金ナノ粒子とCucurbit[n]urilの凝集体内の正確なプラズモニックナノ接合の形成による尿酸の定量的SERS検出

プリンヌクレオチドの代謝の最終産物である尿酸は、痛風、子癇前症、腎疾患、高血圧、心血管疾患および糖尿病などの疾患の診断のための血清および尿中の重要なバイオマーカーである^1,2,3,4,5。尿酸検出のための現在の方法には、比色酵素アッセイ、高速液体クロマトグラフィーおよびキャピラリー電気泳動が含まれるが、これらは時間がかかり、高価であり、洗練されたサンプル調製を必要とする⁶、^7、8、9。

表面増強ラマン分光法は、振動指紋を介して生体分子を選択的に検出でき、高感度、迅速な応答、使いやすさ、サンプル調製がゼロまたは最小限に抑えられるなど、多くの利点を提供するため、日常的なポイントオブケア診断に有望な技術です。貴金属ナノ粒子(例えば、Au NPs)に基づくSERS基板は、表面プラズ^モン共鳴11によって引き起こされる強力な電磁増強を介して、分析物分子のラマンシグナルを4〜10桁¹⁰桁増強することができる。カスタマイズされたサイズのAu NPは、複雑な金属ナノコンポジット¹²の時間のかかる製造とは対照的に容易に合成することができ、したがって、その優れた特性¹³、^14、15、16のために生物医学的用途において広く使用されている。大環状分子であるウリ科植物[n]urils(CBn、ここでn = 5-8, 10)をAu NPの表面上に付着させることで、高度に対称で剛直なCB分子がAu NP間の正確な間隔を制御し、ホスト-ゲスト複合体の形成を介してプラズモニックホットスポットの中心または近接する分析物分子を局在させることができるため、分析物分子のSERSシグナルをさらに高めることができます(図1)^{17、18,19,20}。Au NP:CBnナノ凝集体を用いたSERS研究の以前の例には、ニトロ爆発物、多環芳香族化合物、ジアミノスチルベン、神経伝達物質およびクレアチニン²¹、^22、23、^24、25が含まれ^、SERS測定はキュベット内で^、またはカスタムメイドのサンプルホルダーに小さな液滴を装填することによって行われる。この検出スキームは、高い再現性で複雑なマトリックス中のバイオマーカーを迅速に定量するために特に有用である。

本明細書では、CB7と重要なバイオマーカーUAの宿主 - ゲスト複合体を形成し、水性媒体中のAu NPのCB7媒介凝集を介して0.2μMの検出限界を有するUAを定量するための容易な方法が、診断および臨床用途に有望であるモジュラー分光計を用いて実証された。

1. Au NPの合成

1. 従来のトルケビッチ法によるAu種子の合成²⁶
   1. 98.5 mgのHAuCl_4·3H2O前駆体をガラスバイアル中の10mLの脱イオン水と共に使用する。
      注:HAuCl 4前駆体は金属ラボウェアを腐食させるため、少量のHAuCl₄前駆体を計量ボートに移し、金属ヘラの代わりにプラスチックヘラを使用して結晶を計量します。HAuCl₄は吸湿性であり、したがって大気から水を吸収することによって時間の経過とともにその重量を増加させるので、計量ステップは可能な限り迅速に行われるべきである。HAuCl₄は非常に腐食性であり、重度の皮膚火傷および眼の損傷を引き起こす可能性がある。取り扱いには特に注意してください。
   2. 64.5mgのクエン酸ナトリウム粉末を0.5mLの脱イオン水でガラスバイアルに溶解して、0.5mLの500mMクエン酸ナトリウム溶液を調製する。
   3. 250 mL の青い蓋付きボトルで 1 mL の 25 mM HAuCl 4 溶液を 99 mL の水で希釈し、100 mL の 0.25 mM HAuCl₄ 溶液を得た。
   4. 99.5 mL の 0.25 mM HAuCl₄ 溶液を、コンデンサーを備えた 250 mL の三つ口ナスフラスコに加えます。激しく撹拌しながら溶液を90°Cに加熱し、温度を15分間維持する。
   5. 500 mM クエン酸ナトリウム溶液 0.5 mL を反応混合物に注入し、溶液の色がルビーレッドに変わるまで温度と攪拌を維持する。
      注:反応には約30分かかります。
2. 運動学的に制御^{された方法による}Au NPsの播種成長
   1. 合成したAuシード溶液を70°Cに冷却する。
   2. 154.8mgのクエン酸ナトリウム粉末を10mLの脱イオン水でガラスバイアルに溶解して、10mLの60mMクエン酸ナトリウム溶液を調製する。
   3. 0.67 mL の 25 mM HAuCl₄ 溶液および 0.67 mL の 60 mM クエン酸ナトリウム溶液を 2 分間の時間間隔で Au 種子に注入します。
   4. 手順 1.2.3 を繰り返して、Au NP のサイズを徐々に 40 nm まで増やします。
      注:40nmに達するまでに約10の成長ステップが必要です。実際に必要なステップ数は、正確なセットアップに依存する場合があります。
3. 自動シンセサイザーを用いたAu NPの播種成長(図2)
   1. セクション1で調製したAuシード溶液25 mLを50 mL円錐遠心管に移し、サーモミキサーで70°Cまで冷却した。
      メモ: 25 mL の水を含む 50 mL の遠沈管に入れた熱電対温度計を使用して、サーモミキサー内の温度を監視します。
   2. 3 mL ルアーロック使い捨てシリンジに 2.5 mL の 25 mM HAuCl₄ 溶液を充填します。別の3 mLルアーロック使い捨てシリンジに2.5 mLの60 mMクエン酸ナトリウム溶液を充填します。
   3. シリンジをシリンジポンプに入れ、Luer-to-MicroTightアダプタを使用してPEEKチューブ(内径150μm)をシリンジに接続します。サーモミキサーでAuシード溶液を入れた遠沈管にチューブを挿入します。
   4. 両方のシリンジポンプをセットして、0.1675 mL の溶液を 20 分間 (1 分あたり 8.357 μL) 分注します。
   5. サーモミキサーの回転数を 700 rpm に設定し、25 mM HAuCl₄ 溶液を含むシリンジポンプで Start を押します。
   6. 2分後、60mMクエン酸ナトリウム溶液を含むシリンジポンプで 開始 を押します。
   7. HAuCl4溶液注入を開始してから30分後、分析のためにAu NP溶液のアリコートを除去する。
   8. 手順 1.3.5 ~ 1.3.7 を繰り返して、Au NP の直径を 40 nm まで徐々に拡大します。
      注: このセットアップは、ステップ 1.3.4 で添加される反応物の量を増やすことによって、Au NP を 1 ステップで最大 40 nm まで成長させるために使用できます。これは、同じ注入速度を維持しながら調剤時間を増加させることによって達成される。

2. Au NPの特性評価

1. UV-Vis分光法
   1. 1mLのAu NP溶液をセミマイクロ石英キュベットに加える。
   2. 分光器をオンにします。
   3. 波長範囲を 400 ~ 800 nm に設定します。
   4. 各サンプルのUV-Visスペクトルを取得します。
2. 動的光散乱 (DLS)
   1. サンプル溶液を0.22μmフィルターでプラスチック製のセミマイクロキュベットにろ過します。
   2. DLS インストゥルメントをオンにします。
   3. 温度を25°Cに設定し、60秒間平衡化します。
   4. 各サンプルの流体力学的サイズを測定します。
3. 透過型電子顕微鏡(TEM)
   1. サンプル溶液の5 μLの液滴をCコーティングされた300メッシュCuグリッド上にドロップキャストし、空気中で乾燥させる。
      注: TEM グリッド上に十分に分散した Au NP を得るためには、より濃縮された Au NP 溶液サンプルに希釈が必要です。
   2. 200kVの加速電圧でTEMを使用して、サンプルごとに複数のTEM画像を取得します。
   3. ImageJを使用して各サンプルの200Au NPの直径を測定し、平均サイズと標準偏差を計算します。

3. CB7-UA複合体の形成

1. 0.4 mM CB7溶液の調製
   1. 4.65mgのCB7を15mLのガラスバイアルに加える。
      注:CB7の量は、文献中のほとんどの報告によって採用されているCB7の式重量(=1163Da)に基づいて計算される。それにもかかわらず、CB7固体サンプルは、典型的には、合成および精製ステップから残された水、HCl、メタノールおよび他の塩を含み、サンプル中の〜10〜20%の死重量に寄与する。捕捉された溶媒および塩は、真空オーブンまたは他の手段で加熱することによって除去することができなかった。それらの量はサンプルの異なるバッチ間で異なるが、元素分析を使用して定量化することができる。しかしながら、提示されたプロトコルは、CB7サンプル中の未定量量の溶媒および塩の存在に敏感ではない。
   2. バイアルに10mLの水を加え、キャップを締めます。
   3. CB7固体が完全に溶解するまで、室温でサンプルを超音波処理する。
      注:CB7は文献²⁷ に従って合成されたが、市販品でもある。
2. 0.4 mM UA溶液の調製
   1. 2.69 mg の UA を 50 mL 遠沈管に加えます。
   2. チューブに40mLの水を加え、キャップを締めます。
   3. サーモミキサーを使用して、温度を70°C、速度を800rpm、時間を2時間に設定してサンプル溶液を旋回させます。溶液を室温まで冷却する。
      注: UA は水への溶解度が低い (0.40 mM)⁵。UA粉末が完全に溶解していない場合は、より長く旋回する。あるいは、超音波処理は、溶解を容易にするために使用することができる。
3. 0.4 mM UA 溶液の逐次希釈
   1. 5 mL の 0.4 mM UA 溶液を 15 mL のガラスバイアル中の 5 mL の水で希釈し、10 mL の 0.2 mM UA 溶液を得た。キャップを締め、30秒間超音波処理します。
   2. 表 1 に記述されているように、適量の UA と水を使用して手順 3.3.1 を繰り返します。
4. CB7-UA複合体の調製
   1. 0.75 mL の 0.4 mM CB7 溶液および 0.75 mL の 0.4 mM UA 溶液を 1.5 mL チューブに加えます。蓋を固定し、30秒間超音波処理します。
   2. ホスト - ゲスト複合体の形成を確実にするために 30 分間待ちます。
   3. 異なる濃度のUA溶液を使用して、ステップ3.4.1 - 3.4.2を繰り返します。

4. UAのSERSセンシング

1. ラマンシステムの実験的セットアップ(図3)
   1. 633 nm He-Neレーザー(22.5 mW)の電源を入れます。
   2. モジュラーラマン分光計の電源を入れます。
   3. コンピュータの電源を入れ、ソフトウェアを起動します。
   4. 分光法アプリケーションウィザードアイコンをクリックし、ラマンを選択します。
   5. 新しい取得を開始します。積分時間を 30 秒、スキャンを平均に 5、ボックスカーを 0 に設定します。
   6. バックグラウンドスペクトルを保存し、レーザー波長(すなわち、633nm)を入力します。
      注:積分時間は各スキャンの時間であり、平均へのスキャンは各スペクトルを作成するために平均化されたスキャンの数であり、boxcarは平均²⁸の隣接するピクセルの数である。
2. SERS基板の形成
   1. 0.9 mL の 40 nm Au NP 溶液および 0.1 mL の予備形成済み CB7-UA 複合体溶液を 1.5 mL チューブに加えます。蓋を固定し、溶液がルビーレッドからパープルに変わるまで超音波処理します。
      注: 市販のクエン酸塩安定化 40 nm Au NP 溶液サンプルも使用できます。典型的には、局在型表面プラズモン共鳴(LSPR)ピークの光学密度は、濃縮原液試料からの希釈を介して1に調整される。試料中のクエン酸塩濃度は、典型的には2mMとして保持される。
   2. 試料溶液をセミマイクロキュベットに移す。キュベットをラマンサンプルホルダーに入れ、カバーを閉じます。
   3. 測定を開始します。
   4. 5つの連続したSERSスペクトルを記録するように自動保存を設定します。
   5. 測定を停止し、サンプルを変更します。
   6. 異なる濃度のCB7-UA溶液を使用して、ステップ4.2.1 - 4.2.5を繰り返します。
      注:凝集時間は、Au NPの凝集を媒介する大きな寄与を有する空のCB7の濃度の違いのために、0.1μM UAの30秒から20μM UAの30分の範囲のナノ凝集体中のUAの濃度に依存することが見出される。CB7−UA複合体の場合、1つのポータルはかさばるUA分子によって遮断され、Au NP表面への結合に利用できなくなり、したがってNP凝集²¹を媒介することができなくなる。溶液の色がルビーレッドからパープルに変わると、サンプルは測定の準備が整います。

5. データ解析

1. データ処理
   1. 非対称最小二乗法(ALS)プラグインを使用したベースラインをOriginにダウンロードしてインストールします。
      メモ: ALS プラグインには OriginPro が必要です。
   2. 生データを Origin に挿入します。
   3. 各サンプルの5つのSERSスペクトルから平均値を算出する。レーザーのパワー(22.5mW)と積分時間(30秒)で値を割ります。
   4. ALS アイコンをクリックしてダイアログを開きます。非対称係数を 0.001、しきい値を 0.03%、平滑化係数を 2、反復回数を 20 に設定して、各平均スペクトルのベースラインを修正します。
   5. 異なるUA濃度のSERSスペクトルを、yオフセットによる積み上げ線を使用してプロットします。出力は、ラマンシフト(^cm-1)に対する強度(カウントs-1 ^mW-1)でなければなりません。

提示されたAu NP合成では、UV-Visスペクトルは10の成長ステップ後にLSPRピークの521nmから529nmへのシフトを示し(図4 A,B)、DLSデータはAu NPのサイズが25.9nmから42.8nmに増加するにつれて狭いサイズ分布を示す(図4C,D)。TEM画像から測定されたG0、G5、G10の平均サイズ(図4E)は、それぞれ20.1±2.1nm、32.5±2.3nm、40.0±2.2nmであり、それぞれのケースで200個の粒子がカウントされています。これらの結果は、このプロトコルが均一で狭く分散したAu NPの合成に有効であることを示している。

提示されたSERS研究において、CB7およびUAのホスト - ゲスト複合体は、SERSスペクトルにおける特徴的なUA信号によって支持されるように、Au NP:CB7ナノ凝集体内の正確なプラズモニックナノ接合の形成を媒介する空のCB7と共に形成された(図5A)。

CB(+でマーク)およびUA(*でマーク)のラマンピークの割り当てを 表2に示す。逆に、CB7の非存在下ではUAのSERSシグナルは観察できず、Au NPの凝集を誘発する上でのCB7の重要な役割を示している。

再現性のあるプラズモニックナノ構造(すなわち、SERS基質)のin situ形成を確実にするために、UA全体のUAのSERS滴定において、20μMの一定のCB7濃度が使用された。このプロトコルで提示された検出スキームの高感度は、640 cm-1および1130 cm-1(それぞれ骨格リング変形およびC-N振動に起因する)のUAピークからの明確なSERS信号の観察によって実証され、検出限界として知られる〜0.2μM(図5B−D)まで低下した。さらに、UAのSERS強度と対数濃度との間の非常に強い相関(R2>0.98)は、両方のピークについてべき乗則によって得られ、線形領域は0.2〜2μMの範囲に見出された(図5E、F)。我々のデータで観察されているように、SERS強度と対数濃度の間の線形相関は、狭い範囲の分析物濃度について近似することができるが、対数濃度が負の無限大に近づく(すなわち、分析物濃度が0に近づく)と、SERSシグナルは0に近づくことに留意すべきである。SERS信号は、図5E,Fに示す小さなエラーバーによって証明されるように、再現性も高いです。

図1:自己組織化Au NP:CB7ナノ凝集体内の正確なプラズモニックナノ接合の概略図。 挿入図はプラズモニックナノ接合のズームインを示しており、そこでは凝集が空のCB7によって媒介され、UAはホスト-ゲスト複合体形成を介してAu NPの表面に濃縮される。スキームは縮尺どおりに描画されないことに注意してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:(a)自動Au NPシンセサイザの概略図および(b)写真。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ラマンシステムの概略図この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:Au NPの代表的な特性評価 (A)Au NPのUV-Visスペクトルおよび(B)成長ステップ数が10に増加するにつれてLSPRピークのシフトを示すズームインスペクトル。(C)Au NPsの流体力学的サイズおよび(D)成長ステップ数の関数としての粒径の対応するプロット。(E)Au NPsのTEM画像は、5および10の成長ステップ後のAu種子およびAu NPのサイズを示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:Au NP内のUA検出の代表的なSERS結果:CB7ナノ凝集体。 (a)CB7の存在下または非存在下におけるUAのSERSスペクトル。CB7およびUAのラマンピークは、それぞれ+および*によってマークされる。(B)フルレンジ、(C)600〜700 cm-1ズームインおよび(D)0〜20μMの濃度を有するUAの1100〜1180cm−1ズームインSERSスペクトル。UAの主なラマンピークは*でマークされています。スペクトルは、明瞭さのためにベースライン補正およびオフセットされた。(E,F)UAの濃度に対するSERSピーク強度の対応するプロット。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:UA溶液の逐次希釈。

表 2: CB7 および UA2,4,29 のラマンピークの割り当て。

著者らは開示するものは何もありません。