このプロトコルは、自発的な鋭波波リップル活性を示すマウスからの水平海馬内皮質(HEC)スライスの調製を記述する。スライスは、簡略化されたインターフェース保持室でインキュベートされ、記録は、組織の酸素化とネットワークレベルの活動の自発的な出現を促進するために、流れの速い人工脳脊髄液と水没条件下で行われます。
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この記事について
サマリー
要約
急性げっ歯類の脳スライスは、電気生理学、顕微鏡法、薬理学を用いた単細胞分解能を用いた神経回路の組織と機能に関する洞察を得るための、難解な実験的アプローチを提供します。しかし、 インビトロ 実験の設計における大きな考慮事項は、異なるスライス調製物が 、生体内で 観察される神経活動の自然主義的パターンをどの程度再現するかを示す。無傷の脳では、海馬ネットワークは、覚めの完了状態または非レム睡眠中に起こる鋭波波性複合体(SRS)によって例示されるように、動物の行動状態を反映する高度に同期した集団活動を生成する。SRSおよび他の形態のネットワーク活動は、適切な条件下で孤立した海馬スライス中に自発的に出現する可能性がある。強力な脳スライスツールキットを海馬ネットワーク活動の調査に適用するためには、組織の健康と海馬ネットワーク内の機能的な接続性の維持を最適化するアプローチを利用する必要があります。マウスは、経皮的に冷たいショ糖ベースの人工脳脊髄液と浸透する。海馬を含む水平スライスは、シナプス接続性を維持するために450 μmの厚さで切断されます。スライスはインターフェイススタイルのチャンバで回復し、記録のために水没した部屋に移される。記録室はスライスの酸素化を改善するために高流量の人工脳脊髄液の二重表面の重ね合たちのために設計されている。このプロトコルは、複雑で自発的なネットワーク活動の調査に適した健康な組織 をvitroで生成します。
概要
生体外の生きた海馬スライスからの電気生理学的測定は、多くの利点を有する強力な実験的アプローチである。実験者は顕微鏡、マイクロマニピュレーター、および記録システムを使用して、組織内の個々のニューロンから測定値を直接可視化し、収集することができます。組織スライスは光遺伝学的、化学遺伝学的、または薬理学的実験のための光刺激または薬物送達にも非常にアクセス可能である。
海馬ネットワークは、生体内で高度に同期的な集団活動を生成し、細胞外局所的なフィールドポテンシャル1、2、3、4、5の振動として見える。脳スライス法は、これらの神経ネットワーク振動の根底にある細胞および回路メカニズムに関する洞察を得るために活用されてきた。Maierらの基礎的な研究は、鋭波波波紋成(SRS)が腹側海馬6,7のスライスに自発的に出現できることを実証した。複数の研究者からのその後の研究は、海馬
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プロトコル
ここで説明するすべての方法は、コロンビア大学の施設動物のケアと使用委員会によって承認されています (AC-AAAU9451).
1. ソリューションの準備
- 表1に記載されているように、スクロース切断液をスライス用に用意する。
注:1 Lのショ糖溶液を調製した後、少量(約100〜200mL)を氷トレイに凍らせます。これらの冷凍スクロースアイスキューブは氷のスラリーにブレンドされます(ステップ4.3を参照)。 - 表2に記載されているように記録するための人工脳脊髄液(ACSF)を準備する。
- 微量金属やその他の不純物を除去するために濾過された精製水の1 mLにNaClの0.05844 gを溶解することによって刺激ピペットのためのNaClの1 Mを準備する。
注: スクロース切断ソリューションと ACSF は、実験ごとに新しい準備をする必要があります。
2. 寒天ランプを準備する
- 寒天4%(例えば、50mLの水中の寒天の2g)を、微量金属やその他の不純物を除去するために濾過された精製水に寒天粉末を溶解して調製する。沸騰し始めるまで電子レンジで加熱します(約30〜60s)。溶融した寒天をカビに注ぎ、....
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結果
ここでは、このプロトコルで説明したように準備されたHECスライスからの代表的な録音を示します。インターフェース保持室(図1C)での回復後、スライスは水没した記録室に個別に移される(図2B)。記録チャンバには、蠕動ポンプを用いてカルボゲン飽和ACSFが供給される(図2A)。ポンプは最初に保持ビーカーから熱い貯蔵所にACSFを引き出す。カルボーゲンラインは、メディアの連続酸素化を提供するために、保持ビーカーと加熱された貯蔵所の両方に配置されます。一連の空気充填シリンジからなる脈動ダンパーは、蠕動ポンプと記録室の間に位置し、急速な蠕動によって生成される流量の変動を最小限に抑える。各シリンジ中のエアポケットは、ポンプの各サイクルによって引き起こされる圧力の変化を吸収し、記録チャンバーがACSF52,53のスムーズで一貫した流れを受け取るようにする。脈動.......
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ディスカッション
組織の健康を促進し、自発的な自然主義的なネットワーク活動の出現を支持するように設計されたこのスライスプロトコルにはいくつかのステップがあります:マウスは、チルドショ糖切断溶液で経皮的に浸透しています。水平内膜皮質(HEC)スライスは、中間または腹側海馬から450μmの厚さで切断されます。スライスは、温めたACSFのインターフェースで回復し、加湿された、カルボゲンが豊富な空気。録音中にスライスは32 °Cに温められたACSFと過重され、水没した記録室の二重表面のスーパーフュージョンとの速い流量で提供される。
スライスの健康は、インビトロでのネットワーク振動の生成にとって最も重要です。若い動物はより健康的なスライスを生み出し、一般的に若年性マウスまたは思春期のマウスでは、心筋灌流ステップをスキップすることができる。動物が老化するにつれて、健康的なスライスを作ることはますます困難になりますが、一部の調査(疾患モデルや縦断研究など)は、成人または老化した動物の使用を必要とします。例えば、ピロカルピン処理慢性てんかん成体マウス50
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開示事項
著者は開示するものは何もない。
謝辞
著者はスティーブ・ジーゲルバウムのサポートに感謝したいと思います。資金は5R01NS106983-02と1 F31 NS113466-01によって提供されます。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3Dプリンター | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| 急性脳スライスインキュベーションホルダー | NIH 3Dプリント交換 | 3DPX-001623 | ChiaMing Leeによって設計され、https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosine 5′-三リン酸マグネシウム塩 | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl 粉砕ペレット | ワーナー | 64-1309, (E205) | |
| 寒天 | クトン、ディキンソン | 214530-500g | |
| アスコルビン酸 | アルファエー | ザー36237 | |
| ビーカー(250 mL) | キマックス | 14000-250 | |
| ビーカー(400 mL) | キマックス | 14000-400 | |
| バイオシチン | シグマアルドリッチ | B4261 | |
| ブレンダー | オ | スターBRLY07-B00-NP0 | |
| ボンはさみ、小さな | ベクトン、ディキンソン | 14184-09 | |
| フィラメント(外径1.5 mm、内径0.86 mm、長さ10 cm)とホウケイ酸ガラス毛細管(外径1.5 mm、内径0.86 mm、長さ10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | ファイヤーポリッシュキャピラリーが好ましいです。 |
| 塩化カルシウム溶液 (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| カメラ | オリンパス | OLY-150 | |
| 圧縮カルボゲンガス (95% 酸素 / 5% 二酸化炭素) | エアガス | X02OX95C2003102 | |
| 圧縮酸素 | エアガス | OX 200 | |
| 定電圧絶縁刺激装置 | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| coverslips (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| シアノアクリレート接着剤 | Krazy Glue | KG925 | のブラシオンフォームを使用してください |
| 同等のソフトウェア(pClampなど)が機能します。 | |||
| Dell Precision T1500 Tower Workstation デスクトップ | Dell | N/A | カタログ番号は、特定のコンピュータによって異なります。電気生理学取得ソフトウェアを実行できる限り、どのコンピュータでも動作します。 |
| Digidata 1440A | 分子デバイス | 1-2950-0367 | |
| デジタル タイマー | VWR | 62344-641 | 4 チャンネル トレーサブル タイマー |
| 使い捨て吸収剤パッド | VWR | 56616-018 | |
| 解剖ハサミ | ファイン サイエンス ツール | 14082-09 | |
| 両刃 カミソリの刃 | Personna | BP9020 | |
| デュアル オートマチック温度コントローラー | ワーナー・インスツルメント・コーポレーション | TC-344B | |
| 二重表面または層流最適化記録チャンバー | N/A | N/A | このプロトコルで提示されるチャンバーはカスタムメイドです。商用の同等品は、ワーナーインストゥルメンツのRC-27Lです。 |
| 機器ラック | Automate Scientific | FR-EQ70 " | ラックは厳密には必要ではありませんが、電気生理学を整理するのに役立ちます |
| エチレングリコール-ビス(2-アミノエチエーテル) - N、N、N'、N'-teetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| 濾紙 | Whatman | 1004 070 | |
| 細かいスケール | メトラー・トレド | XS204DR | |
| フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー | Sutter Instruments | P-97 | |
| ガラスシャーレ (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| ice buckets | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| イソフルラン気化器 | 一般麻酔サービス | Tec 3 | |
| ラボ テープ | フィッシャー サイエンティフィック | 15-901-10R | |
| レンズ ペーパー | フィッシャー サイエンティフィック | 11-996 | |
| 光源 | オリンパス | TH4-100 | |
| 塩化マグネシウム溶液 (1 M) | 品質 生物学的 | 351-033-721EA | |
| 磁気攪拌子 | フィッシャーサイエンティフィック | 14-513-56 | カタログ番号は、攪拌子のサイズによって異なります。 |
| マイクロマニピュレーター | Luigs &ノイマン | SM-5 | |
| マイクロマニピュレーター (手動) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| 顕微鏡 | オリンパス | BX51WI | |
| マイクロスパチュラ | ファインサイエンスツール | 10089-11 | |
| モニター | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B マイクロ電極増幅器 | 分子デバイス | MULTICLAMP 700B | MultiClamp 700Bには、ヘッドステージ、ピペットホルダー、モデルセルが含まれている必要があります。 |
| N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N′-(2-エタンスルホン酸)、(HEPES) | シグマアルドリッチ | H3375-25G | |
| 針(20ゲージ、長さ1.5) | ベクトン、ディキンソン | 305176 | |
| ナイロンフィラメント | YLIワンダーインビジブルスレッド | 212-15-004 | サイズ0.004。この猫。#は Amazon.com |
| ナイロンメッシュ | ワーナーインスツルメンツコーポレーション | 64-0198 | |
| パースタルティックポンプ | ハーバード装置 | 70-2027 | |
| ホスホクレアチンジ(トリス)塩 | シグマアルドリッチ | P1937-1G | |
| ピペットホルダー | 分子デバイス | 1-HL-U | |
| プラチナ線 | ワールドプレシジョン | PT0203 | |
| ポリ乳酸(PLA)フィラメント | Ultimaker | RAL 9010 | |
| 塩化カリウム | グマアルドリッチ | P3911-500G | |
| グルコン酸カリウム | シグマアルドリッチ | 1550001-200MG | |
| 水酸化カリウム | シグマアルドリッチ | 60377-1KG | |
| カミソリ刃 | VWR55411-050 | ||
| ローラークランプ | ワールド精密機器 | 14041 | |
| スケール | メトラー・トレド | PM2000 | |
| メスハンドル | ファインサイエンスツール | 10004-13 | |
| スライスハープ | ワーナー | SHD-26GH/2 | |
| 重曹 | フィッシャーケミカル | S233-500 | |
| 塩化ナトリウム | シグマ アルドリッチ | S9888-1KG | |
| リン酸ナトリウム一塩基性無水 | フィッシャーケミカル | S369-500 | |
| ビン酸ナトリウム | フィッシャーケミカル | BP356-100 | |
| ヘラ | VWR | 82027-520 | |
| ラ/スプーン、大型 | VWR | 470149-442 | |
| メスブレードフェ | ザー72044-10 | ||
| ラー/ホットプレート | コーニング | 6795-220 | |
| ストップコックバルブ、1ウェイ | ワールドプレシジョンインスツルメンツ | 14054 | |
| ストップコックバルブ、3ウェイ | ワールドプレシジョンインスツルメンツ | 14036 | |
| スクロー | アクロスオーガニックス | ||
| スイベルクランプのサポートフィ | ッシャーサイエンティフィック | 14-679Q | |
| 手術用ハサミ、シャープ/ブラント | ファインサイエンスツール | 14001-12 | |
| シリンジ (1 mL) | Becton, Dickinson 309659 | ||
| シリンジ (60 mL Luer-Lokチップ付き) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| 3 ピンクランプ | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| 組織鉗子、大型 | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| 組織鉗子、小型 | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| 移送用ピペット | フィッシャーサイエンティフィック | 13-711-7M | |
| チューブ | タイゴン | E-3603 | ID 1/16 インチ, 外径 3/16 インチ |
| チューブ | タイゴン | R-3603 | ID 1/8 インチ, 外径 1/4 インチ |
| 真空グリース | ダウ コーニング | 14-635-5D | |
| 振動ブレード ミクロトーム | ライカ | VT 1200S | |
| ファラデーケージ付き振動減衰テーブル | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| 容積フラスコ (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| 容積フラスコ (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| 温水バス | VWR | 1209 |
参考文献
- Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
- Buzsáki, G.....
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