方法論記事

オオムギ種子の現像からの高純度組織の分離

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DOI：

10.3791/61681

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2020年10月26日

 ,  , 
1Czech Acad Sci, Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Institute of Experimental Botany, 2The Polish Academy of Sciences, The Franciszek Górski Institute of Plant Physiology

この記事について

サマリー

ここでは、オオムギ種子の全開発における胚、胚乳、種子母体組織の高純度手動分離および品質管理のためのプロトコルを紹介します。

要約

穀物種子の発生を制御するメカニズムを理解することは、植物の育種と収量の増加に不可欠です。しかし、穀物種子の分析は、サイズが小さいこと、一部の組織の液体特性、および組織間の緊密な接続のために困難です。ここでは、オオムギ種子の発育の初期、中期、後期における胚、胚乳、および種子母体組織の解剖に関する詳細なプロトコルを示します。このプロトコールは、細かなツールと双眼顕微鏡を使用した手動組織解剖と、それに続く倍数性分析ベースの純度制御に基づいています。種子の母体組織と胚は二倍体ですが、胚乳は三倍体組織です。これにより、フローサイトメトリーを使用してサンプルの純度をモニタリングできます。さらに測定した結果、このようなサンプルから単離されたRNAの高品質と、高感度解析に有用であることが明らかになりました。結論として、このプロトコルは、栽培された大麦の発育中の穀物から純粋組織を実際に解剖する方法を説明し、場合によっては他の穀物も分析します。

概要

種子は、母性起源と親孝行起源のいくつかの組織からなる複雑な構造です1。穀物は特殊な種類の種子であり、その大部分は胚乳によって形成され、胚を保護し栄養を与える特殊な三倍体組織です。穀物は世界の食料資源の約60%を提供し、植物生産から最も価値のある生産物です2。穀物種子の発達を制御する分子プロセスに関する知識は、その経済的卓越性と植物の繁殖における中心的な役割のために重要です1,3。

栽培オオムギ(Hordeum vulgare subsp. vulgare; 2n = 2x = 14; 1C = 5.1 Gbp)は、世界で4番目に重要な穀物作物です。動物飼料、食品、バイオテクノロジー4に使用されています。それに加えて、それはまた、重要性が増している古典的な温帯穀物作物モデル種でもあります5。オオムギのゲノムリソースには、遺伝子マップ、栽培品種、在来種、変異体のコレクション、高品質のゲノムアセンブリとアノテーション、および主要な発生段階のトランスクリプトームデータが含まれます5,6,7。また、オオムギの遺伝子は、他の穀物の遺伝的改良にも利用されます。干ばつや塩分などの非生物的ストレス、特定の病原体、および有益な化合物(β-グルカンなど)の高含有量に対する耐性により、オムギは小麦育種のための貴重な形質の供給源となっています8。

種子の発育は、受粉日(DOP)の受精によって開始されます。DOPは、ワディントンスケール(W10.0)9に従って柱頭と葯の形態を評価することによって定義されます。受粉していない花を含むスパイクは、コンパクトな(枝分かれしていない)柱頭と緑色の葯を特徴としていましたが、受粉したスパイクには、拡張されたスパイクレット、拡張された広く枝分かれした柱頭、膨らんだ胚珠、開いた葯、および遊離花粉が含まれていました。DOPの花は中間的な表現型を表していました。葯は黄色で、簡単に乱れ、花粉を放出しました。柱頭は、雌しべのシグマティックブランチを広く広げていました(図1C)。

オオムギ種子の発育には、部分的に重複する3つの段階が含まれます1,10。ステージI(受粉後0〜6日;DAP)は、細胞増殖とデンプン合成の不在に代表される二重受精によって開始されます。ステージII(7 – 20 DAP)は、デンプンおよびタンパク質貯蔵分子の生産を伴う分化と大きなバイオマス増加で構成されています。ステージIII(21 DAP後)は、種子の成熟、乾燥による体重減少、および休眠の開始に対応します。あるいは、フェーズは、それぞれアーリー、ミドル、レイトと呼ばれます11。

大麦粒は、補題、パレア、およびグルームからなる外皮で覆われています12。ほとんどのオオムギの遺伝子型では、外皮は乾燥した種子をしっかりと包み込みます。種子自体は、胚、胚乳、および種子の母体組織によって形成されます(図1A)。二倍体胚は、1つの精子細胞核による卵細胞の受精に由来します。完全に発達した種子では、胚は胚軸と根を囲む鞘根、シュート分裂組織と一次葉を囲む鞘葉、および胚葉(子葉)1,10,13,14で構成されています。三倍体胚乳は、二倍体中央細胞が第2の精子細胞核によって受精した結果です。胚乳の増殖は、分裂する核が中央の液胞によって末梢に押し出される合胞体(共細胞)段階から始まります。合胞体期の終わりには、微小管が核の周りに放射状ネットワークを形成し、反斜性細胞壁の形成と胚乳の細胞化の開始を示します。胚乳の分化は細胞化と同時に起こり、でんぷん質の胚乳、転写細胞、アリューロン層とサブアリューロン層、胚周辺領域の5つの主要な組織をもたらします。種子母体組織は、果皮および種皮10,12を含む母性起源の多層二倍体構造である。種子の母体組織には、輸送関連の機能を持つ穀物の背側にある核突起が含まれ、種子発生の後期段階で胚乳に埋め込まれる15。

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図1:オオムギの種子の開発。 (A)示された種子母体組織(SMT、緑)、胚乳(END、黄色)、胚(EMB、オレンジ)、および外皮(H、灰色)を備えた矢状平面での穀物の概略図。(B)アンテシスに近いオオムギの穂の形態。スケールバー= 1 cm. (C) 受粉前、受粉中、受粉後の段階での柱頭と葯の形態。挿入図は、花粉粒(矢じり)の柱頭の詳細を示しています。スケールバー = 5 mm、インセット バー = 200 μm. (D) 4、8、16、24 DAP シードの矢状および横断面。(NP、核投影)スケールバー= 5 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

近年のハイスループットゲノミクスの進歩は、個々の種子組織の発生を研究するためのツールを提供しています。しかし、この目的の大きな障害は、種子組織1のコンパクトな構造と密接な接着である。私たちは、オオムギ種子の開発からその後のRNAシーケンシングなどの高感度分析への使用まで、種子組織の高純度解剖のためのプロトコルを開発しました。さらに、提示されたプロトコルは、他の穀物に容易に適合させることができる。

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プロトコル

1.植物を育てる

注:単一の大麦植物には通常5〜6個の分げつがあり、各スパイクの中央の5〜6個の小穂のみを解剖に使用する必要があることを考えると、植物あたりの最大収量は2列で72種子、6列品種で216種子です。

  1. オオムギの種子を発芽させるには、1層の濾紙で覆われた3層のセルロースティッシュペーパーを詰めたペトリ皿を準備します。余分な水が入らないように蒸留水で保湿し、表面に種を入れてシャーレを閉じます。濾紙は、セルロース組織を通じて根を成長させるのを防ぎます。暗所で25°Cで3日間種子を発芽させます。
    注:または、種子を湿った土壌混合物に直接入れて発芽させます(手順1.2を参照)。
  2. 目に見える根と約5cmの芽を持つ発芽した種子を、土と砂の混合物(3:1、v / v)を備えた5cmx5cmの泥炭ポットに移します。定期的に水をまきます。10日後、植物を同じ土壌混合物で満たされた12cmx12cmの鉢に移します。
  3. 制御された長日体制(16時間昼20°C、8時間夜16°C、光強度200μmol m-2 s-1、湿度60%)の下で気候室で植物を育てます。
    注:春大麦は、播種からアンテシスの開始まで約8〜10週間かかり、春化は必要ありません。冬オオムギは、開花を誘発するために7〜8週間の春化(短日条件、8時間日4°C、16時間夜4°C、光強度200μmolm-2s-1、湿度85%)を必要とします。

2.受粉の決定

注:発達の進行を適切に推定するには、受粉の正確な決定が必要です。オオムギは自家受粉種です。受粉日(DOP)を定義するために、自家受粉の日を監視しました。この形質は品種固有ですが、葉の鞘から芒が突出し始めることは、DOPに近づいていることを示す良い指標です(図1B)。

  1. スパイクを覆っている葉の鞘を開きます。先の尖ったピンセットを使用して、スパイクの中央部分にある葯と小穂内の卵巣を確認します。黄色い葯と「ふわふわ」の柱頭を持つ小穂は、数時間以内に受粉し16 、DOPと見なされます(図1B)。
  2. 最後の小穂の先端付近にあるスパイクを切り取り、旗の葉と芒の上部を取り外します。次に、各小穂の船体の上部1/3を切り取ります。これにより、葯が乾燥し、花粉の開閉がより同期します。
  3. スパイクID、植物番号、および定義されたDOP日付が記載されたグラシンバッグでスパイクを覆います。これにより、特定の実験を損なう可能性のある他家受粉も防止されます。
  4. 情報を表形式のエディターに書き留めます。次の式を使用して、組織分離が行われる受粉日(DAP)を計算します。
    xDAP = DOP + x
    x = 予想されるDAP
    注: 値は 'Data' 形式にする必要があります。
  5. 種子組織の解剖では、準備した表形式のカレンダーに従ってDAPでスパイクを収集します。

3. 種子組織の解剖

注意: 次の手順は、実体顕微鏡を使用して実行する必要があります。ピンセットを使用して解剖する前に、船体を取り外してください。船体は16DAP付近から乾燥し、付着性が高くなることに注意してください。生理学的条件を維持し、解剖中の植物材料の乾燥を避けるために、サンプルを1x PBS(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4、 pH = 7.4)の滴下に入れて湿らせます。各組織の解剖には新しいシードを使用して、サンプル収集時間の延長によるDNA、RNA、またはタンパク質の分解を回避します。解剖された材料からのRNA単離には、RNaseを含まない材料と化学物質のみを使用してください。RNAの分解を最小限に抑えるために、通常は5〜10個のシードから解剖された組織からなる1つのサンプルの総解剖時間15分を超えないようにしてください。

  1. 組織を解剖する前に、先の尖ったピンセットを使用して残りの船体を取り外してください。1×PBSで1分間保湿すると、小穂の乾燥した残留物を取り除くのに役立ちます。
  2. 皮をむいた種子を1×PBSを滴下したシャーレに置き、先の尖ったピンセット、細い針、およびマイクロキャピラリーピペットを使用して個々の部品を解剖します。個々の組織の解剖には、種子母体組織(ステップ3.3)、胚(ステップ3.4)、胚乳(ステップ3.5)など、わずかに異なる戦略が適用されます。
  3. 種子母体組織の解剖
    1. 種子から最大8DAPの解剖
      1. 背側に種を載せ、長手方向軸に沿って種子をやさしく切り、頂端から基部にかけて胚乳に接する最後の層を除く種子の母性組織をピンセットで剥がします。
      2. 50μLの1×PBSを含む1.5mLチューブに5〜10個の種子の母体組織を採取し、ピペットを使用して緩衝液を廃棄し、100μLのPBSで組織を2回すすぎ、ピペッティングで過剰な緩衝液を除去し、チューブを閉じて液体窒素で凍結するか、フローサイトメトリー倍数性測定に直接使用します。材料の量は、通常、1つのダウンストリームアプリケーション(RNA単離やフローサイトメトリー倍数性測定など)に十分です。
    2. 8DAP後の種子からの解剖
      1. 背側に種子を置き、種子の母性組織の腹側の中央をやさしく切り、核突起を含む種子全体の周りの組織を徐々に剥がします。各ダウンストリームアプリケーションについて、ステップ3.3.1で説明されているように、5〜10シードの組織を収集して洗浄します。
  4. 胚の解剖
    1. 8 DAP以下の種子からの解剖
      1. 背側に種を置き、種子の基部の1/3を切ります。分離した部分を慎重に半分に分割し、胚を放出します。各ダウンストリームアプリケーションについて、3.3.1で説明されているように、10〜20個の種子から胚を収集して洗浄します。
    2. 8DAP後の種子からの解剖
      1. 背側に種子を置き、腹側の基底部から種子の母性組織を取り除きます。胚の周囲にある胚乳の薄い層を細い針または細い先のとがったピンセットでやさしく乱し、胚をはがします。各ダウンストリームアプリケーションについて、3.3.1で説明されているように、最大5つのシードから胚を収集して洗浄します。
  5. 胚乳の解剖
    1. 4つのDAPシードからの合胞体胚乳の解剖。
      1. 背側に種子を置き、胚乳に隣接する細胞の最後の層を除く種子の母体組織を取り除きます。腹側中央の層を細い針で優しく穿刺し、マイクロキャピラリピペットを用いた毛細管現象により合胞体胚乳を吸引します。
      2. 各ダウンストリームアプリケーションについて、10〜15シードの液体胚乳を、計画されたダウンストリーム分析に適したバッファー(すなわち、1x PBS、RNA分離バッファー、フローサイトメトリーバッファー)を備えた新しい1.5 mLチューブに収集します。バッファー容量は、計画されたダウンストリームアプリケーションのプロトコルを反映する必要があります。液体窒素で凍結します。
    2. 5〜8個のDAP種子からのセルラ化胚乳の解剖
      1. 背側に種子を置き、すべての種子の母体組織と胚を取り除きます。下流のアプリケーションごとに、10〜15個の種子の胚乳を収集して、1x PBSを含む新しい1.5 mLチューブに洗浄し、液体窒素で凍結します。
    3. 8DAP後の種子からのセルラ化胚乳の解剖
      1. 背側に種子を置き、すべての種子母体組織と胚を取り除きます。各ダウンストリームアプリケーションについて、ステップ3.3.1で説明されているように、チューブごとに1つのシードから胚乳を収集して洗浄します。
  6. チューブは、使用するまで–80°Cで絶縁材料で保管してください。
    注:プロトコルはここで一時停止できます。

4. フローサイトメトリーによる組織純度の制御

注:サンプルの純度は、RNA単離前にフローサイトメトリーを使用して確認できます。適切な装置のキャリブレーションは、生物学的サンプル分析にとって重要です。フローサイトメーター/倍数性分析装置の光学系は、キャリブレーションビーズ(サイズと蛍光強度に対して非常に均一な蛍光染色ポリスチレン微小球)を使用して、最大ピークシャープネス、通常は変動係数(CV)<2%に達するまで調整する必要があります。穀物種子組織には、主にG1、G2、および内重複核の集団が含まれています。したがって、対数スケールを使用することをお勧めします。主にG1核を含み、基底倍数性コントロールとして機能する葉組織から始めます。

  1. 氷上に保管した新たに調製したサンプル(ステップ3.3.1を参照)または説明した17の凍結組織を使用する。
    注:< 8 DAPサンプル全体がフローサイトメトリーに使用されるため、これは間接的なコントロールにすぎません。研究者は、高純度サンプルの割合(>90%)に達するまで複数回の単離と測定を行い、その後、<8個のDAPサンプルでRNA単離に進むことをお勧めします。
  2. 300 μLのOtto Iバッファー(0.1 Mクエン酸一水和物、0.5%(v/v)Tween 20、0.22 μmフィルターでろ過)18
  3. 粗懸濁液を50 μmナイロンメッシュでフローサイトメトリー分析チューブにろ過し、2 μgのmL-1 DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)18を含む600 μLのOtto IIバッファー(0.4 M Na2HPO4・12H2O)を加えてDNAを染色します。
  4. 他のすべての組織(16個のDAPまたは古い胚を含む)を、500 μLのOtto Iバッファーを含むシャーレに置き、カミソリの刃でチョッピングして均質化します。ステップ4.3のように懸濁液をろ過し、DAPIを含む1 mLのOtto IIバッファーで染色します。
    注意: 鋭利な両刃のかみそりの刃での操作には特別な注意が必要です。怪我のリスクを減らすために、シングルエッジのカミソリブレードまたは特別なブレードホルダーが利用可能です。
  5. フローサイトメーターを使用して、サンプルの核DNA含有量を推定します。サンプルの純度を分析するには、サンプルあたり少なくとも2000個の粒子が必要です。

5. RNA単離と品質測定

  1. 凍結組織を使用して、内因性リボヌクレアーゼによるRNA分解を防ぎます。種子の母体組織および胚サンプルから、市販のキットまたはTRIzol試薬19を用いてRNAを単離する。胚乳組織にはデンプン含有量が高いため、問題のある組織に対する市販のオンカラムRNA抽出プロトコル(例:Spectrum Plant Total RNA Kit)を使用して、オンカラムDNase I処理20を用いて、すべてのサンプルからトータルRNAを単離する。
  2. RNAゲル電気泳動またはAgilent 2100 Bioanalyzerの専用プロトコルを使用して、RNAの濃度と完全性を測定します。
    注:インタクトトータル RNA には、それぞれ約 1.9 kb と 3.7 kb のサイズの 18S および 25S rRNA バンド/ピークが明確にあります。25S rRNAバンドは、18S rRNAバンドの約2倍の強度を持つ必要があります。

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結果

オオムギ種子の発育の組織特異的なトランスクリプトーム解析を行うために、高純度組織単離のためのプロトコルを確立しました。このプロトコルは、皮をむいた(手動の殻除去後)穀物からの胚、胚乳、および種子の母体組織の手動解剖に基づいています(図1A)。このプロトコールは、いくつかの2列および6列の春オオムギ品種から材料を分離するために成功裏に使用され、スパイクは特定のDAPで収穫され、固定せずに抽出に直接使用されました(図1D)。

DOPの定義は、解剖前に推定すべき重要なパラメータでした。大麦の穂は真ん中から端に向かって成熟します。そのため、DOP評価には真ん中の花を使用しました。スパイクの中央から最大で6つのシードが組織解剖に使用されました。自家受粉の成功率は100%に近かった。それに比べて、手動受粉の成功率ははるかに低かった。

選択した発生期間(4〜24 DAP)では、組織解剖の難易度は一般に時間とともに減少しまし...

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ディスカッション

ここでは、オオムギ種子組織の高純度単離を可能にするプロトコールを紹介します。それは大麦のために開発され、テストされましたが、小麦、オート麦、ライ麦、ライコムギなど、 トモ 科の他のメンバーに簡単に採用できます27。プロトコルの最初の部分は、種子組織の解剖に焦点を当てており、非標準的または高価な機器を必要としないため、多くの科学者がアクセスできるはずです。徹底した品質管理解析のためには、フローサイトメーターのような高度に専門化された装置が必要です。しかし、多くの植物研究機関では、訓練を受けた研究スタッフが運営するフローサイトメーターや倍数性分析装置を設置しています。

植物の受粉には、オオムギの自家受粉能力を利用し、自然受粉の正確な日を定義する一連の単純な形態学的パラメータに依存しています。したがって、このプロトコルは、多くの植物種に適用される一般的なアプローチである手動の花の去勢と受粉を回避します。私たちは最初に両方の方法を試しましたが、手動受粉法は、...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

フローサイトメーターのメンテナンスにはJan Vrána博士とMahmoud Said博士、バッファーの準備にはEva Jahnová氏、材料リストにはMarie Seifertová氏、植物の手入れにはZdenka Bursová氏に感謝します。この研究は、主にチェコ科学財団の助成金18-12197Sから支援されました。A.P.はさらに、チェコ科学アカデミーのJ.E.PurkyněフェローシップとERDFプロジェクト「持続可能な世界開発のためのツールとしての植物」(No.CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 um フィルターメルクSLGSV255F
1.5 ml エッペンドルフ チューブSarstedt72.690.001
4',6-diamididno-2-phenylindoleInvitrogenD21490
50 um ナイロンメッシュシルク a Progrersuhelon 120 T
Agilent 2100 バイオアナライザーAgilentG2939BA
バルブ アセンブリドラモンドサイエンティフィックカンパニー1-000-9000
ビーズInvitrogenA16502
セルロースティッシュペーパー
クエン酸一水和物ペンタ13830-31000
気候室ヴァイスガレンカンプ
DNase IシグマアルドリッチDNASE70
フィルター紙ファグロン
細いピンセットファインサイエンスツール11254-20
フローサイトメーターSysmex-Partec
フローサイトメトリーチューブSarstedt55.484
冷凍庫
グラシンバッグ
KClLachner30076-AP0
KH2PO4Litolab100109
液体窒素Linde
マイクロキャピラリーピペットFivephoton BiochemicalsMGM 1C-20-30
Minutien ピンファイン サイエンス ツール26002-20
Na2HPO4Lachema
Na2HPO4.12H2OLachner30061-AP0
NaClLachner30093-AP0
ピート ポットジフィー5x5 cm
シャーレ
ピン ホルダーファイン サイエンス ツール26016-12
プラスチック ペトルp-LabA199001
ポット12x12 cm
カミソリ刃ジレット
RNAse zapInvitrogenAM9780
サンド
ハサミファインサイエンスツール14060-11
土壌
スペクトル植物 トータルRNAキットシグマ・アルドリッチSTRN50
実体顕微鏡オリンパス
・トゥイーン 20シグマ・アルドリッチP2287
トリゾール試薬Invitrogen15596026
RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513
キャリブレーション

参考文献

  1. Sreenivasulu, N., et al. Barley grain development: Toward an integrative view. International Review of Cell and Molecular Biology. 281, 49-89 (2010).
  2. FAO. Cereal supply and demand brief. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: http://www.fao.org (2019).
  3. Baik, B. K., Ullrich, S. E. Barley for food: Characteristics, improvement, and renewed interest. Journal of Cereal Science. 48 (2), 233-242 (2008).
  4. Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Stein, N., Muehlbauer, G. J. , Springer. Cham. Switzerland, AG. 1-10 (2018).
  5. Mascher, M., et al. A chromosome conformation capture ordered sequence of the barley genome. Nature. 544 (7651), 427-433 (2017).
  6. Mascher, M. Pseudomolecules and annotation of the second version of the reference genome sequence assembly of barley cv. Morex V2. Morex. , Available from: https://edal.ipk-gatersleben.de (2019).
  7. Rapazote-Flores, P., et al. BaRTv1.0: An improved barley reference transcript dataset to determine accurate changes in the barley transcriptome using RNA-seq. BMC Genomics. 20 (1), 968(2019).
  8. Molnár-Láng, M., Linc, G., Szakács, É Wheat-barley hybridization: The last 40 years. Euphytica. 195 (3), 315-329 (2014).
  9. Waddington, S. R., Cartwright, P. M., Wall, P. C. A quantitative scale of spike initial and pistil development in barley and wheat. Annals of Botany. 51 (1), 119-130 (1983).
  10. Sabelli, P. A., Larkins, B. A. The development of endosperm in grasses. Plant Physiology. 149 (1), 14-26 (2009).
  11. Dante, R. A., Larkins, B. A., Sabelli, P. A. Cell cycle control and seed development. Frontiers in Plant Science. 5, 1-14 (2014).
  12. Rodríguez, M. V., Barrero, J. M., Corbineau, F., Gubler, F., Benech-Arnold, R. L. Dormancy in cereals (not too much, not so little): About the mechanisms behind this trait. Seed Science Research. 25 (2), 99-119 (2015).
  13. Sreenivasulu, N., et al. Gene expression patterns reveal tissue-specific signaling networks controlling programmed cell death and ABA-regulated maturation in developing barley seeds. Plant Journal. 47 (2), 310-327 (2006).
  14. Olsen, O. A. Nuclear endosperm development in cereals and Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 16, suppl_1 214-227 (2004).
  15. Thiel, J., et al. Different hormonal regulation of cellular differentiation and function in nucellar projection and endosperm transfer cells: A microdissection-based transcriptome study of young barley grains. Plant Physiology. 148 (3), 1436-1452 (2008).
  16. Weschke, W., et al. Sucrose transport into barley seeds: Molecular characterization of two transporters and implications for seed development and starch accumulation. Plant Journal. 21 (5), 455-467 (2000).
  17. Staszak, A. M., Rewers, M., Sliwinska, E., Klupczyńska, E. A., Pawłowski, T. A. DNA synthesis pattern, proteome, and ABA and GA signalling in developing seeds of Norway maple (Acer platanoides). Functional Plant Biology. 46 (2), 152-164 (2019).
  18. Otto, F. Chapter 11 DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. Methods in Cell Biology. 33, 105-110 (1990).
  19. Fisher Scientific. Procedural guidelines. , (2020).
  20. Spectrum TM. Plant Total RNA Kit. , (2020).
  21. Nowicka, A., et al. Dynamics of endoreduplication in developing barley seeds. Journal of Experimental Botany. , eraa453(2020).
  22. Chen, J., et al. Dynamic transcriptome landscape of maize embryo and endosperm development. Plant Physiology. 166 (1), 252-264 (2014).
  23. Zhang, S., Laurie, A. E., Ae, W., Meng, L., Lemaux, P. G. Similarity of expression patterns of knotted1 and ZmLEC1 during somatic and zygotic embryogenesis in maize (Zea mays L.). Springer. 215 (2), 191-194 (2002).
  24. Doll, N. M., et al. Transcriptomics at maize embryo/endosperm interfaces identifies a transcriptionally distinct endosperm subdomain adjacent to the embryo scutellum. Planta. 32 (4), 833-852 (2020).
  25. Yi, F., et al. High temporal-resolution transcriptome landscape of early maize seed development. Plant Cell. 31 (5), 974-992 (2019).
  26. Gómez, E., et al. The maize transcription factor myb-related protein-1 is a key regulator of the differentiation of transfer cells. Plant Cell. 21 (7), 2022-2035 (2009).
  27. Bewley, J. D., Black, M., Halmer, P. The encyclopaedia of seeds: Science, technology and uses. CABI. , Wallingford, UK. (2006).
  28. Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
  29. Pirrello, J., et al. Transcriptome profiling of sorted endoreduplicated nuclei from tomato fruits: how the global shift in expression ascribed to DNA ploidy influences RNA-Seq data normalization and interpretation. Plant Journal. 93 (2), 387-398 (2018).
  30. Sreenivasulu, N., et al. Transcript profiles and deduced changes of metabolic pathways in maternal and filial tissues of developing barley grains. Plant Journal. 37 (4), 539-553 (2004).
  31. Bian, J., et al. Transcriptional dynamics of grain development in barley (Hordeum vulgare L). International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 962(2019).

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