抗原タグ付きブロッキング病変とのレプリソーム遭遇の可視化

二本鎖切断に対する細胞応答は、切断を特定のゲノム部位に向けるための一連のますます強力な方法のために十分に文書化されています^1,2,3。位置の確実性により、部位に蓄積してDNA損傷応答(DDR)に関与するタンパク質やその他の要因の明確な特性評価が可能になり、それによって切断を修復する非相同末端結合(NHEJ)および相同組換え(HR)経路が促進されます。もちろん、特定の配列を攻撃しない放射線や化学種などの薬剤によって多くのブレークが導入されます⁴。ただし、これらのために、端をタグ付けとローカリゼーションに適した構造に変換できる手順があります^5,6。ブレークは、免疫グロブリンの再配列などの生物学的プロセスによっても導入され、最近の技術では、それらの局在化も可能になっています⁷。次に、応答因子とそれらのサイトとの関係を決定できます。

ブレークは、固有のブレーカーではないが転写や複製などのDNAトランザクションを妨害する化合物によって形成される付加物の間接的な結果としても現れます。それらは、おそらく修復中に、またはヌクレアーゼ攻撃に対して脆弱な構造を誘発するために、これらの障害物に対する細胞応答の特徴として形成され得る。通常、付加体、ブレーク、および応答因子との関連の間の物理的関係は推論的です。例えば、ICLは、シスプラチンおよびマイトマイシン^C8などの化学療法剤によって、および非塩基性部位⁹の反応生成物として形成される。ICLは、複製フォーク¹⁰に対する強力なブロックとしてよく知られており、それによってヌクレアーゼ¹¹によって切断され得るフォークを失速させる。鎖間の共有結合は、中間体^12,13として絶対的な切断を有する経路によってしばしば緩和され、複製フォーク¹⁴を再構築するために相同組換えを必要とする。ほとんどの実験では、研究者は、レプリケーションフォークとICLの衝突の下流に形成されるブレークに対する関心のある要因の応答を追跡します。しかし、誘発性病変の局在化のための技術がなかったため、リプリソームとその構成部分がICLに近接していることしか想定できません。

私たちは、ICLによってここに示されているように、非配列特異的共有付加体とのタンパク質関連の分析を可能にする戦略を開発しました。私たちのシステムでは、これらは皮膚疾患の治療薬として何千年もの間使用されている光活性天然物であるソラレンによって導入されます¹⁵。私たちのアプローチは、ソラレンの2つの重要な特徴に基づいています。1つ目は、シスプラチンやマイトマイシンC ^8,16などの一般的な化合物によって形成される¹⁰%未満とは対照的に、付加物の90%を超える可能性のある架橋形成の頻度が高いことです。2つ目は、架橋能力を失うことなく、化合物のコンジュゲート化へのアクセシビリティです。私たちは、トリメチルソラレンを、古くから確立された免疫タグであるジゴキシゲニン(Dig)と共有結合させました。これにより、Digタグの免疫染色によるゲノムDNA中のソラレン付加体の検出、および従来の免疫蛍光^{法による可視化が可能になります17}。

この試薬は、以前の研究で、DNAファイバーベースのアッセイ¹⁶を使用して、ICLとの複製フォークの遭遇の分析に適用されました。その作業では、レプリケーションが無傷のICLを過ぎても継続できることがわかりました。これは、複製ストレスによって活性化されるATRキナーゼに依存していた。複製の再開は、CMG複製ヘリカーゼの構造を考えると予想外でした。これは、GINS複合体(G、PSF1、2、3、およびSLD5からなる)およびCDC45(C)¹⁸のタンパク質によってロックされた、リーディングストランド合成のためのテンプレート鎖の周りにオフセットギャップリングを形成するMCMヘテロ六量体(M)で構成されています。複製がリプリソーム衝突の側のICL遠位側で再開できるという提案は、レプリソームの構造の変更を主張した。ICLとの遭遇時にどのコンポーネントが応答に含まれていたかという問題に対処するために、ここで説明するアプローチを開発しました。近接ライゲーションアッセイ(PLA)¹⁹ のパートナーとしてDigタグを利用して、ICLとレプリソーム²⁰のタンパク質との密接な関連を調べました。

1.細胞調製

1. 1日目
   1. 35 mmガラス底培養皿を細胞接着剤溶液で前処理します。
   2. 処理の1日前に前処理皿中の細胞を平板化する。細胞は実験当日に活発に分裂し、50〜70%コンフルエントでなければなりません。
      注:HeLa細胞は、10%ウシ胎児血清、1xペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地DMEMでこの実験で使用されました。接着細胞株に制限はありません。ただし、非接着性細胞は、PLAによる分析の前にスライド上に遠心分離し、固定する必要があります。
2. 2日目
   1. 以前に合成したDig-TMPの凍結アリコートを1:1 EtOH:H₂Oに再懸濁することにより、ジゴキシゲニントリメチルソラレン(Dig-TMP)のストック溶液を調製します。 溶解したDig-TMPの100倍希釈(_H2O)の250 nmでODを測定することにより、濃度を決定します。Dig-TMPの吸光係数は25,000です。各使用前に250nmでODを測定して濃度を確認し、ストック濃度を計算します:Abs x 100 x 10⁶/25,000 =濃度(μM)。一般的に、ストック溶液は約3mMです。溶液は–20°Cで約1ヶ月間保存できます。
      注:Dig-TMPは、ここで説明されている手順に従って、事前に化学合成する必要があります。4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルソラレンをトルエン中で4,7,10-トリオキサ-1,13-トリデカンジアミンと窒素下で12時間還流させる。溶媒を除去し、シリカゲルクロマトグラフィーにより4'-[N-(13-アミノ-4,7,10-トリオキサトリデカ)]アミノメチル-4,5',8-トリメチルソラレン生成物を回収した。生成物をジメチルホルムアミドおよびトリエチルアミン中のジゴキシゲニンNHSエステルに50°Cで18時間結合させます。溶媒を除去し、残渣を分取薄層シリカゲルクロマトグラフィーで精製する。生成物バンドをクロロホルム:メタノール:28%水酸化アンモニウム(8:1:0.1)混合物で溶出します。溶媒を蒸発させ、ペレットを50%EtOH:H₂Oに溶解する。
   2. 50%EtOH:_H2O中のDig-TMPストックを最終濃度5 μMになるまで細胞培養培地に加え、培地を37°Cにします。 プレートから培地を吸引し、予め温めたDig-TMP含有培地を加え、プレートをインキュベーター(37°C、5%_CO2)に30分間入れて、Dig-TMPを平衡化させます。
   3. 細胞がインキュベートしている間に、UVボックス( 材料の表を参照)を37°Cに予熱します。
   4. プレートを予熱したUVボックスに置き、この実験のために細胞を3 J / cm² のUVA光の線量に5分間さらします。プレートは、照射中、37°Cに維持したサーモブロックの上に置いた。次の式を使用して時間を計算します。
      
   5. ピペットを使用して培地を吸引し、新鮮な予熱培地を加え、プレートを37°C、5%_CO2 のインキュベーターに1時間戻します。
   6. メディアを取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で皿を少し洗ってください。
   7. PBSを除去し、PBSに0.1%ホルムアルデヒド(FA)を加え、室温(RT)で5分間添加します。これにより、細胞質要素を抽出し、PLAバックグラウンドを低減するために必要なCSK-R(RNaseを含む細胞骨格抽出バッファー、1.2.9に記載)の前処理中の細胞剥離が防止されます。
   8. FAを吸引し、PBSで一度皿を洗います。
   9. CSK-Rバッファーを加え、RTで5分間インキュベートして細胞質を除去します[CSK-Rバッファー:10 mM PIPES、pH 7.0、100 mM NaCl、300 mM スクロース、3 mM MgCl₂、0.5%トリトンX-100、300 μg/mL RNase A]。バッファーを吸引し、新鮮なCSK-Rを添加し、RTで5分間インキュベートします。
      注:CSKバッファーのストックは4°Cで保存でき、使用直前にトリトンXとRNaseAを添加します。
   10. PBSで3回洗ってください。
   11. 細胞をPBS中の4%ホルムアルデヒドでRTで10分間固定します。
   12. 細胞をPBSで洗浄します。この手順を 3 回実行します。
   13. 冷した100%メタノールを加え、-20°Cで20分間インキュベートします。
   14. 細胞をPBSで3回洗浄します。この時点で、細胞は4°Cの湿潤チャンバー内のPBSに最大1週間保存できます。
   15. 細胞を80 μLの5 mM TritonX-100中で4°Cで10分間インキュベートします。
   16. 100 μLの5 mM EDTAを添加したPBS中で、1 μLの100 mg/mL RNase Aを添加した細胞を37°Cで30分間インキュベートします。
   17. 細胞をPBSで3回洗浄します。
   18. 細胞をブロッキングバッファー(PBS中の5%BSAおよび10%ヤギ血清)の湿潤チャンバー内、4°Cで一晩保存します。

2.近接ライゲーションアッセイ

注:3日目に近接ライゲーションアッセイを実行します。

1. 抗体染色
   1. プレートあたり40 μLの一次抗体溶液を調製:目的の希釈を達成するために適切な量の一次抗体(マウス抗ジゴキシゲニンおよびMCM5、CDC45、PSF1またはpMCM2などのレプリソーム成分に対するウサギ抗体、 材料の表で指定された希釈液)をブロッキングバッファーに追加します(最終容量24 μLに達するため)。軽くたたいて混ぜ、RTで20分間放置します。 複数のサンプルのマスターミックスを準備し、ウェルに適用する前に軽くたたいて混ぜます。
   2. ウェルの中央に40 μLの一次抗体溶液を加え、湿潤チャンバー内で37°Cで1時間インキュベートします。 染色中は、PLAプローブとブロッキングバッファーを室温まで温めます。
   3. RTでPBS-T[PBS-T:0.05%トゥイーン-20 in 1X PBS]で細胞を洗浄します。 この手順を3回実行します。
   4. 洗浄しながら、ディッシュあたり40 μLのPLAプローブ溶液を調製します(PLAプローブは、ウサギまたはマウスIgGを認識する二次抗体で構成され、PLUSまたはMINSオリゴヌクレオチドに共有結合しています):8 μLのPLAプローブ抗マウスPLUS+ 8 μLのPLAプローブ抗ウサギ-マイナス抗体+ 24 μLのブロッキングバッファー。混合し、RTで20分間放置します。 複数のサンプル用のマスターミックスを準備し、ウェルに適用する前によく混合します。プレート内のウェルの中央に溶液を置きます。
   5. 最後の洗浄液を取り出し、40 μLのPLAプローブ溶液をウェルの中央に加え、湿潤チャンバー内で37°Cで1時間インキュベートします。
   6. バッファーAで、RTの傾斜プラットフォームでそれぞれ10分間、3回洗浄します。洗浄中に、ライゲーションミックスをRTに持ち込みます。
2. ライゲーションと増幅
   1. プレートあたり40 μLのライゲーションミックスを準備します:8 μL(5x)のライゲーションストック+ 31 μLの蒸留水+ 1 μLのリガーゼ。複数のプレート用のマスターミックスを準備し、ウェルに適用する前によく混ぜます。
   2. 各プレートに40 μLのライゲーション溶液を加え、湿潤チャンバー内で37°Cで30分間インキュベートします。
   3. 細胞をバッファーAで3回、それぞれ2分間、RTの傾斜プラットフォームで洗浄します。
   4. ディッシュあたり40 μLの増幅溶液を調製します:8 μL(5x)の増幅ストック+ 31.5 μLの蒸留水+ 0.5 μLのDNAポリメラーゼ。複数のサンプル用のマスターミックスを準備し、ウェルに適用する前によく混合します。
   5. 各プレートに40 μLの増幅溶液を加え、37°Cの湿潤チャンバーで100分間インキュベートします。
   6. 増幅溶液を吸引し、バッファーBで洗浄します。 RTの傾斜プラットフォームで、それぞれ6回の洗浄を10分間実行します。
   7. 0.01倍バッファーBでRTで1分間1回洗浄します。
   8. バッファーBを吸引し、二次抗体であるAlexa Fluor 488抗マウスIgGおよびAlexa Fluor 568抗ウサギIgGを含むプレートをブロッキング溶液中で、ブロッキングバッファー中の適切な希釈率で、湿潤チャンバー内で、37°Cで30分間、または4°Cで一晩インキュベートします。
   9. 細胞をPBS-Tで3回、RTの傾斜プラットフォームでそれぞれ10分間洗浄します。
   10. PBS-Tを吸引し、DAPIで封入剤にマウントします。取り付けたプレートは、すぐにイメージングすることも、イメージング前に4°Cで暗所で4日以内保存することもできます。

3. イメージングと定量

1. エピ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡でイメージングを実行します(3Dイメージングが望ましい場合は、15スタックで少なくとも3 μmをカバーします)。3連で実験を実行し、サンプルまたは条件ごとに少なくとも100個の観測を行うのに十分な数のフィールドを画像化します。コントロールを含むすべてのフィールドとサンプルを、同じ露出設定で画像化します。
2. 適切な画像解析ソフトウェアを使用して定量化します(単一または複数の平面画像でこの解析を実行できるオープンソースおよび商用ソフトウェアについては、 部品表 を参照してください)。
   1. DAPI染色に基づいて細胞核をセグメント化します。核PLAドットの検出を実行します。PLAドットを対応する核に割り当てます。核ごとのPLAドットをcsvファイルとしてエクスポートします(補足ファイル1および補足ファイル2を参照)。
3. 統計分析(推奨されるオープンソースおよび商用ソフトウェアについては 、資料表 を参照してください)。
   1. サンプルが正規分布に従うかどうかをシャピロ-ウィルク検定で確認します。
   2. Student-t検定(正規分布の仮定が満たされた場合)またはWilcoxon-Rank Sum検定(サンプルの正規分布の仮定に違反している場合)を使用して、2つのサンプル間に有意差があるかどうかを判断します。
4. データの視覚化:箱ひげ図と組み合わせてドットプロットを生成し、さまざまなサンプルのデータ分布、中央値(Q₂)、25パーセンタイル(Q₁)、および75^パーセンタイルを視覚化します(推奨されるオープンソースおよび商用ソフトウェアについては、資料の表を参照してください)。

4.3D pMCM2の表示:ICL相互作用

1. PLAプレートをスピニングディスク共焦点顕微鏡で、プラン蛍光60倍/1.25開口オイル対物レンズを使用して画像化します。1.6 mmをカバーする16のスタックを取得し、適切な画像解析ソフトウェアを使用して3D再構成を生成します( 材料表を参照)。

レプリソームタンパク質を用いたDig-TMPのPLA
Dig-TMPの構造を図1に示します。トリメチルソラレンをグリコールリンカーを介してジゴキシゲニンに結合させた合成の詳細は、以前に議論されている17,21。細胞を化合物と一緒にインキュベートした後、365 nm光(UVA)に曝露すると、化合物が光活性化され、架橋反応が促進されます。付加物の90%強がICLです16。Digタグは、核全体にICLが存在することを示す免疫蛍光法によって視覚化できます(図2)。MCM2などのレプリソームタンパク質の免疫蛍光も、ICLの導入の影響を受けない分布である核全体の分布を示しています。これらの結果は、DSBに対するDNA損傷応答(DDR)に見られるような応答タンパク質の焦点の出現は、レプリソームの特徴ではないことを示しました:ICL相互作用。

図2に示す実験でレプリソームとICLの相互作用を視覚化するために、2つの抗原の近接性を報告するPLAを適用しました(図3a)。ICL導入後1時間でMCM5とDigタグの会合頻度を測定しました(図3b)。PLAシグナルは、ICLへのレプリソームの近接性を示しました。

ICLによって提示されるものを含む複製ストレスは、ATRキナーゼ22を活性化する。ATRの多くの基質の中には、セリン10823のMCM2を含むMCMタンパク質があります。ICLとのリプリソーム遭遇は、他の多くの基質の中でもMCM2のリン酸化をもたらすと予想されます。この予想に沿って、pMCM2Ser108とDigタグの間のPLAは正でした(図3c)。他の実験では、プラトー周波数が1時間20分に達したことがわかりました。これらの結果は、ゲノム全体にさまざまに位置し、ICLからさまざまに離れたレプリソームが最終的にブロックに遭遇し、ATR活性化とMCM2リン酸化を引き起こすことを示していると解釈しました。

前の図のPLAの結果は、複数の光学プレーンの圧縮された合計として示されています。ただし、個々の核からの結果は、 ビデオ1のpMCM2:Dig-TMP PLAに示すように、3次元再構成で提示することもできます。この解析により、ICLとのリプリソーム遭遇が核全体で観察できることが示された。

レプリケーションフォークの調査では、ICLの遭遇により、予期しないレプリケーション再起動現象16が明らかになりました。機能レプリソームのロックリング構造を考慮すると、ICLとの衝突で複製装置の構成が変化するかどうかを尋ねることは非常に興味深いものでした。複製フォークの10%未満がICLと接触するため、すべてのレプリソームのタンパク質組成をアッセイするだけでは生産的ではありませんでした。ただし、Digとさまざまなコンポーネントの間のPLAにより、この質問に対処することができました。pMCM2の陽性結果とは対照的に、GINS複合体のタンパク質はICLでPLAシグナルを与えることができないことがわかりました。一方、CDC45を用いたアッセイは陽性であり、他のロッキングタンパク質が保持されていたことを示している(図4a、b)。細胞をATR阻害剤と共にインキュベートすると、再起動は完全に抑制され、GINS:Dig PLAは強く陽性であった(図4c)。これらの結果の解釈は、ATR活性がない場合、GINSタンパク質は保持され、CMGヘリカーゼはロックされた構成のままであり、ICL20以降の複製再開はなかったというものでした。

図1:ジゴキシゲニン抗原タグに結合したトリメチルソラレンの構造。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:レプリソームタンパク質MCM5およびDIG TMPの免疫蛍光は、個別の病巣を示さない。 細胞をDig-TMPおよびUVAで処理し、1時間後にMCM5およびDigについて免疫染色した。白いバーは5μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:Dig-TMPとMCM5の間のPLA。 (a)MCM5レプリソームタンパク質とICL上のDigタグとの間の相互作用に適用される近接ライゲーションアッセイの概略図。スキームは単純化されています。実際には一次抗体は、オリゴヌクレオチドに共有結合した二次抗体によって結合した。(b) MCM5とDig-TMPの間のPLA。相互作用の部位を示す離散信号に注意してください。シグナル分布を示すドットプロットとボックスプロット(ドットプロット)、中央値(ボックスプロットの赤いバー)、25パーセンタイルと75パーセンタイル(ボックスエンド)、外れ値を除いた最高値と最低値(極値線)。ウィルコクソン-ランク和検定は、2つの条件の間に有意差があることを確認した(p<0.001)。白いバーは5μmを表す。 (c)pMCM2とDig-TMPの間のPLA。これらのシグナルは、MCM2のATR依存性リン酸化を引き起こすICLとのレプリソームの遭遇を表しています。PLAは、異なるセルにおける遭遇頻度の変動性を報告します。白いバーは5mmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:Dig-TMPとレプリソームロッキングタンパク質との間のPLA。 (a) CDC45: Dig-TMP.白いバーは5μmを表す。 (b) PSF1: Dig-TMP.最小シグナル頻度は、トラバース経路とPSF1を含むGINS複合体の放出をブロックするATR阻害剤による処理によって大幅に増加します。白いバーは5μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ビデオ1:pMCM2の3次元再構成:Dig PLA信号は、核全体の分布を示しています。 PCNAは緑色、PLAは赤色、DAPIは青色で染色されています。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:PLA定量のためのセルプロファイラパイプライン。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:PLA定量のためのIMARISセルモジュールバッチパラメータ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者は開示するものは何もありません。