レーザースペックルイメージングを用いた脳灌流の定量化とMRIを用いた梗塞容積の定量化

サマリー

LVO脳卒中のイヌモデルを利用して、脳灌流をリアルタイムで監視するためのレーザースペックルイメージングを開発しました。 拡散強調MRIは、高いb値を利用して梗塞容積を画像化するように最適化され、脳卒中時のDSAと相関するADCとMRAを可能にしました。 最後に、ADCの再構成は組織学的所見と相関していました。

要約

バックグラウンド： 脳底動脈閉塞術 (BAO) は、後循環脳卒中の一部であり、死亡率は 90% にもなります。 虚血性脳卒中を診断するための現在の臨床標準には、コンピューター断層撮影 (CT)、CT 血管造影、灌流および磁気共鳴画像法 (MRI) が含まれます。臨床疾患を正確に反映する大動物前臨床モデルや、脳卒中負荷の評価や治療の評価方法が不足している。

メソッド： 後循環における大血管閉塞(LVO)脳卒中の犬のモデルについて説明し、灌流の変化をリアルタイムで監視するためのレーザースペックルイメージング(LSI)プロトコルを開発しました。 次に、高b値DWI(b=1800s/mm²)MRIを用いて検出感度を向上させた。また、磁気共鳴血管造影法(MRA)が動脈閉塞を評価し、DSAと相関する能力も評価しました。最後に、見かけの拡散係数(ADC)マッピングと組織学から梗塞サイズを確認しました。

業績： 血栓塞栓症の投与は、DSA (n = 7) によって追跡されたように脳底動脈を閉塞しました。  LSIはDSAと相関し、脳卒中発症後の灌流の減少が実験全体を通じて持続することを示し、リアルタイムで灌流を監視することができました。 犬に最適化されたb値を持つDWIは、一回拍出量を示し、ADCおよび磁気共鳴血管造影法(MRA)の画像を導き出すことを可能にしました。実験終了時に行われたMRAは、閉塞後に行われたDSAと相関していました。最後に、MRIでの脳卒中負荷は組織型と相関していました。

結論： 私たちの研究は、虚血性脳卒中の診断と治療に重要なマルチモーダルイメージングを利用する、後循環脳卒中の犬血栓塞栓性LVOモデルのLSIを使用したリアルタイム灌流イメージングを示しています。

概要

脳卒中の世界的な有病率は約2,570万人で、その大多数は虚血^性1です。 後循環脳卒中は全脳卒中の 20% を占め、そのうち脳底動脈閉塞が最も重篤で、死亡率は 90% に近づいています ^1,2。 1995年、脳卒中発症から3時間以内に発症した患者の虚血性脳卒中に対して開発された最初の急性療法である組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター(rtPA^)が発表されました3。最近では、機械的血栓摘出術は、内頸動脈の頭蓋内部分または前大脳動脈および中大脳動脈の最初の部分を含む大血管閉塞症 (LVO) を呈する患者の急性虚血性脳卒中の治療に有益であることが示されています⁴。 最近の臨床試験には後循環脳卒中が含まれておらず、脳底動脈閉塞に機械的血栓摘出術を利用したにもかかわらず、その結果は悲惨なままです^5,6。

脳卒中患者の評価技術の進歩は、機能回復と生存の可能性の予測に影響を与えています⁷。後循環脳卒中の前臨床モデルは以前に説明されています ^8,9,10、しかし、脳卒中負荷と血行再建術の評価は依然として最適ではありません。 げっ歯類などの小型種には、遺伝子操作の容易さ、安価な動物購入、日当^11,12の安さなど、いくつかの利点があります。しかし、小動物実験では、大型動物やヒトの血管系、生理学的状態、または関連する炎症反応を完全には表現していないことがあります⁷。大型動物は、人間の脳卒中により密接に模倣します2,7,13,14。 さらに、血栓性および炎症性マーカーの血液分析のために、連続採血を行うことができます。

この研究では、脳卒中発症からのデジタルサブトラクション血管造影法(DSA)によって検証された脳底動脈閉塞の犬モデルについて説明します。 レーザースペックル灌流イメージング(LSI)を活用し、灌流をリアルタイムに監視します。 次に、レーザースペックル灌流イメージング(LSI)取得に基づく新しい微小血管増強アルゴリズムと、高b値磁気共鳴イメージング(MRI)技術を利用して、梗塞イメージング^{を最適化します15}。これらの技術により、局所的および全体的な虚血を監視および定量化することができます。最後に、これらのイメージング所見を組織学と関連付けます。予後を理解し、前臨床モデルで後循環脳卒中を研究する必要性を理解することは、治療を改善するために重要です。

プロトコル

すべての手続きは、オハイオ州立大学の動物施設管理・使用委員会(IACUC)によって承認された動物福祉法および実験動物の世話と使用に関するガイド(NRC 2011)に準拠して実施されました。

1.ステップ1動物の準備と外科的プロトコル 脳底動脈閉塞(BAO)脳卒中の犬モデルが、前述の^9,10のように使用されました。

1. 速い成犬のビーグル犬(8-13 kg、生後14-21か月)を一晩中水に無料でアクセスします。
2. 注射、麻酔前、アセプロマジンの筋肉内投与(0.2 mg / kg)
3. 20ゲージのカテーテルを橈側静脈に導入します。
4. ケタミン(10 mg / kg)とミダゾラム(0.025 mg / kg)の静脈内投与で麻酔を誘発します。.
5. 麻酔導入後、犬に挿管し、一定の吸入麻酔(2〜3%イソフルラン)を使用して機械的に換気します。
6. レーザースペックルイメージング用の^1cm2 開頭術ウィンドウを作成します。
7. 7F動脈シースを右大腿動脈に導入し、アクセスと血圧測定を行います。
8. 採血のために16ゲージの血管カテーテルを右大腿静脈に導入します。
9. 前述のように血栓塞栓症(血栓)を調製する¹⁶。簡単に言えば、5 mLの犬の全血を0.5 gの硫酸バリウム(Ba₂SO₄)とプラスチック血清採血チューブで30秒間転がしながら採取して混合します。カテーテル投与前に、混合物を室温で60分間乱さずに休ませます。.
10. 中脳底動脈にアクセスする前に、ベースラインのデジタルサブトラクション血管造影法(DSA)の記録を開始します。逆行性経大動脈アプローチを使用して、透視ガイド下で4Fガイディングカテーテルを、脊椎動脈を介して脳底動脈の基部まで右大腿動脈に以前に配置した7F動脈シースに進めます。2ミリリットルの造影剤に生理食塩水を注入して、脳底動脈を特定します。.
11. 外科用メスを使用して、フィブリンに富む層と赤血球に富む層^の両方16 で血栓を小片に切除し、3mLのシリンジにロードし、マイクロカテーテルを介して脳底動脈の中央に注入します。血栓が10分間安定するのを待ちます。フォローアップ血管造影を実施して、目的の血栓の位置を確認します。動脈閉塞はDSAで確認でき、レーザースペックルイメージング(LSI)で脳灌流の減少を確認できます。

2. ステップ2 レーザースペックルイメージング

1. レーザースペックル灌流イメージング(LSI)カメラを頭蓋窓に焦点を合わせます。高解像度レーザースペックルイメージング(LSI)カメラシステムを前述の¹⁵のように構成します。
2. 目的の時点での血管造影の実行中の中断を伴う灌流を記録します。この犬用モデルでは、波長785 nmとサンプリングレート60 Hzの80 mWレーザーを使用して、1.5 cm x 1.5 cmの視野から10 cmの作動距離でデータを取得します。
3. リアルタイムの灌流グラフから、気動に関連するアーティファクトを除外するためにのみ下位のピークを含める対象時間(TOI)を選択します。PimSoft v1.4ソフトウェアを使用した10秒間のサンプリング期間の平均相対灌流ユニット。前述のようにレーザースペックルコントラスト分析(LASCA)を実行します¹⁵。
4. このイヌモデルで脳の微小血管系の定量化を最適化するには、毎秒15フレームで画像を記録し、5フレームで5 x 5ピクセルの領域にわたって時空間平均化を使用して強度と分散の計算を実行します。強度と分散のデータの全体的なフレームレートは、毎秒3フレームでした。各ピクセルの灌流の中央値を選択して、犬の呼吸による灌流測定値の突然の大きな変化の平均への影響を減らします。生データをバイナリファイルに変換し、データを処理して血管系の有意義なイメージングを実現します。プログラムを再ツール化されたLASCAアルゴリズム(rt-LASCA)を利用して、コントラストデータの経時的な分散を使用して、前に説明したように血管系の位置を決定します¹⁵。

3. ステップ3 磁気共鳴画像法(MRI)と磁気共鳴血管造影法

1. 必要に応じて、手術の前日にMRIを実施して比較し、その後、BAOを確認するために繰り返し、治療を評価する場合は犠牲の前に再度行います。
2. シーメンスPrisma 3テスラの電界強度および32チャンネルヘッドコイルをレシーバーとして含む直径60cmのボアMRIスキャナーで以前に説明したように、連続的に麻酔をかけた犬歯を仰臥位に頭から置き、脳画像¹⁷を取得します。
3. ローカライザースキャンを実行して、解剖学的イメージングを開始する前に各犬の脳のパイロット画像を取得します。 提示されたデータを取得するために使用されるシステムは、最適な空間的および時間的解像度でより高速なスキャンを可能にする統合イメージングシステムを備えています。80 mT/mのグラジエントにより、高品質のT2強調、拡散強調画像、MR血管造影が得られます。拡散強調イメージング(DWI)は、T2強調画像などの従来の構造MRI法よりも十分に感度が高く、より多くの解剖学的下部構造を示すことができます。この研究では、BAOの4時間後にMRIを実施しました。
4. 適切なローカリゼーション後、T2強調グラジエントエコーイメージング(パラメータ:FOV = 130 mm、マトリックスサイズ= 320 x 320、ピクセルサイズ= 0.3 x 0.3 mm、スライス厚さ= 3 mm、TR = 4s、FA = 180度、BW = 255 Hz /ピクセル、NEX= 2、TE= 75ms、解像度= 2.4615ピクセル/mm)を実行し、続いてフロー減衰反転回復(FLAIR)イメージングを実行して、脳の解剖学的構造を視覚化します。
5. 磁気共鳴血管造影法(MRA)を実行して、血管の解剖学的構造と血液循環の測定を視覚化します。横方向の視点で、頭と首を覆う脳のMRAを飛行時間3D(TOF)シーケンスで取得します(パラメータ:FOV = 129x129 mm、マトリックスサイズ= 768 x 768、ピクセルサイズ= 0.3 x 0.3 mm、スライス厚さ= 81.59 mm、TR = 25 ms、FA = 18度、BW = 185 Hz /ピクセル、NEX = 1、TE = 4.22ms、解像度= 5.91ピクセル/mm)。3D色分けされた視覚化で最大強度投影(MIP)を実行し、血管内の信号強度を最大化します。 後処理で取得したDICOM画像により、血管を可視化し、脳底動脈が閉塞していることを確認しました。

4. ステップ4 拡散加重イメージングと一回拍出量の計算

1. 拡散強調イメージングシーケンスを実行して、急性虚血性脳卒中を検出します(パラメータ:FOV = 149mm x 149 mm、マトリックスサイズ= 132 x0x0x 100、ピクセルサイズ= 0.30mm x 0.30 mm、スライス厚さ= 4 mm、TR = 4.6秒、FA = 90度、BW = 255 Hz /ピクセル、NEX = 1、TE = 86ms、解像度= 0.93ピクセル/mm)。後処理のためにDICOM画像を転送します。
2. DWI画像から見かけ拡散マップ(ADC)を生成し、OsiriX MD v.5.0ソフトウェアを使用して梗塞の体積を計算します。
3. スライスごとに脳半球と梗塞領域の両方をトレースし、スライスの厚さを掛けて梗塞の体積を取得します。
4. 絶対全体の体積を 100 単位に変換して、各犬歯のストローク体積の割合を計算します。

5. ステップ5:ヘマトキシリンとエオシンの染色脳組織学

1. 麻酔をかけた犬歯での犠牲時には、脳を採取し、鋭利なメスで厚さ4mmの内側切片を2つ切り取り、1つの切片を以下のTTC染色に使用します。
2. 4 mmの切片を10%ホルマリンで最低7日間固定し、切片全体に浸透させます。
3. 固定脳切片をパラフィンに埋め込む^{私たちのプロトコル17}。
4. 各パラフィンブロックをトリミングして平準化します(複数のブロックを同時に保存および処理できます)。
5. 各パラフィンブロックを4μmで切片化し、切断した組織を2インチ x 3インチのスライドに置きます。
6. 各スライドをヘマトキシリン560で8分間処理し、水道水ですすいで1%酸性アルコールを1秒間3回分化します。
7. 各スライドを1%水酸化アンモニウムで1秒間青くし、水道水で2秒間すすぎます。
8. 70%エタノールで1秒間12回脱水し、エオシンで1分間対比染色します。
9. 95%で1秒間12回脱水し、続いて100%エタノールで脱水します。
10. キシレンでクリアし、2インチ x 3インチのカバースリップを封入剤で塗布し、気泡を取り除きます。

6. ステップ6 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride 脳染色

1. H&E切片の横で採取した2つ目の4 mm切片を、暗所で37°Cに温めたpH 7.4 PBS中の100 mL 2% 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride(TTC)を含む調製済みの溶液に入れます。
2. 暗所37°Cで20分以上インキュベートし、5分ごとに脳切片を静かに裏返します。
3. セクションの両側がチェリーレッドに変わったら、TTC溶液を取り除き、PBS、pH 7.4の4%パラホルムアルデヒドに置き換えて、コントラストを一晩最適化します。
4. 脳内の白と赤の染色のコントラストが最適になったら(1〜3日)、透明なプラスチックシートの間に置き、余分な水分を乾燥させ、高解像度でスキャンします。
5. 虚血領域と全脳スライドをトレースして、前に説明したように各セクションの梗塞率を取得します¹⁷。

結果

レーザースペックル灌流の記録とイメージング:灌流記録は、動物がMRIに搬送されるまで連続的に行われ、再び犠牲にされました(図1A)。データによると、脳灌流は脳底動脈閉塞の前 (BAO 前) の時点で 10% ± 83% に ~15% 減少しました。この名目上の低下は、遠位椎骨動脈へのマイクロカテーテル挿入の結果である可能性が高い。調製した血栓塞栓を注入した後、BAO後の灌流は平均33±2.6%に低下し、ベースラインから~67%減少しました(図1B)。血管造影観察では、脳底動脈の血液循環はBAOの前に開存しており(図2A)、自家血栓の投与後に完全に閉塞していることが示されました(図2B)。血管造影と一致して、頭蓋窓を通して観察されたレーザースペックル灌流イメージング(LSI)は、閉塞後の制限された灌流(図2D)...

ディスカッション

後循環脳卒中の最も一般的な原因には、塞栓症、大動脈アテローム性動脈硬化症、小動脈疾患などがあります⁵。脳底動脈閉塞術 (BAO) は、後循環脳卒中のサブセットを表し、重大な罹患率と死亡率をもたらします¹³。これに関連して、急性後部脳卒中の犬モデルが利用され、閉塞領域の灌流をリアルタイムで監視するためのLSIプロトコルを開発しました。レーザースペックル灌流イメージングは、小さな頭蓋窓を通じて実施され、定義された関心領域に関するリアルタイムの情報を提供しました。灌流は脳卒中発症後に減少し、実験の終わりまで持続しました。 このウィンドウは、血栓溶解薬または血栓摘出装置による治療後の灌流の変化に関するリアルタイムの情報を提供できます。 頭蓋窓を通じてLSIを実行した後、灌流データをさらに処理して、rt-LASCAアルゴリズム¹⁵を使用して脳卒中患部の血管解剖学的構造を視覚化しました。 この研究では、レーザースペックル灌流によって記録され...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2% 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(PBS中のTTC、pH 7.4)	Sigma Aldrich	T8877
EDTA K3 vacutainers	Becton Dickinson	BD455036
Eosin	Surgipath	3801602
Formalin、中性緩衝液、10%	Richard-Allan Scientific	5701
Hematoxylin 560	Surgipath	3801570
HUG-U-VACポジショニングシステム	DRE Veterinary	1320
LabChartソフトウェア	ADInstruments Inc.
レーザースペックルイメージングカメラ	Perimed Inc.、ジャルファラ、スウェーデン	PeriCam PSI HRシステム
リチウムヘパリン真空剤、4.5%	Becton Dickinson	BD 368056
Matlab	MathWorks、Inc.、Natick、MA
OsiriX MD v.5.0ソフトウェア	Pixmeo Inc、ジュネーブ
ホルムアルデヒド4%PBS	アルファAesar
PimSoft v1.4ソフトウェア	Perimed Inc.	LSI機器
Prisma Fit 3テスラ(3T)マグネット	Siemen's Diagnostics
注射用ヘパリンナトリウム(血液ガス注射器コーティング用)	NovaPlus	402525D