5. EDTA-Trizma溶液を調製します
   1. 新しい滅菌1L容器を集め、フードに入れる前に適切に清掃してください。1 LのEDTA-Trizma溶液を調製するには、985 mLの滅菌脱イオン水、7.5 mLのTris-HCl Buffer、および7.5 mLのEDTA溶液を追加します。使用するまで4°Cで保管してください。
6. 膵臓組織を封入している容器を取り外し、外側を適切に清掃してから、プロセスを続行するためにフードに導入します。
7. 外科用鉗子を使用して膵臓組織を切除し、1LのEDTA-Trizmaベースの溶液を入れた新しい滅菌容器に入れます。容器のキャップをしっかりと閉め、4°Cに設定された温度と180〜200rpmの振とう速度で18時間オービタルシェーカーに入れます。
8. 膵臓組織が入った容器を取り外し、外側を適切に清掃してから、プロセスのためにフードに導入します。
9. 滅菌鉗子を使用して膵臓組織を取り出し、滅菌エンドトキシンを含まない脱イオン水を入れた新しい滅菌容器に入れます。容器のキャップをしっかりと閉め、設定温度4°C、振とう速度180〜200rpmで24時間冷蔵オービタルシェーカーに置きます。
   注:この処理期間中、色が著しく変化し、組織が明るく見えます。
10. 膵臓組織を採取し、滅菌済みの50mL遠心分離チューブに保管し、その後の凍結および凍結乾燥のためにチューブあたり最大25mLに達します。遠心分離チューブの数は、膵臓のサイズによって異なります。サンプルは-80°Cで保存してください。

3.膵臓ECM粉末の製造–凍結乾燥とクライオミリング

1. 脱細胞化した物質を-80°Cで最低24〜40時間保存した後、膵臓ECMを凍結乾燥機に移します。
2. 凍結した材料を凍結乾燥機に移し、材料の解凍を防ぎます。
   注:凍結乾燥ステップは、プロセスを受ける各チューブ内の材料の量や凍結乾燥のために露出する表面など、いくつかの要因に応じて約3〜5日かかります。脱細胞化した組織は、各チューブ内の25mLのレベルを超えないようにし、チューブを45°の角度で凍結して、凍結乾燥が開始されるとより多くの表面が容易に露出できるようにすることが推奨されます。チューブから蓋を取り外します。
3. 凍結乾燥後、材料を細胞培養グレードのフードに移します。
4. 乾燥させたECMの各ピースを滅菌ハサミを使用してそのサイズの半分にカットします。これらの乾燥したECMピースは、自動粉砕プロセスにかけられ、ECMパウダーが生成されます。クライオミルド自動処理装置を使用して、温度の上昇とそれに伴うECMの生物学的特性の変性を回避します。フライス加工後に微粉を得るために、クライオミリングマシンの設定を必ず調整してください。
   注:この研究では、BMIが30<ドナーからの膵臓が使用されました。BMI>30のドナーからの膵臓は、より多くの実質内脂肪を含む傾向を示しました。凍結乾燥のプロセスは最適とは見なされず、脂肪含有量によって阻害される可能性があります。凍結乾燥後、組織が目に見えて油性である場合、ECM粉末の製造には最適ではないため、廃棄する必要があります。

4. 膵臓ECMの可溶化

注:この時点で、平均サイズの膵臓(100 g)から、脱細胞化膵臓粉末の収率は1〜2 gです。

1. 滅菌プラスチックヘラを使用して、ECM粉末1gを計量します。
2. 前述のプロトコルに従って可溶化を達成します:100mLのECMを100mLの0.01M HClおよび100mgのペプシンに48時間溶解し、RTで絶えず攪拌しながら²⁸時間。
3. 48時間後、NaOHを使用して酸性ECMのpH(pH = 7)を中和し、酸性ECMを含むビーカーを氷上に保持してゲル化を防ぎます。
   注:ゲル化速度は、温度、コラーゲン含有量、pH、および中和溶液によって異なります。この調査研究では、0.01 MのNaOHを使用しました。pH中和のために添加したNaOHの量は約100mLでした。酸性ECM溶液を中和しながら、pHを複数回測定することを検討してください。
4. 中性ECM溶液を滅菌済みの50 mL遠心分離チューブに移します。チューブを閉じて、遠心分離機に入れます。可溶化したECMを含むチューブを最大速度(12,000 x g)で4°Cで15分間遠心分離します。 遠心分離後、チューブを細胞培養フードに移します。
   注:サンプルの遠心分離後、ECMの不溶性成分はチューブの底部に堆積し、可溶化したECM溶液は上清の上部に沈着します。
5. 滅菌技術を使用して、可溶化ECM溶液を含むチューブの上清を収集し、それを新鮮な50 mLチューブに移し、チューブあたり最大25 mLに達します。
6. ECM溶液チューブは-80°Cで保管してください。

5.膵臓ECM粉末の製造–凍結乾燥と保管

1. 可溶性ECM溶液を-80°Cで少なくとも24〜40時間保存した後、チューブを凍結乾燥機に移します。
2. 凍結した材料を凍結乾燥機に移し、材料が解凍しないようにします。
   注:凍結乾燥ステップは、プロセスを受ける各チューブ内の材料の量や凍結乾燥のために露出する表面など、いくつかの要因に応じて約3〜5日かかります。可溶化したECM溶液は、各チューブ内の25 mLのレベルを超えないようにし、凍結乾燥が開始されたら、より多くの表面を容易に露出できるように、チューブを45°の角度で凍結することをお勧めします。凍結乾燥する前に、ファルコンチューブから蓋を外します。
3. 可溶化したECM溶液を凍結乾燥した後、材料を細胞培養グレードのフードに移します。完全な凍結乾燥後、微細なECM粉末が見えます。
   注:得られた収率は、1gの脱細胞組織から700mgです。
4. 可溶化したECM粉末を保管するか、細胞培養目的で使用してください。
   注意: ECMは、すぐに使用する場合は4°Cで、後で使用する場合は-20°Cで、長期保存する場合は-80°Cで保管することをお勧めします。

6. 組織学的染色による膵臓ECMの特性評価

1. 臓器の送達直後、脱細胞化の前に天然の膵臓の一部を収集します。これを10%ホルマリンで24時間固定します。.サンプルを脱イオン水で洗浄します。パラフィンに埋め込む前に、等級付けされたアルコールで脱水し、5mmのセクションにスライスします。
2. 脱細胞化プロセスの最後に、脱細胞化材料のサンプルを採取し、10%ホルマリンで24時間固定します。サンプルを脱イオン水で洗浄します。パラフィンに埋め込む前に、等級付けされたアルコールで脱水し、5mmのセクションにスライスします。
3. 脱細胞化が成功したことを確認するには、天然の膵臓と脱細胞化した対応物の両方でH&EおよびDAPI染色を行います。
4. 組織学的特性評価のために、Masson's Trichrome (MT) および Alcian Blue (AB) 染色を行い、それぞれコラーゲン構造と GAG 構造を強調します。

7. 可溶性ECM粉末の特性評価

1. 先述したように、天然膵臓組織および可溶性ECM粉末のDNA含量および全コラーゲン分析を実施する²⁹。
2. 硫酸化グリコサミノグリカン(sGAG)は、市販のキットから提供されるプロトコールに基づいて定量します( 「材料の表」を参照)。マイクロプレート分光光度計を使用して、膵臓ECMの硫酸化sGAG含有量を波長595 nm³⁰で測定します。
   注:DNA含有量を乾燥組織のng / mgとして報告し、コラーゲンとGAGの含有量を乾燥組織のμg / mgとして報告します。

8. ECMと培養によるヒト膵島のカプセル化

注:ヒト膵島は商業的に入手されました( 材料の表を参照)。

1. 到着後、ヒト膵島を非組織培養処理プレートで24時間、標準条件下で10cmプレートごとに約2,000IEQの密度で培養します。
2. ヒトの膵島を操作して、ECMが膵島の機能と生存率に及ぼす影響を、自由島、アルギン酸にカプセル化された膵島、およびアルギン酸ECMにカプセル化された膵島でテストします。
   注:上記の膵島の群を、ECMが膵島の機能と生存率に及ぼす影響を評価するために、標準条件下で最大8日間in vitroで培養しました。
3. はかりでアルギン酸塩を秤量し、HBSSで遠心分離管に懸濁して、1.5%(w / v)の比率を得ます。遠心分離機のチューブをローテーターに4°Cで一晩置きます。
   注:アルギン酸塩の分子量は75〜200 kDAで、G/M比は≤ 1であるとメーカーから報告されています。
4. 0.1 mgのECMを秤量し、ECM濃度を0.1 mg / mLにするために、以前に調製したアルギン酸塩1 mLに懸濁します。
5. ヒト膵島をアルギン酸塩およびアルギン酸ECMに、前述のプロトコル³¹に従ってカプセル化する。手順を以下に簡単に説明します。
   1. 3,000 IEQ を 1 mL のアルギン酸 1 mL に、3,000 IEQ を 1 mL のアルギン酸 ECM に、ステップ 8.4 で調製した ECM 濃度 0.1 mg/mL で静かに収集して混合します。
   2. 得られた懸濁液を、0.2 mL/minに設定されたマイクロ流体カプセル化装置、2.0 Paの流量と空気圧にそれぞれポンプで送ります。
   3. 製造時には、マイクロカプセルを100 mMのCaCl₂ 浴と10 mMのHEPESに集めます。アルギン酸塩を10分間架橋します。
   4. 培養する前に、カプセル化された膵島をHBSSで標準状態で、37°Cで2〜3分間、5%_CO2で洗浄します。
   5. 培地を追加し( 材料の表を参照)、実験が終了するまで1日おきに培地の3分の2を交換します。
      注:上記の手順は、アルギン酸の島とアルギン酸-ECMの島の両方に対して実行する必要があります。
6. カプセル化後の 8 日目に、グルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) と DNA 分析を行い、インスリンと膵島の生存率をそれぞれ評価します。
7. 遊離島とカプセル化された膵島の明視野画像と生死染色を取得して、細胞の形態と生存率を評価します。
   注:画像の定性的評価は、小島の健康状態を評価するために行われました。考慮されるパラメータには、膵島の形状、境界、完全性、直径、および培養中の単一細胞の存在が含まれます。

9. グルコース刺激インスリン放出(GSIS)とDNA測定

注:8日目に、カプセル化後、ヒト膵島を採取し、低(2.8 mM)および高(16.8 mM)グルコース濃度を含むクレブ緩衝液でインキュベートし、続いてKCl脱分極溶液(25 mM)をインキュベートしました。グルコースチャレンジは、以前に説明したプロトコルを変更して実施された³²。

1. ポリプロピレン製のカラムにゲルろ過樹脂を挿入します。
2. 処理グループ(遊離島またはカプセル化された島)をポリプロピレンカラム内のゲルろ過樹脂の中央部分に挿入します。
3. グルコースおよび脱分極溶液を上記のポリプロピレンカラムにピペットで注入し、以下の順序で1時間インキュベートする:低分子濃度グルコース溶液でプレインキュベーション期間を行い、次いで、セクション9の冒頭の注で述べたように、低、高、低、および脱分極グルコース溶液で一連のインキュベーションを進める。
4. 各インキュベーションフェーズから培地を収集し、その後の分析のために-80°Cで保存します。
5. 脱分極溶液のインキュベーションおよび回収後、ヒト膵島を1 mLのDNA抽出バッファーでインキュベートし、さらなる分析まで保存します。
6. グルコースおよび脱分極溶液のインキュベーション液からのインスリン含有量を、製造元のプロトコルに従って、インスリンELISAアッセイで測定します。
7. ステップ9.5で採取した抽出バッファーのDNA含有量を、メーカーのプロトコルに従ってDNAアッセイキットを使用して測定します。
8. DNA含有量に従ってインスリン測定値を正規化します。

10. 統計解析

注:グループ比較は、この原稿に記載されている各アッセイに対してn = 3の独立した評価が実施されたヒト膵島の同じバッチを指します。値は SD ±平均値で表されます。

1. 統計ソフトウェアを使用して、脱細胞化およびDNA残存物分析の評価のためのマンホイットニー検定を実行し、ネイティブ、脱細胞化した膵臓、および可溶化したECMを比較します。
2. 未対応の t 検定を実行して、天然、脱細胞化した膵臓、および可溶化した ECM の間のグリコサミノグリカンとコラーゲンを評価します。
3. 8 日目の膵島刺激の評価におけるグルコース刺激試験のトルコの事後比較を使用して 2 因子分散分析を実行します。
4. p < 0.05、**p<<0.01、***p 0.001、**p< 0.0001、および****p 0.0001を指定して、p 0.05での統計的有意性を考えてみ<。

結果

天然および無細胞の膵臓サンプルは、H&E、MT、およびABによる組織学的染色のために処理されました。H&E染色では、核物質と細胞が全く存在しないことが示され、脱細胞化が成功したことが確認されました。MT染色とAB染色はECMの枠組みを示し、それぞれ質的にコラーゲン成分と間質成分を強調しました(図1)。

この方法により、ヒトの膵臓からECM粉末を安定して生成することが可能になりました。DNA定量試験では、満足のいく細胞クリアランスが確認された³³。天然、無細胞、および可溶化膵臓ECMを生化学的に特徴付けて、基本的な生物学的組成を評価しました。膵臓ECMは、無細胞性でDNAフリー(乾燥組織のDNA<50 ^ng.mg-1)であると判断され、他の人々によって報告されているように、コラーゲンとグリコサミノグリカンが一貫して保存されていました^11,15

ディスカッション

この研究の目的は、膵臓ECMを産生するための、より穏やかで洗剤を含まない脱細胞化プロトコルを開発することでした。膵臓実質のECM成分の保存と、脱細胞化プロセス中に従来のイオン性または非イオン性化学界面活性剤への長時間の組織曝露の回避に注意が払われました。

開発された脱細胞化法の最も革新的な側面は、従来のイオン性および非イオン性化学洗剤の回避です。ヒト膵臓ECM^{11、12、13、22、34、35}の製造に関する以前の経験は、無細胞性膵臓支持培地の生産のベースラインを設定しました。それにもかかわらず、膵管、上腸間膜動脈、および脾動...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コーニング1Lイージーグリップポリスチレン収納ボトル、45mmキャップ付き	サーモフィッシャー	430518	脱細胞化のための容器使用
極低温ミル	SPEX Certiprep	6870-230
ウシ膵臓からのデオキシリボヌクレアーゼI	シグマアルドリッチ	DN25
水	サーモフィッシャー	15230147
ファルコン50mL円錐形遠心分離管	コーニング	352070
ヒト膵臓
インスリン-エリサ	メルコディア	10-1113-01
塩化マグネシウム、1M、無菌	バイオワールド	41320004-1
豚の胃粘膜からのペプシン	シグマ アルドリッチ	P7012-5G
プラセンタ盆地 蓋なし、滅菌	済み デロイヤル	32-881
ポリプレクロマトグラフィーチューブ	バイオ・ラッド	731-1500	ポリプロピレンカラム
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen	P7589	DNA Kit
SamplePrep 大容量フリーザー/ミルアクセサリー	SPEX	6801	大型グラインドバイアルセット
Sephadex G-10 ビーズ	Cytiva	17001001	ゲルろ過樹脂
UltraPur
0.5M EDTA、pH 8.0	ThermoFisher	15575020
UltraPur 1 M Tris-HCI Buffer、pH 7.5	ThermoFisher	15567027
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	ThermoFisher	10977023