方法論記事

ネコ大型動物モデルにおけるヒト胚性幹細胞由来網膜組織の網膜下移植

DOI：

10.3791/61683

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2021年8月5日

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1College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Lineage Cell Therapeutics, Inc.

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の網膜組織を大型動物モデルの網膜下腔に移植する手術手技について紹介する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

加齢黄斑変性症(AMD)、網膜色素変性症(RP)、レーバー先天性アマウロシス(LCA)などの光受容体喪失に関連する網膜変性(RD)状態は、進行性および衰弱性の視力喪失を引き起こします。光受容体が失われた後に視力を回復させることができる治療法に対する満たされていないニーズがあります。ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の網膜組織(オルガノイド)を高度なRDを用いて眼の網膜下腔に移植すると、何千もの健康な変異のない光受容体を備えた網膜組織シートが得られ、1つの承認されたプロトコルで光受容体変性に関連するほとんど/すべての失明性疾患を治療する可能性があります。動物モデルおよび進行RD患者の網膜下腔への胎児網膜組織の移植は成功裏に開発されているが、倫理的懸念および限られた組織供給のためにルーチン療法として使用できない。大眼遺伝性網膜変性症(IRD)動物モデルは、網膜細胞/組織を網膜下腔に移植するための高度な外科的アプローチを利用した視力回復療法の開発に価値があります。地球規模と視細胞分布の類似性(例えば、黄斑様領域 の中心の存在)と、ヒトIRDを厳密に再現するIRDモデルの入手可能性は、有望な治療法の臨床への迅速な翻訳を促進するでしょう。ここでは、hPSC由来の網膜組織を大型動物モデルの網膜下腔に移植する外科的手法を紹介し、動物モデルにおけるこの有望なアプローチの評価を可能にします。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

世界中の何百万人もの人々が網膜変性症(RD)の影響を受けており、その結果、光感知光受容体(PR)の喪失に関連する視覚障害または失明が生じています。加齢黄斑変性症(AMD)は、遺伝的危険因子と環境/ライフスタイル要因の組み合わせに起因する失明の主な原因です。さらに、200を超える遺伝子と遺伝子座が遺伝性RD(IRD)1を引き起こすことがわかっています。最も一般的なIRDである網膜色素変性症(RP)は遺伝的に不均一であり、約70の遺伝子で3,000を超える遺伝子変異が報告されています2,3,4。小児期に失明を引き起こすレーバー先天性アマウロシス(LCA)も遺伝的に異因性です5,6。遺伝子増強療法が開発され、少数のIRDを治療するための臨床試験が行われています3,7。ただし、IRDの異なる遺伝的形態ごとに治療し、それによって患者のごく一部のみを治療するために、個別の治療法を開発する必要があります。さらに、遺伝子増強は、救助可能な光受容体の集団の存在に依存しているため、進行した変性には適用できません。

したがって、進行性RDおよび重度の終末期失明に対処および治療する治療法の開発には、緊急でありながら満たされていない臨床的ニーズがあります。過去20年間、神経補綴インプラントは、人間が使用する前に、猫などの大型動物モデルで開発およびテストされてきました8,9,10,11,12,13,14。同様に、過去20年間で、網膜下に移植された胚性または成熟した哺乳類の網膜のシートを利用した網膜補充療法が開発され15,16,17,18,19,20,21,22、RD患者でも成功裏に試験されています23,24,25.どちらのアプローチも、新しいセンサー(神経補綴デバイスの場合は光起電力シリコンフォトダイオード26,27、網膜シート移植の場合はシートに編成された健康な突然変異のない光受容体)を変性PRの網膜に導入するというアイデアを利用しています。最近の研究では、ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の網膜前駆細胞28,29、hPSC光受容体30、hPSC-網膜オルガノイド31,32,33の移植などの幹細胞ベースのアプローチの使用が調査されています。網膜オルガノイドは、ディッシュ内での網膜組織の形成と、発達中のヒト胎児網膜の光受容体層に似た数千の突然変異のないPRを有する光受容体シートの誘導を可能にします34,35,36,37,38,39,40.hPSC由来の網膜組織(オルガノイド)をRD状態の患者の網膜下腔に移植することは、新しく有望な治験細胞療法アプローチの1つであり、多くのチームによって追求されています31、32、41、42。(若い光受容体または網膜前駆細胞の)細胞懸濁液の移植と比較して、胎児の光受容体の移植シートは、臨床試験で視力の改善をもたらすことが実証されました23,24。

ここで提示されたプロトコルは、移植片の生存率を高め、シートの保存を改善するために、PRを備えた無傷の網膜シートを導入するための潜在的により良い方法として、網膜オルガノイド全体(オルガノイドリム33,41ではなく)の網膜下送達のための移植手順を詳細に説明しています。ヒト網膜の平らな部分とRPEパッチを導入するための手順が開発されていますが43、44、45、より大きな3D移植片の移植は調査されていません。幹細胞由来の網膜オルガノイドは、視力回復技術を開発するための光受容体シートの無尽蔵の供給源を提供し、倫理的制限がなく、進行性RDおよび終末失明の治療に焦点を当てた治療のためのヒト網膜組織の優れた供給源と考えられています46。宿主の網膜ニッチ(神経網膜、網膜色素上皮、網膜および脈絡膜血管系)への損傷を最小限に抑えて網膜オルガノイドを正確に網膜下移植するための外科的方法の開発は、そのような治療を臨床応用に向けて進めるための重要なステップの1つです31,32。ネコ、イヌ、ブタ、サルなどの大型動物モデルは、外科的送達方法を調査するための優れたモデルであることが証明されており、移植された組織シート(網膜色素上皮(RPE)細胞)の安全性を実証し、オルガノイドの使用を調査しています41、44、45、47、48、49、50.大きな動物の目は、人間の黄斑6,51,52に似た錐体(領域中心)を含む高い光受容体密度の領域の存在を含む、人間と同様の地球サイズと類似の解剖学的構造を持っています。

本稿では、ネコ大型動物モデル(野生型およびCrxRdy/+ネコ)の網膜下腔にhPSC由来の網膜組織(オルガノイド)を移植する技術について述べており、有望な有効性の結果32,53とともに、RD状態を治療するための臨床応用に向けたそのような治験療法のさらなる開発の基礎を構築します。

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プロトコル

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手順は、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科学研究協会(ARVO)の声明に準拠して実施されました。それらはまた、ミシガン州立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。この研究では、ミシガン州立大学で飼育されている猫のコロニーからの野生型および CrxRdy/+ 猫を使用しました。動物を12時間:12時間の明暗サイクルで飼育し、市販の完全な猫の飼料を与えた。

1.着床前の手順と外科的セットアップ

  1. 研究デザインに応じて、野生型または CrxRdy/+ 猫を選択します。細隙灯生体顕微鏡検査および間接検眼鏡検査を含む術前眼科検査を実施する。遺伝子型に関連しない眼底異常のある動物を除外します。
  2. 移植の1週間前に、移植拒絶反応を防ぐために、経口シクロスポリン2 mg / kgとプレドニゾロン1 mg / kgの両方の免疫抑制プロトコルで動物を開始します。
  3. 生後4ヶ月以上の動物を一晩(少なくとも8時間)絶食させる。生後4か月未満の動物に限られた量のウェットフードを一晩提供し、手術前に2時間絶食します。
  4. 胸部聴診(聴診器を使用)を含む一般的な身体検査を行います。心拍数と呼吸数、温度、粘膜の色、毛細血管の補充時間を記録します。
  5. 生後4か月未満の動物にブプレノルフィン(0.02 mg / kg)を投与し、生後4か月以上の動物にブプレノルフィン(0.02 mg / kg)とアセプロマジン(0.02 mg / kg)を全身麻酔導入の30〜45分前に皮下または筋肉内に投与します。.
  6. 局所1%トロピカミド点眼液と10%フェニレフリン点眼液を眼の表面に少なくとも2回塗布して、瞳孔を拡張します。.生徒が十分に拡張していない場合は繰り返します。
  7. すべての動物の橈側皮静脈に22 Gの静脈内カテーテルを配置します:最初に頭側静脈の上の2 x 3 cmの領域から髪を切り取ります。最初に70%エタノールでこすり洗いし、次にクロルヘキシジンスクラブで皮膚をこすり洗いして皮膚を準備します。カテーテルを置き、医療用テープで固定し、ヘパリン化生理食塩水で洗い流します。4ヶ月未満の動物では、これは麻酔の導入後に行うことができます。
  8. 前投薬後30〜45分で全身麻酔を誘発する:生後4か月未満の動物はマスクで送達されるイソフルランで誘導され、生後4か月を超える動物は静脈内プロポフォール(4〜6 mg / kg)を使用して誘導されます。.
  9. 適切なサイズの気管内チューブで挿管します。検査ライトまたは喉頭鏡で喉頭を視覚化します。0.1 mLのリドカイン2%を喉頭にスプレーし、数秒待ってから挿管します。.
  10. ベインシステムを介して酸素(300〜600 mL / kg / min)中のイソフルラン(2%〜3.5%)で麻酔を維持します。.
  11. タオルで覆われた温水ブランケットが置かれている位置決め枕の上に動物を背側横臥に置きます。患者モニターを取り付け、心拍数と心電図(ECG)、呼吸数、血圧、酸素飽和度、および潮汐終末二酸化炭素を監視します。処置中は体温を定期的に監視してください。適切な訓練を受けた人が麻酔の維持と監視を担当します。
  12. 目が主視線位置に回転したときに角膜表面が水平になるように、位置決め枕の助けを借りて動物を配置します。医療用テープを使用して頭を所定の位置に固定します。
  13. 体温を維持するために毛布で動物を覆います。
  14. 静脈内カテーテルをヘパリン化生理食塩水で洗い流し、処置期間中、2〜5 mL / kg / hで供給されるリンゲル乳酸の静脈内注入を開始します。.
  15. 0.2%ポビドンヨード、滅菌綿棒アプリケーター、および綿球を使用して、無菌手術のために眼の表面、結膜嚢、およびまぶたを準備します。
  16. 接眼レンズを備えた手術用顕微鏡の位置も適切に調整されます。顕微鏡のフットコントロール(フォーカス、ズーム、XY軸コントロール)と硝子体切除装置を配置して、外科医が操作できるようにします。
  17. 無菌手術の準備:すべての担当者は、外科用スクラブ、手術用帽子、およびマスクを着用する必要があります。外科医と助手が日常の無菌手術のようにスクラブ、ガウン、手袋をこすります。すべての担当者は無菌技術に精通している必要があります。
  18. 職員がこすり洗いされ、ガウンを着用し、手袋をはめたら、外科用パックを開き、器具をレイアウトします。顕微鏡調整ノブに滅菌操作ノブを配置して、外科医または助手が無菌を壊すことなく調整できるようにします。眼の手術のために日常的な方法で動物をドレープします。
  19. 2ポート硝子体切除術の製造元の指示に従って、硝子体切除機を準備します。
    1. 硝子体切除コンタクトレンズと2つのポート23 G硝子体切除術を助手のテーブルに置きます。湿地焼灼を取り付けます。輸液チューブと23G硝子体切除ハンドピースを取り付けてプライミングします。
    2. 硝子体切除器具と液体ラインを滅菌ドレープの上に置き、タオルクランプを使用して所定の位置に維持します。硝子体切除機を比例真空モードに1,500〜2,500カット/分(cpm)、最大真空度500mmHgに設定します。これは、硝子体切除装置のフロントパネルにある矢印ボタン(上向きまたは下向き)を押すことによって実行されます。

2. 網膜下移植用オルガノイドの調製(図1)

  1. 以前に概説したように網膜オルガノイドを誘導し31、必要に応じて、以前に報告されたように37°Cで一晩出荷します54。
  2. 受入検査室の組織培養室の表面を消毒剤で拭き取り、眼科手術用の手術室と同等の高レベルの無菌技術を維持し、細菌や真菌の汚染を回避し、手術室に持ち越して手術部位の感染を防ぎます。
  3. 眼科手術用のオルガノイド調製に割り当てられた組織培養室内で、手術靴カバー、使い捨て白衣、ボンネット、サージカルマスク、スリーブ、および外科用スクラブを着用してください。
  4. 神経培地を20 ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)および20 ng/mLの脳由来神経栄養因子(BDNF)と組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で1時間、事前に平衡化します。オルガノイドを超低接着プレートの培地に入れ、約4分の1容量のコンディショニング培地(翌日出荷時)と4分の3容量の新鮮培地31,54を使用します。24〜48時間維持します。
  5. 最初の動物に麻酔をかける前に、いくつかの新鮮な60 mmプレートを準備し、組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で少なくとも1時間神経培地(ステップ2.4で準備)で平衡化します。これらのプレートは、プレートを手術室に移動し、オルガノイドをカニューレに装填するのに十分なpH条件とCO2 飽和度が培地中で少なくとも20分間維持されることを前提として、個々の手術ごとにオルガノイドを移送するために使用されます。
  6. 移植症例ごとに、事前に飽和した神経培地を入れた新しい60 mmプレートを使用し、残りのプレートを組織培養インキュベーターで37°Cに保ちます。
  7. 6–9個のオルガノイドを、広い(~0.7 mm)開口部を持つ200 μLの滅菌フィルターチップを備えた手動シングルチャンネルピペット(20–200 μL)でピペッティングして、1つの60 mmディッシュ(再飽和培地を含む)に移します。これらのチップは、事前に、または手順中に、滅菌ハサミ(汚染を避けるために組織培養フード内で行われる)でチップの~3-4 mmを切り取ることによって準備することができます。60 mmディッシュを100 mm組織培養ディッシュの中に置き(部屋から部屋への輸送中の汚染を避けるため)、手術室にすばやく輸送します。
  8. オルガノイドを入れたプレートを、滅菌ドレープで覆われた37°Cの電気加熱パッドの上に置きます。
  9. オルガノイドを準備する前に、新しい滅菌手袋に交換してください。
  10. オルガノイドを滅菌平衡塩溶液(BSS)(オプション)ですすぎ、薄肉のホウケイ酸ガラスカニューレ(外径、外径1.52 mm、内径、内径1.12 mm)で構成されるインジェクターに装填し、研磨された鈍端を滅菌プラスチックチューブで滅菌BSSを事前に充填した滅菌500 μLハミルトンシリンジに取り付けます。
  11. オルガノイドを注入する準備ができたら、無菌状態でカニューレを外科チームに渡します。
  12. 手順全体(組織培養培地からのオルガノイドの除去からカニューレのロードまで)の長さを20分以下に保ちます。
  13. オルガノイドの移植が遅れる場合は、ディッシュ内のpH/CO2 飽和度の変化を避けるために、オルガノイドを組織培養インキュベーターに戻します。
  14. 未使用のオルガノイドを同じ組織培養インキュベーターで1週間保持し、汚染の証拠がないか監視します。

3. 網膜下オルガノイド移植

  1. スティーブンス腱切開術ハサミで0.5〜1 cmの外側カント切開を行います。まぶたを開いたままにするために、適切なサイズのバラカーまぶた検鏡を配置します。手術助手が処置期間中、BSSで角膜を定期的に洗浄することを確認してください。
  2. 4時と8時の位置で縁のすぐ隣の結膜に6〜0の絹縫合糸の2つのステー縫合糸を配置して、目を主視線で保持し、3番目のまぶたを引っ込めます。0.5カストロビエホ角膜結束鉗子と小さな蚊の止血剤を使用して、辺縁部の横にある球結膜をそっとつかみます。縫合糸を長くし、両端を小さな蚊の止血剤で固定して、操作を助けます。
    注:縫合糸を3番目のまぶたの下に置くことはより困難です。必ずリンバスのすぐ隣に置いてください。
  3. 眼を貫通しないように注意しながら、リンバスの厚さを部分的に通してリンバスの12時位置に別の縫合糸を置きます。この縫合糸をゆるく結び、両端を短く切ります。これにより、手術中に目を回転させるための「ハンドル」として使用される堅牢なアンカー縫合糸が提供され、外科医は手順のさまざまな段階で地球のさまざまな部分にアクセスできます。
    メモ: 手順 3.2 と 3.3 は逆にすることができます。ステー縫合糸の配置の順序は、外科医の好みです。
  4. 10時から2時の間(視野測定)に球結膜を反射します。腱切開ハサミを使用して、結膜を縁から2〜3 mm切開します。それを弱体化させ、ほぞのカプセルを取り除き、動物の年齢に応じて縁から約3〜5 mmのところに配置される2時と10時の硝子体切除ポートの部位で強膜を露出させます。止血や血液の除去には、外科用セルロース槍を使用してください。
  5. ノギスを使用して結膜とほぞのカプセルの反射に続く強膜切開部位を特定します。猫に目立つ可能性のある主要な強膜血管を避けるために、強膜切開部位(扁平を通過することを目的とした2時と10時)を選択します。強膜出血を減らすために、計画された強膜切開部位の強膜に湿式野焼灼を使用し、硝子体切除術後に拡大して移植カニューレを導入できるように、器具ポート(右利きの外科医の場合は10時のポート)で~3mmの領域を計画します。
  6. 硝子体切除ポートを配置する前に、提案された硬化切除部位で結び目を結ぶことなく、十字靭帯パターン縫合糸(6-0または7-0ポリグラクチン縫合糸)を事前に配置します。
    注:これにより、手順の最後に硬化切開術を迅速に閉じることができます。計画された計器ポートの縫合糸は、長い切開になるため、強膜のより長い咬合を有する必要がある。
  7. 縫合糸を配置したら、アシスタントに、ビショップハーモン鉗子を結ぶか使用して、12時のステー縫合糸を保持して、地球儀の位置を手伝うように依頼します。外科医にも地球を安定させ、0.12 mmのカストロビエホ鉗子を使用して、強膜切開部位の隣に組織を保持します。
    1. レンズとの接触を避けるために、視神経に向かって斜めに向けられた2時位置と10時位置の両方で強膜を通してトロカールを使用して23G硝子体切除ポートを導入します。
    2. 先端が硝子体で視覚化できるように、結束鉗子を使用してポートをそっと押して、灌漑ポートが硝子体にあることを確認します。正しい位置が確認されたら、灌漑ラインをポートに取り付け、薄い絆創膏を使用してラインを配置して所定の位置にテープで固定します。硝子体切除術装置のフロントパネルにある矢印ボタン(上向きまたは下向き)を押して、BSSバッファーの硝子体切除注入を最初に30〜35 mmHgに設定します。
  8. アシスタントにMachemer拡大灌漑硝子体切除レンズを角膜にかざして、次の段階で目の後部を視覚化できるようにします。洗浄硝子体切除レンズをドリップセットに取り付けて、レンズを角膜に結合するための一定の液体供給を提供します。
    注:他の形態の接触硝子体切除レンズも使用できます。部屋の照明を暗くするかオフにして、手術用顕微鏡で視覚化できるようにします。
  9. 23 G硝子体切除用プローブ/カッター(2,500 cpm)を器具ポート(外科医の利き手、つまり右利きの外科医の場合は10時のポートに隣接)に挿入し、部分的なコア硝子体切除術を実行します。
    1. 次に、硝子体の顔を網膜から切り離して、移植を受ける領域の網膜表面から硝子体を完全に取り除きます(これは手順の成功にとって重要です)。
    2. 硝子体切除プローブを視神経乳頭の上に置き、ポートを網膜表面から反対側に向けて、より高い真空を適用して硝子体顔面剥離を開始します。
  10. 眼内使用のためのトリアムシノロン結晶を調製する。トリアムシノロン懸濁液が硝子体内使用に特化していない場合は、結晶を洗浄してからBSSに再懸濁します。
    1. 最初に、PESメンブレン(1 mLシリンジに取り付けた)を備えた滅菌0.22 μm細孔シリンジフィルターを使用して懸濁液をろ過し、結晶をトラップします。
    2. 次に、1mLシリンジでBSSを吸引し、フィルターを通して洗い流すことによって、トラップされたトリアムシノロン結晶を洗浄します(結晶はフィルターに閉じ込められたままです)。これにより、溶液中の防腐剤が除去されます。洗浄を3回繰り返した後、結晶を1mLのBSSに再懸濁する。
  11. トリアムシノロンを保持しているシリンジの針を計器ポートから導入します。計器ポートに針を通しながら、瞳孔を通して針の先端を見てレンズに触れないように注意してください。0.25〜0.5 mLの結晶懸濁液を注入します。.次に、硝子体切除プローブを器具ポートに挿入し、ポートを網膜表面から離して視神経乳頭の近くに進め、高真空を使用して硝子体顔を網膜から切り離します。
    注:トリアムシノロン結晶はガラス質に付着し、残りのガラス体を強調します。計画されたオルガノイド移植部位の上および隣の硝子体を慎重に除去します(例:.、中央領域に近い 中央 タペタル眼底)。.
  12. 網膜下インジェクター、例えば、滅菌BSSで満たされた滅菌250μLの気密ルアーロックシリンジに取り付けられた拡張可能な41Gカニューレを備えた23G網膜下インジェクターを使用して、目的の移植部位に小さな焦点網膜剥離ブレブを作成します。
    1. 網膜下ブレブを作成する前に、ブレブ形成を促進するために注入圧力を10 mmHgに下げます。
    2. インジェクターを計器ポートに挿入し、網膜表面に向かって進めます。カニューレの先端を押し出し、網膜表面にそっと押し付けます。アシスタントにシリンジプランジャーを少しすばやく押して網膜剥離を開始し、注入圧力を下げて、目的のサイズが達成されるまで網膜剥離をゆっくりと増加させるように依頼します(約100〜200μLのBSSが使用されます)。
  13. 作成された網膜切開術が適切な位置にある場合、移植部位と視神経乳頭の間の網膜を切断して、移植部位に由来する神経線維層の切片化を防ぎ、主要な網膜血管を回避します(これも研究デザインによって決定され、この場合は中心網膜が選択されました)、 その後、インジェクターの41Gカニューレを用いてそれを若干拡大し、網膜ハサミの導入を容易にする狙いとした。
  14. インジェクターを目から取り外し、10時の強膜ポートを取り外します。レンズに触れないように、視神経に向けられたまっすぐな2.85mmスリットナイフ/角膜を使用して、この部位の強膜切開術を拡大します。注入圧力を10〜15 mmHgに維持します。
  15. 網膜出血を防ぐために網膜血管を切断しないように、絞りハンドル付きの硝子体網膜垂直80°はさみを使用して網膜切開術を延長し、移植領域の網膜から視神経につながる神経線維を切断しないように、視神経乳頭から離れてブレブの端で網膜を切断するようにしてください。網膜切開術は、オルガノイドを受け取るのに十分な幅でなければなりません。
  16. オルガノイドを含む事前にロードされたガラスキャピラリー(ステップ2.10を参照)を拡大した強膜切開術に挿入し、直接視覚化して網膜切開部位に向かって進めます。
    1. ガラス毛細血管の先端を使用して網膜切開術をわずかに開き、網膜下ブレブへの開口部にアクセスします。
    2. 顕微鏡を通して見ながら、オルガノイドを網膜下ブレブに注入しながら、インジェクターのプランジャーをゆっくりと押すようにアシスタントに依頼します。BSSはオルガノイドに先行し、網膜切開術を開いてフラッシュする必要があります。
    3. オルガノイドが網膜切開術の端にある場合は、ガラス毛細管の先端でブレブ内のオルガノイドをそっと押します。
  17. 網膜切開術でガラス毛細管を数秒間保持して網膜切開を閉じ、オルガノイドが硝子体に逃げるのを防ぎます。
  18. 眼からガラス毛細血管を非常にゆっくりと取り除き、眼からの体液の突然の放出を避けて、網膜下ブレブからオルガノイドを排出する可能性のある眼内の体液の動きを避けます。
  19. 眼内出血を防ぐために、注入圧力をゆっくりと20〜30 mmHgに上げ、輸液がブレブに直接洗い流されないように注意してください。これは、硝子体切除装置のフロントパネルにある上向き矢印ボタンを押すことによって実行されます。
  20. 十字靭帯パターン(6–0または7–0ポリグラクチン)で事前に配置された縫合糸を使用して硬化切開を閉じます。強膜切開を密封するために、必要に応じて追加の単純な中断縫合糸を追加します。
  21. 助手に輸液ポートを取り外し、外科医に事前に配置された縫合糸をすばやく結んで強膜切開を密閉し、眼圧の低下を防ぐように依頼します。
  22. 6–0または7–0ポリグラクチンを単純な連続パターンで使用して結膜切開(腹膜切開)を閉じます。
  23. 眼底を画像化し(例えば、RetCam IIビデオ眼底カメラ、クラリティ、または同様のものを使用して)、網膜下腔内のオルガノイドの即時位置を記録する。
  24. 綿の先端アプリケーターと綿球の助けを借りて、0.2%ポビドンヨウ素溶液を使用してイメージング後に眼の表面を再準備します。3つのステー縫合糸と蓋検鏡を取り外します。
  25. 外側カント切開術を6-0ポリグラクチン縫合糸で閉じます。単一の埋没縫合糸を配置し、続いて8本の皮膚縫合糸の図を配置して外側眼窩を改革し、次に単純な中断された皮膚縫合糸を使用して残りの創傷を閉じます。
  26. 外科的処置が完了した後、ステロイドと抗生物質の組み合わせ(酢酸メチルプレドニゾロン2mg、デキサメタゾン0.1mg、およびゲンタマイシン1mg)の結膜下注射を行う。角膜に眼科用潤滑剤(人工涙液)を置きます。
  27. 動物を麻酔から回復し、回復中は、著しい眼瞼痙攣、操作に対する重度の抵抗、嗜眠または食欲減退、呼吸および心拍数の増加など、追加の治療を必要とする痛みの兆候がないか注意深く監視します。.必要に応じて術後の鎮痛を行い、不快感がないか注意深く監視します。
    注意: 適切に訓練された担当者のみが、手術前、手術中、および手術後の猫患者の麻酔と監視を担当する必要があります。術後ケアに関する地域の動物倫理委員会の推奨事項に従ってください。

4.着床後の処置、術後治療、および評価

  1. オルガノイドの炎症と拒絶反応を制御するために、経口免疫抑制薬(1 mg / kgプレドニゾロンと2 mg / kgシクロスポリンを1日2回経口投与)で治療を続けてください。.全身抗生物質の適用範囲を提供します(例:.、経口ドキシサイクリン5 mg / kgを1日2回–この抗生物質は、免疫抑制動物における日和見マイコプラズマ感染のリスクのために選択されました)。.
  2. 炎症や有害事象の発生を監視するために定期的な眼科検査を実施してください。オルガノイドを網膜下腔に注入するために必要な大きな網膜切開術にもかかわらず、手術後の最初の数日間に発生する網膜ブレブの平坦化を監視します。各検査で眼底画像を記録し、移植されたオルガノイドの位置と外観を記録します。
  3. 共焦点走査レーザー検眼鏡法(cSLO)およびスペクトルドメイン–光干渉断層撮影(SD-OCT)5,31によって全身麻酔下の動物を、モニタリング期間中および実験終了前に画像化します。
  4. AVMAが承認した方法(例:85 mg / kgのペントバルビタールの静脈内投与)を使用して、実験の終了時に動物を人道的に安楽死させます。鎮静後、ストレスを最小限に抑えるためにペントバルビタールを投与するための静脈内カテーテルを配置します。心拍停止による死亡を確認し、胸部を切開して気胸を作製する。
  5. 標準的な経結膜アプローチで目を取り除き、必要に応じて固定します。免疫組織化学(IHC)の場合は、0.3 mLの固定液を11パーカーブレード(リンバスから~3-4 mm)で扁平線に作られた3つのスリットを通して後眼部に注入した後、直ちに4%パラホルムアルデヒド溶液に眼を浸します。
  6. 4°Cで3.5時間の固定後にアイカップを解剖します。 残留硝子体を取り除き、網膜とオルガノイドを無傷で保存します。固定液に戻し、4°Cでさらに30分間、次にアイカップをPBSで10分間3回ずつすすぎます。アイカップを15%スクロースに2時間移し、次に30%スクロースにさらに2時間移します。
  7. アイカップをPBSで2回すすぎ、OCT培地(最適な切断温度のコンパウンド)に埋め込み、瞬間凍結してから、組織学および免疫化学のために切片化するまで-80°Cで保存します。
  8. 研究プロトコルと目的に基づいてIHCの抗体を選択します。

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結果

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この手順により、大型眼動物モデルの網膜下腔へのhPSC由来の網膜オルガノイドの移植に成功し、再現性のあるものが可能になります(ここでは、健康な光受容体(PR)を持つ野生型猫と、PRと網膜が変性したCrxRdy/+猫の2つの例を使用して示されています)。図1に示す手順を使用して、hPSC由来の網膜オルガノイドを調製し、オルガノイドが損傷しないように注入装置のホウケイ酸ガラスカニューレに装填します。これは、オルガノイドの装填中(ステップ2.10)および手術中(ステップ3.16)(図2A、B)、および手術終了時の眼底イメージング(ステップ3.23、図2C)によって直接視覚化することによって確認できます。この技術を用いた網膜下腔におけるオルガノイドの存在は、眼科検査と眼底イメージング(図3A)によって術後に確認され、オ...

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ディスカッション

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hPSC由来の網膜組織(網膜オルガノイド)の網膜下腔への移植は、PR細胞死(重度または末期失明)によって引き起こされる後期網膜変性疾患の視力を回復するための有望な実験的アプローチです。提示されたアプローチは、ヒト胎児網膜組織片の網膜下移植に基づく以前に開発され、首尾よくテストされた実験的療法に基づいています23、24、25。それは、hPSCに由来する代替の、補充可能で倫理的に許容される網膜組織源の使用を提示します。大眼動物モデル51,55における治療の外科的実現可能性と眼の安全性を実証することは、臨床応用に向けたこの有望なアプローチの進歩に必要です。本稿では,正常網膜と変性網膜の両方を有する大型動物モデル(LCAのCrxRdy/+猫モデル)において,hPSC-3D網膜組織(網膜オ...

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開示事項

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Ratnesh K. Singh, Ph.D.、Francois Binette, Ph.D.、Igor O. Nasonkin博士は、Lineage Cell Therapeutics, Inc.の従業員です。著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

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この研究は、NEI Fast-Track SBIR grant R44-EY027654-01A1 および SBIR grant 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones は共同 PI です)。著者らは、Janice Querubin氏(MSU RATTS)が、この研究に含まれる動物の麻酔と一般的なケア、および外科的設定と器具の準備/滅菌の支援を手伝ってくれたことに感謝します。著者らは、移植前日にオルガノイドを受け取り、培地に入れるのを手伝ってくれたPaige Winkler博士と、移植当日の助けに感謝したいと思います。著者らはまた、網膜オルガノイドの入念な出荷、荷送人の組み立て、および各出荷後の温度とGストレス記録のダウンロードについて、Randy Garchar氏(LCTX)に感謝しています。この作品は、作家のイゴール・ナソンキンがバイオタイム(現在のリネージュ)に雇われている間に行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.22 以上PESメンブレン付きmポアシリンジフィルターCameoNAは、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
拡張可能な41Gカニューレ付き23G網膜下インジェクターDORC1270.EXT
250 & micro;LハミルトンガスタイトルアーロックシリンジハミルトンNAは、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
6-0シルク縫合糸チコン707G
6-0 / 7-0ポリグラクチン縫合糸チコンJ570G
アセプロマジンマレイン酸500mg / 5mL(エースプロジェクト)ヘンリーシャインアニマルヘルスNAは、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
プレノルフィン0.3mg / mLパー医薬品NAは、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
cSLO + SD-OCTハイデルベルクエンジニアリングスペクトラリスHRA + OCT
シクロスポリンノバルティスNAは、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
デキサメタゾン2mg / mL (アジウム)ベトンNAは、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
ドキシシリン25mg / 5mLCiplaNAさまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
致命的なプラス溶液 (ペントバルビタール溶液)ボルテックNAは、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
ゲンタマイシン 20mg/2mLホスピーラNAは、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
ガラスキャピラリー(薄肉シングルバレル標準ホウケイ酸(ショットデュラン) ガラス管ワールド精密機器TW150-4
メチルプレドニゾロンアクテテート40 mg / mLザーNAは、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
顕微鏡ツァイスNA
OCT媒体(ティッシュテックOCT化合物)さくら4583
オリンピックVac-PACサイズ23NatusNAは、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
ホルムアルデヒド16%溶液EMS15719
塩酸フェニレフリン10%点眼液AkornNAは、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
プレドニゾロン15mg / 5mLAkornNAは、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
Propofol 500mg / 50mL (10 mg / mL) (PropoFlo28)ZoetisNAは、さまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
RetCam IIビデオ眼底カメラClarity Medical SystemsNAさまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
トリアムシノロン 400mg/10 mL (Kenalog-40)ブリストル -マイヤーズ スクイブ カンパニーNAさまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
トロピカミド 1% 眼科用溶液AkornNAさまざまなサプライヤーを通じて見つけることができます
硝子体切除術 23G ポートアルコンアキュラス システム
硝子体切除機アルコンアキュラス システム
硝子体-網膜垂直80°Cスクイーズハンドル付きはさみFrimenFT170206T
エエブファイパラ

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