卵殻を使わない孵化による小可塑性の微生物の発生毒性による鳥胚発生への影響

Summary

本論文では、マイクロプラスチックなどの粒子汚染物質の毒物学的研究に卵殻を用いずに孵化する方法を紹介する。

Abstract

マイクロプラスチックは、動物組織や臓器の取り込みと転座のために動物に大きな健康上の脅威をもたらす新興の世界的な汚染物質タイプです。小プラスチックが鳥の胚の発達に及ぼす生態毒性学的影響は知られていない。鳥の卵は完全な発達と栄養システムであり、胚の発達全体が卵殻で起こります。したがって、マイクロプラスチックなどの汚染物質のストレス下での鳥の胚発生の直接的な記録は、従来の孵化における不透明な卵殻によって非常に制限される。本研究では、マイクロプラスチックがウズラ胚の発達に及ぼす影響を、卵殻を使わずに孵化することによって視覚的に監視した。主なステップは、受精卵の洗浄および消毒、暴露前のインキュベーション、暴露後の短期インキュベーション、およびサンプル抽出を含む。結果は、対照群と比較して、マイクロプラスチック暴露群の湿重量および体長が統計的差を示し、露出群全体の肝臓割合が有意に増加したことを示す。また、温度、湿度、卵の回転角度など、インキュベーションに影響を与える外部要因を評価しました。この実験方法は、マイクロプラスチックの生態毒性学に関する貴重な情報と、胚の発達に及ぼす汚染物質の悪影響を研究する新しい方法を提供する。

Introduction

2015年のプラスチック廃棄物の生産量は約6300山で、その10分の1はリサイクルされ、残りは焼失または地下に埋もれた。2050年までに約12,000山のプラスチック廃棄物が地下に埋もれ、2050^年までに地下に埋もれ、と推定されている。国際社会がプラスチック廃棄物に注目して、トンプソンは2004年2月にマイクロプラスチックの概念を最初に提案^した。マイクロプラスチック(MP)とは、粒子径が5mm未満の小さな粒子プラスチックを指します。現在、研究者たちは、様々な大陸、大西洋諸島、内陸湖、北極、深海の生息地^{3、4、5、6、7}の海岸線におけるMPのユビキタスな存在^を検出^しました。したがって、より多くの研究者がMPの環境上の危険を研究し始めています。

生物は環境中でMPを摂取することができます。世界中の233の海洋生物(100%のカメ種、36%のアザラシ種、59%のクジラ種、59%の海鳥種、92種類の海魚、6種類の無脊椎動物を含む)の消化管でMPが見つかりました^8。さらに、MPは生物の消化器系をブロックし、蓄積し、彼らのボビー⁹に移動する可能性があります。MPは食物連鎖を介して移動することができ、その摂取量は生息地、成長段階、摂食習慣、食料源¹⁰の変化と異なることを発見した。一部の研究者は、海鳥¹¹の滴にMPの存在を報告しました, これは海鳥がMPのキャリアとして機能することを意味します.さらに、MPの摂取は、いくつかの生物の健康に影響を与える可能性があります。例えば、MPは消化管に絡み合い、したがって鯨類¹²の死亡率を増加させることができる。

MPだけでも、他の汚染物質との生物に対する共同毒性効果と同様に、生物に毒性効果があります。プラスチックデブリの環境関連濃度の摂取は、成魚¹³の内分泌系機能を乱す可能性がある。マイクロプラスチックのサイズは、生物による取り込みと蓄積に影響を与える重要な要因^{の1つです 14,15}.小型プラスチック、特にナノサイズのプラスチックは、毒性の高い細胞や生物との相互作用を起こしやすい^16,17^,18,19.ナノ粒子サイズマイクロプラスチックが生物に及ぼす有害な影響は現在の研究レベルを超えていますが、数マイクロメートル未満のマイクロプラスチック、特に環境中のサブミクロン/ナノプラスチックの検出と定量は依然として大きな課題です。さらに、ナノプラスチックは胚にもいくつかの影響を及ぼす。ポリスチレンは、タンパク質および遺伝子プロファイル²⁰を調節することによってウニ胚の発達を損なう可能性がある。

MPが生物に及ぼす潜在的な影響を調べるには、この研究を実施しました。鳥の胚とヒト胚の類似性のために、それらは通常、血管新生および抗血管新生、組織工学、生体材料インプラント、および脳腫瘍22、23、24を含む発生生物学研究²¹で使用される。鳥の胚は、低コスト、短い培養サイクルと簡単な操作^25、26の利点を有する。そこで、今回の実験動物として、短い成長サイクルを有するウズラ胚を選んだ。同時に、卵殻を含まない孵化技術を用いて、胚発生段階でMPに曝露されたウズラ胚の形態学的変化を直接観察することができる。使用した実験材料は、ポリプロピレン(PP)およびポリスチレン(PS)であった。PPおよび^PS27は、世界中の堆積物および水域で得られるポリマータイプの割合が最も高いため、捕獲された海洋生物から抽出される最も一般的なポリマータイプはエチレンおよびプロピレン²⁸である。この実験プロトコルは、MPに曝露されたウズラ胚に対するMPの毒物学的影響を視覚的に評価するための全プロセスを記述する。この方法を簡単に拡張して、他の排卵動物の胚発生に対する他の汚染物質の毒性を調べることができます。

Protocol

1. 暴露前の準備

1. 同じ日に生まれた受精ウズラの卵を選択して、暴露試験を行います。
2. 同じような重みを持つウズラの卵を選択します。各受精ウズラの卵は約10〜12gです。
3. 外的な便および他の破片からすべての受精したウズラの卵を完全にきれいにしなさい。
4. 各孵化前の受精ウズラの卵と使用する卵(同様の殻の形をした卵、特に卵の先端を選ぶ)を抗生物質溶液(ペニシリンとストレプトマイシン、1:1000、室温)で殺菌する。75%エタノールでインキュベーターを殺菌します。
5. 歯のドリルの鈍い端で卵を開き、卵殻を先端に残してさらに使用します。受精卵を移す前に、卵の内容物を注ぎ出します。これは、卵殻の水分を保つためにです。卵の開口径は約3cmであった。
   注:ウズラ胚の損傷を減らすには、歯のドリルを使用して卵の鈍い端を開き、できるだけ亀裂を滑らかにします。
6. 滅菌後、受精したウズラの卵を38°Cインキュベーターに入れ、湿度は60%で24~48時間とします。ウズラの卵の鈍い端が上向きであることを確認してください。
7. 受精したウズラの卵の孵化の間に、殺菌鍋の後続の実験で必要な用具を殺菌する。これらのツールには、ラップ、ビーカー、滅菌水、ピペットチップ、外科用ストレートハサミ、ピンセット、スプーンが含まれます。
   メモ:高温滅菌の問題を回避するために、温度許容度の高いフィルムを使用してください。

2. ウズラの卵を殻なしで孵化させる

1. 孵化前の受精ウズラの卵をインキュベーターからクリーンベンチに移し、容器の上に平らにして約1〜2分間安定させます。
2. ハサミ(12.5 cm外科ストレートハサミ)を使用して、孵化前の受精ウズラの卵の中心軸に小さな穴(直径3mm)を突き刺し、1〜2cmの小さな開口部を切断します。慎重にカット卵殻に受精ウズラの卵子と黄身を転送します。
   注意:小さな開口部をはさみで切るときは、ウズラの卵の黄身に触れないようにしてください。
3. 3つの粒度(100、200、および500 nm)のマイクロプラスチックの異なる質量(0.1、0.2、および0.3 mg)の対照溶液(MPなし)と露出した溶液をピペットで卵の内容物に加えます。同時に、ペニシリン1滴、ストレプトマイシン1滴を1mLシリンジで加えます。
4. 卵殻の開口部を殺菌フィルムで覆う(ステップ1.6)。
5. ステップ2.1-2.4によると、すべての受精ウズラの卵を治療します。
6. 移されたウズラ胚を、必要な期間湿度60%の38°Cインキュベーターに入れる。この実験では、卵の回転角度±30°を使用します。卵を1時間に1回回します。
   注: 転送はできるだけ速くする必要があり、早い段階でより多くの練習が必要です。

3. サンプルコレクション

1. 7日間培養した後、裸眼で観察されたよく発達した胚を黄身から取り出し、リン酸緩衝溶液(PBS)で洗浄する。
2. 洗浄した胚の外に余剰溶液を吸収性紙で乾燥させ、きれいなペトリ皿で重量を量る。
3. 胸腔全体を開き、肝臓と心臓を針鼻ペンチで内臓から分離し、クリアした直後に1.5 mL遠心分離管に入れます。
4. 迅速に電子バランスに体重を記録し、肝体系指数(HIS =肝体重/体重x 100)を計算します。胸骨と体の長さを測定します。
5. 上記の指標に基づいて、胚発生に対するMPの影響を評価する。
   注:ここでの胚の品質は、黄身除去の品質を指します。

4. データ分析

1. 実験データを平均±標準誤差(SEM)の形式で報告する。
2. 分散の単一因子分析を使用して、複数のサンプルグループの平均を比較します。有意差値はα= 0.05であった。

Results

実験データの解析では、湿重量、体長、胸骨長、対照群と6つの実験群との間の肝細胞学的指標の変化を比較し、ウズラ胚の成長と発達をマクロの観点から測定し、反映した。我々は、各群で6つの正常なウズラ胚を検出した。各胚は必要なハンバーガーとハミルトン(HH)の段階に達した。

図1では、孵化前の受精ウズラの卵の内容物を半球卵殻に移し、インキュベーターに入れた。その後、インキュベーションの中間期における胚の発達を3日間記録した。図2に示すように、A-A2は対照群であり、B-B2は1つの治療群である。巨視的な胚の発達の観点から、胚はマイクロプラスチックの悪影響を及ぼさずに正常に発達した。

表1 および 表2 は、1週間の暴露後のウズラ胚の湿重量、体長、胸骨長の平均±SEMである。表は、湿潤重量と体長が異なる露光群で有意に変化することを示す。0.1mg、0.3...

Discussion

本論文は、基礎的な開発指標を検出することによってウズラ胚の発生を評価するための効果的な実験スキームを提供する。しかし、この実験にはまだいくつかの制限があります。

まず、殻のない孵化のために、孵化の後の段階におけるウズラ胚の死亡率が高くなる。実験過程での正常タンパク質比の破壊など、人為的に制御不能な因子があります。実験の正確性を確保するために胚の暴露時間を制限した。胚毒性の研究は、胚発生の初期段階と中間段階でのみ起こり得る。第二に、ウズラ胚発生に関するMPの研究は、基本的な形態学的分析レベルでのみ行われる。したがって、結論は比較的単純であり、欠陥が存在する可能性があります。同時に、実験条件および動作の要件は、この実験の過程で比較的高い。したがって、注目すべき点をいくつか次に示します。

受精したウズラの卵の表面に有害な病原性微生物のために準備作業で受精したウズラの卵を消毒し、滅菌することは非常に重要です。もし、感染した場合、微生物はインキュベーション中に受精したウズラの卵に侵入し、ウズラ胚の死をもたらす。転写が成功しても死亡率は...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
マルチサンプルティッシュグラインダーShanghai	Jingxin Industrial Development Co., Ltd.	Tissuelyser-24	低温で大型プラスチックを小型プラスチックに粉砕
電子天秤	オーハウス株式会社	PRシリーズ 精密
受精ウズラの卵	広州滄武農業開発有限公司		シェルなしの孵化のためのウズラの卵
蛍光ポリプロピレン粒子	佛山Juliang光学材料有限公司		実験のために選択されたプラスチックの種類
インキュベータ	山東、Bangda Incubation Equipment Co.、Ltd.	264 pc	胚の成長と発達のための場所を提供する
ナノメートルスケールのポリスチレン微小球	Xi'瑞渓生物技術有限公司	100 nm、200 nm、500 nm	実験用に選択されたプラスチックの種類
スチール定規	デリ グループ	20 cm	長さの測定に使用  垂直
加熱圧力蒸気滅菌器	上海神南医療機器工場	LDZM-80KCS-II	実験物品を滅菌する