ここでは、成人マウス精巣から生の大腸および後の大動脈芽細胞を分離する簡単で効率的な方法を提示する。低細胞毒性、バイオレット励起DNA結合色素および蛍光活性化細胞選別を使用して、多くの下流用途に対して非常に富んだ精子細胞集団を単離することができる。
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方法論記事
バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
メオティック精子細胞の単離は、疾患の根底にある分子メカニズムと精子形成を調べる上で不可欠である。蛍光活性化細胞選別と組み合わせてHoechst 33342染色を使用して確立された細胞分離プロトコルがありますが、紫外線レーザーを装備した細胞選別機が必要です。ここでは、ヘヒスト33342と構造的に類似した低細胞毒性DNA結合色素であるDyeCycle Violet(DCV)染色を用いた細胞分離プロトコルについて説明する。DCVは紫外線レーザーと紫レーザーの両方で励起することができ、紫外線レーザーを搭載していないセルソーターを含む機器の選択の柔軟性を向上させます。このプロトコルを使用すると、レプトテン/ジゴテン、パキテン、ジプロテン精子細胞、およびポストマイオティックラウンド精子を含む、マイオティックプロフェイズIの3つの生細胞亜集団を分離することができます。また、マウスの精巣からの単細胞の中断を準備するプロトコルについても述べた。全体的に見て、この手順は、多くの下流のアプリケーションを容易にする(必要な細胞の数に応じて4〜5時間)完了するまでに短い時間を必要とします。
概要
精子形成は、精子幹細胞の小集団が成人期を通じて多数の精子の連続的産生を1,2に持続する複雑なプロセスである。精子形成の間に、動的クロマチンリモデリングは、精子原性細胞が子宮内膜を産生するために、3、4、5を産生するために、ミオサシスを受けたときに起こる。メオティック精子細胞の単離は分子学的調査に不可欠であり、沈め込みベースの分離6、7、蛍光活性化細胞選別(FACS)8、9、10、11、12、13、14、15、16、17を含む、複数の異なるアプローチが確立されている。
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プロトコル
このプロトコルは、制度的動物の世話と使用委員会のガイドラインに従います(プロトコルいいえ。IACUC2018-0040)シンシナティ小児病院医療センターで。
精巣細胞懸濁液の調製のための装置および試薬のセットアップ
- 各酵素ストックを1xハンクスバランスソルト溶液(HBSS)で準備し、-20°C(表1)に保管する。
注: 実験の前にいつでも準備してください。 - 実験の1日前:一晩4°Cで胎児ウシ血清(FBS)を用いたチューブ(1.5mLチューブ)をコーティングします。
- 実験当日:水浴を37°Cに設定します。
- 37 °Cでプレウォームダルベックの修正イーグルミディアム(DMEM)を調製し、使用前に各サンプルに対して2mLの1x解離バッファーを調製します(表1)を15 mL遠心管に入れます。
注: 2 つの mL 解離バッファーは、2 つのテスト用に用意されています。解離バッファのレシピについては、 表1を参照してください。
2. 動物の解剖と精巣細胞懸濁液の調製
- 生後8週間の雄マウスを、二酸化炭素室に少なくとも10分間放置して犠牲にします。
- 両方の精巣を取り除き、2 mLの氷冷リン酸緩....
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結果
この分類プロトコルの代表的な結果を図 3に示します。2つの精巣(1つのマウス)の総選別時間は、通常、細胞懸濁液の濃度と並べ替え速度に依存する約3時間である。選別後、SYCP3およびγH2AXの免疫染色により精子細胞の純度が確認される(図3A)。並べ替えられたL/Z、P、D精子の分画の代表純度は、それぞれ約80.4%、90.6%、および87.6%である(図3C)。我々は、我々は以前に公開した基準に基づいて、サブステージを決定しました19.簡単に言えば、レプトテンとジゴテンの段階では、相同染色体間のシナプスは不完全であり、これはSYCP3染色の薄い糸によって示される。広範囲γH2AXドメインは、プログラムされたDNA二本鎖切断のために核クロマチン全体で観察される。パキテインステージでは、相同染色体は完全にシナプスされ、γH2AXは特に性染色体に蓄積する。二プロテン期において、相同染色体は徐々に脱ジナプシスを受ける。R.......
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ディスカッション
ここでは、単一の成人男性マウスから精子と精子の亜集団を分離するための実用的で簡単なプロトコルを提示する。このプロトコルの再現性を確保するために、注意が必要な重要な手順がいくつかあります。酵素消化の前に、洗浄ステップは間質細胞を除去することを目的としている。消化後、このステップは精子や破片を除去するのに役立ちます。洗浄/遠心分離3回が重要です。当社の解離バッファーレシピでは、いくつかの異なる酵素の組み合わせは、過剰な細胞損傷を伴わない単細胞懸濁液への精巣の解離を促進します。気泡を引き起こさないように穏やかにピペット化することもまた細胞の完全性を保護するのに役立ちます。解離後の細胞懸濁液を顕微鏡で確認し、懸濁液が単細胞レベルを達成していることを確認してください。不完全な解離または過剰な消化からの破片汚染は、ソートされた細胞の純度に影響を与えます。 図S2に示すように、直立集団には精子の破片および四量体が含まれている。DCV染色は暗闇の中でインキュベーションを必要とし、その後は洗濯を行いません。
精子亜集団の格下および逆行の潜在的な困難をトラブルシューテ.......
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開示事項
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
謝辞
名川、吉田、前沢の研究室のメンバーの皆さんに、ご協力いただき、ありがとうございました。原稿を編集するためのケイティ・ゲルハルト;H1T抗体を共有するためのメアリー・アン・ヘンデル、シンシナティ小児病院医療センター(CCHMC)研究フローサイトメトリーコアは、NIH S10OD023410がサポートするFACS機器を共有するための。科学研究のための助成(KAKENHI;17K07424)からT.N.へ。ラロール財団A.S.へのポスドクフェローシップ;アメド・クレスト(JP17gm1110005h00001)からS.Y.へ;麻布大学研究サービス部、文部科学省(MEXT)支援の私立大学研究ブランディング事業(2016~2019年)支援プログラム、研究活動立ち上げ助成(19K21196)、武田科学財団(2019年)、上原記念財団研究奨励助成(20.M 18)による研究プロジェクト助成金国立衛生研究所 R01 GM122776 to S.H.N.
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml チューブ | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm ペトリ皿 | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL 遠心分離チューブ | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml ポリスチレンチューブ セルストレーナー スナップキャップ付き (35 & micro;m ナイロンメッシュ) | コーニング、ファルコン | 352235 | |
| 50 mL 遠心分離管 | ワトソン | 1342-050S | |
| 60 mm ペトリ皿 | コーニング、ファルコン | 351007 | |
| 70 & マイクロ;m ナイロンメッシュ | コーニング ファルコン | 352350 | |
| セルソーター | ソニー | SH800S | |
| 遠心分離機 | |||
| コラゲナーゼ 組換え 動物由来フリー | 富士フイルム和光純薬 | 036-23141 | |
| コラゲナーゼ 1型 | ワージントン | LS004196 | |
| カバーガラス | フィッシャー | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-ジアミディノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩) | Fisher | D1306 | 使用濃度: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Σ | D5025-150KU | |
| ロバ血清 | Σ | S30-M | |
| ダルベッコ'リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal usvine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank'平衡塩溶液(HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ | Sigma | H3506-1G | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| ピペットメン | |||
| ProLong Gold 退色防止封入剤 | Fisher | P36930 | |
| rH2AX 抗体 | ミリポア | 05-635 | 作業濃度:2 μg/mL |
| 精子受精タンパク質 56 (Sp56) 抗体 | QED Bioscience | 55101 | 使用濃度: 0.5 μg/mL |
| 滅菌された鉗子およびはさみ | |||
| Superfrost /Plus 顕微鏡スライド | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 抗体 | Abcam | ab205846 | 作動濃度: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (ポリソルベート 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle バイオレットステイン (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| ウォーターバス |
参考文献
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives ....
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再版と許可
