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方法論記事

マウス上端体脂肪組織からの脂肪前駆細胞の調製

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DOI:

10.3791/61694

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2020年8月25日

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic

この記事について

サマリー

蛍光活性化細胞選別を用いて、マウス上体脂肪パッドから生存性の高い脂肪前駆細胞を単離する簡単な方法を提示する。

要約

肥満および代謝障害(糖尿病、心臓病、癌など)は、すべて劇的な脂肪組織リモデリングに関連している。組織に住む脂肪前駆細胞(APC)は脂肪組織恒常性において重要な役割を果たし、組織病理に寄与し得る。単一細胞RNAシーケンシングや単細胞プロテオミクスを含む単細胞解析技術の使用が増え、集団または組織全体の変化の中で個々の細胞発現変化の前例のない解決を可能にすることで、幹細胞/前駆細胞分野を変革しています。本稿では、マウスの上端体脂肪組織を解剖し、単一の脂肪組織由来細胞を分離し、蛍光活性化細胞選別(FACS)を実行して、実行可能なSca1+/CD31 - /CD45-/Ter119- APCを濃縮するための詳細なプロトコルを提供します。これらのプロトコルにより、研究者は単一細胞RNAシーケンシングなどの下流解析に適した高品質のAPCを準備することができます。

概要

脂肪組織は、エネルギー代謝に重要な役割を果たしています。.過剰なエネルギーは脂質の形で貯蔵され、脂肪組織は栄養状態およびエネルギー需要に応じて有意な膨張または引き込みが可能である。脂肪組織の拡張は、脂肪細胞サイズの増加(肥大)および/または脂肪細胞数の増加(過形成)から生じる可能性があります。後者のプロセスは、脂肪前駆細胞1,2の増殖と分化によって厳しく調節される。肥満の間、脂肪組織は過度に拡大し、低酸素症、炎症、インスリン抵抗性を含む組織機能不全は、しばしば3、4を発症する。これらの合併症は高血圧、糖尿病、心血管疾患、脳卒中、および癌5を含む多くの慢性疾患への危険因子である。したがって、制御されていない脂肪組織の拡張を制限し、脂肪組織の病理を緩和することは、生物医学研究の最優先事項である。脂肪組織の拡張中に、生体脂肪組織由来幹細胞(ASC)は増殖し、順次に前駆細胞(コミット前駆細胞)に増殖し、次いで成熟脂肪細胞に分化する。最近の単細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)研究は、これらの脂肪前駆細胞(APCおよび予後細胞)集団が実質的な分子および機能的ヘテロジニアリティ7、8、9、10、11、12を示していることを示している。例えば、ASCは、減少した有数分化能力を示す一方で、より高い増殖および拡張能力を示す一方で、前置細胞7と比較して。ASCとプリデポサイト集団内でさらなる分子差が報告されるが、これらの違いの機能的関連性は依然として不明である7。これらのデータは、脂肪の前駆細胞プールの複雑さを強調し、これらの重要な細胞集団をよりよく理解し、操作するためのツールを開発し、標準化する必要性を強調しています。

このプロトコルは、単一細胞研究(scRNA-シーケンシング)および細胞培養を含む、敏感な下流分析に適したマウス上端体脂肪パッドからの高生存率Sca1+脂肪前駆細胞集団の分離を詳述する。上端体脂肪パッドの単離および解離は、前述の7,13と同様に、単離されたAPCの生存率を向上させるわずかな改変を伴って行った。簡単に言えば、上端体脂肪パッドからの解離細胞は、Sca1に対する抗体、ASCおよび予読細胞6、7、および他の系統(Lin)マーカーの両方に対する抗体で染色される:Ter119(エリスロイド細胞)、CD31(内皮細胞)、およびCD45(白血球)。生存可能なSca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI-細胞は、蛍光活性化細胞分類(FACS)によってソートされます。重要なことに、このプロトコルは、ASCおよび予後細胞内の機能的に不均一な亜集団を同定した最近の単一細胞RNAシーケンシング研究で報告された、実行可能なSca1+ /Linの脂肪化前駆細胞の分離および分析に成功して検証された。

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プロトコル

すべての動物実験手順は、メイヨークリニックの施設動物ケアおよび使用委員会の承認を得て行われました。

1. ソリューションの準備

  1. コラゲナーゼII 2 gを100 mLハンクスバランス塩溶液(HBSS)に溶解して2%(w/v)溶液を調製します。アリコート 200 μL 各用途に適しています。
  2. 84 mL F-12培地、15 mL馬血清、および1 mLペニシリン/ストレプトマイシンを混合して中和培地を調製します。
  3. 500 mgのウシ血清アルブミン(BSA)と400 μLの0.5 M EDTAをダルベックコのリン酸緩衝生理食塩基(DPBS)の100 mLに溶解してフローサイトメトリーバッファーを調製します。

2. 上端体脂肪パッドの解離と組織解離

  1. 人道的に安楽死させる(イオブルラン/子宮頸部脱臼)1つの雄マウス。このプロトコルでは、4か月のFVBマウスが使用されました。
  2. 腹部に70%エタノールを塗布/スプレーし、きれいなはさみと鉗子を使用して下腹腔を露出させます。
  3. 精巣上体脂肪パッド(近位/精巣に付着)を見つける。精巣と上体脂肪パッドの間の接合部を鈍い鉗子で保持し、優しく引っ張って上体脂肪パッドを解放する。
  4. 5 mL の HBSS ではさみと精巣上体脂肪パッドを使用して切断して精巣を取り除き、50 mL の円錐管で 15 分間の温度で BSA を補います。
  5. 遠心分離機 150 x g で 4 °C で 7 分間
  6. 50 mL円錐管から浮遊精液脂肪パッドを取り、きれいなはさみを使用して組織を細かくミンチ。
  7. 200 μL コラゲナーゼ 2% 溶液を 13 mL の培養チューブで 3.8 mL の HBSS に加えます。ひき肉を加え、37°Cで1時間5rpmで回転インキュベーターにインキュベートします。 回転インキュベーターの代わりに、37°Cでの細胞培養インキュベーターを、時折攪拌して使用することができる。
  8. 内容物全体を50 mL円錐形チューブに移し、10mLの中和媒体を加えます。チューブを2~3回反転して軽く混ぜます。
  9. 70 μmのセルストレーナーを取り付けた別の 50 mL 円錐形チューブを準備します。細胞のストレーナーを使用して、消化された組織を新しいチューブにフィルターします。
  10. フロースルーを15mLの円錐形チューブに移し、遠心分離機を350 x g で4°Cで10分間移動します。
  11. 上清を慎重に取り除き、5 mLのDPBSで細胞ペレットを再懸濁します。遠心分離機 350 x g で 4 °C で 10 分間
  12. 上清を慎重に取り除き、50 μLのフローサイトメトリーバッファーを追加します。穏やかにピペットでよく混ぜ、氷の上に細胞を保ちます。細胞ペレットの体積と残留上清の量が少ないため、フローサイトメトリーバッファー内の細胞の総体積は50μL(約100 μL)を超えます。

抗体標識と蛍光活性化細胞分類(FACS)

  1. 穏やかなピペットで細胞をよく混合した後、細胞懸濁液の54 μLを1.7 mLマイクロ遠心チューブに移します。6 μLのFcRブロッキング試薬を加え、軽くピペットでよく混ぜます。4°Cで10分間インキュベートします。54 μLを取った後に残った細胞を保存し、ステップ3.5およびステップ3.6で未染色コントロールとして使用するために氷の中に保管します。
  2. ステップ3.1のインキュベーション中に、抗Sca1-APC、抗テル119-FITC、抗CD31-FITC、抗CD45-FITC抗体をマイクロ遠心チューブに組み合わせて抗体カクテルを調製します。穏やかなピペットでよく混ぜ、光から保護された氷の上に保ちます。
  3. FcRブロッキング試薬を10分間インキュベートした後、40 μLの抗体カクテルを加え、穏やかなピペットでよく混ぜます。4°Cで10分間インキュベートします。
  4. 染色された細胞に、1 μg/mL の DAPI を加えたフローサイトメトリーバッファーを 500 μL 加えます。セルストレーナースナップキャップを用いた5mL試験管を使用して、穏やかなピペットとフィルターセルでよく混ぜます。細胞を氷の上に置いておきなさい。
  5. ステップ3.1の残りの細胞に500μLのフローサイトメトリーバッファーを加え、穏やかなピペットでよく混ぜます。5 mL の試験管を使用して、セルストレーナー スナップ キャップを使用してセルをフィルター処理します。これらの細胞を氷の上に保管し、次の手順で未染色のコントロールとして使用します。
  6. FACS分析または選別器具に染色された細胞と未染色の制御を取ります。
    1. 図 1に示すギャティング戦略を使用して、APC+/FITC-/DAPI-母集団を特定し、分離します。これらの細胞は、生存可能なSca1+ /Ter119-/CD31- /CD45- 細胞を表す。残骸と細胞の凝集体は、前方(FSC)および側面散布(SSC)プロットを使用して枯渇します。次に、DAPI-母集団がゲートされ、続いてAPC+/FITC-集団のゲーティングが続きます。不染色コントロールは、ギャティングパラメータの設定を支援するために使用する必要があります。
    2. 細胞を1.5 mLマイクロ遠心分離チューブ内のフローサイトメトリーバッファーの500 μLに回収します。今後、汚染を最小限に抑えるために、すべての手順を無菌条件下で行う必要があります。1つのマウスから約50,000~10万個の細胞が採取されます。
  7. 細胞の生存率を評価するために、ヘモサイトメーターを使用して細胞を数える。細胞凝集体はさらなる下流分析を妨げる可能性があるため、細胞凝集体の存在も評価され、これらの凝集体の存在を最小限に抑えます(生存可能な細胞数の5%)。

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結果

この実験では、生後4ヶ月の雄FVBマウスを用いた。FSC/SSCプロットを使用して破片およびダブレットを除外した後、生存可能な細胞(DAPI- 母集団)をゲートし、続いてAPC+/FITC- 母集団の選択を行った(図1)。DAPI、APC、およびFITCのゲートは、未染色の制御に基づいて描かれました。ギャティング戦略を 図 1に示します。

1時間の選別後、分離の質をフローサイトメトリー解析により定量的に評価した(図2、3)。細胞を、生存性染色のためにヨウ化プロピジウム溶液(1:100)で染色した。同じ格子化を使用して、細胞は高い生存率と純度を維持しました:92.6±2.2%単一細胞( 図2の3番目のパネル)、86.4±3.0%生存率(PI- 細胞)、86.0±2.8%APC+...

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ディスカッション

単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)は、単一細胞レベルで多様な細胞集団を同時に研究する強力なツールとして急速に牽引力を得ています。サンプル調製と高スループットシーケンシングに関連するコストが高いため、実験の成功の可能性を高めるためには、細胞入力(高い生存率と純度)を最適化することが不可欠です。一部の細胞調製プロトコルは、FACSソート14を使用せずに、低スピン化しカラムベースの分離を使用して死んだ細胞および破片の除去に依存している。しかし、これらの方法の多くは、生存可能な回収細胞の数を大幅に減少させ、そして多くの場合、死細胞は完全に除去されない14。このプロトコルは、最小限の細胞残骸、細胞ダブレット、および死細胞を含む非常に生存性の高いSca1+脂肪前駆細胞を分離する簡単な方法を概説する。このプロトコルを使用して分離された細胞は高い生存率を示しましたが、高い生存率を維持するために、細胞の単離とさらに下流分析の間の時間を最小限に抑えることをお勧めします。さらに、高純度のSca1+脂肪前駆細胞を

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

我々は、FACS選別の支援のためのメイヨークリニック顕微鏡細胞分析コアフローサイトメトリー施設を認める。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.7 mL 微量遠心チューブVWR87003-294
13 mL 培養チューブサーモフィッシャーサイエンティフィック50-809-216
15 mL コニカルチューブGreiner Bio-one188 271
mL 試験管(セルストレーナースナップキャップ付き) サーモフィッシャーサイエンティフィック08-771-23
50 mL コニカルチューブGreiner Bio-one227 261
70 & マイクロ;m細胞ストレーナーサーモフィッシャーサイエンティフィック22-363-548
抗CD31-FITC抗体Miltenyi Biotec130-102-519
抗CD45-FITC抗体Miltenyi Biotec130-102-491
抗Sca1-APC抗体Miltenyi Biotec130-102-833
抗Ter119-FITC抗体Miltenyi Biotec130-112-908
BSAGold BiotechnologyA-420-500
コラゲナーゼII型Thermo Fisher Scientific17101-015
DAPIThermo FisherD1306
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)Thermo Fisher Scientific14190-144
F-12 mediumThermo Fisher Scientific11765-054
FcRブロッキング試薬Miltenyi Biotec130-092-575
ハンクス平衡塩溶液(HBSS)サーモフィッシャーサイエンティフィック14025-092
馬血清サーモフィッシャーサイエンティフィック16050-122
ペニシリン-ストレプトマイシンサーモフィッシャーサイエンティフィ15140-122
ヨウ化プロピジウム溶液ミルテニーバイオテック〒130-093-233
5 ック

参考文献

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