サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング

Summary

光シートベースの蛍光顕微鏡は、発生生物学において最も価値のあるツールです。比較研究の大きな問題は、周囲分散です。我々のプロトコルは、複数の標本の同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを記述し、したがって、この問題に積極的に取り組む。

Abstract

ライトシートベースの蛍光顕微鏡は、複数の生物学的に関連するスケールで複雑なプロセスを研究するための効率的なソリューションを提供します。試料の三次元の完全性を維持するためにとりわけ設計され、通常サンプルの回転を特色にするサンプル室ベースのセットアップは、発生生物学の最良の選択である。例えば、それらは、ショ ウジョウバエメラノガスター および赤い小麦粉カブトムシ トリボリウムカスタネウムの果実フライの胚形態形成全体を文書化するために使用されてきた。しかし、利用可能なライブイメージングプロトコルの多くは、単一胚の実験的枠組みのみを提供します。特に比較研究では、このようなアプローチは、順次画像化された標本が周囲分散の影響を受けるため、不便である。さらに、これにより、所定の時間内にアッセイできる検体の数が制限されます。我々は、同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを提供し、サンプル室ベースのセットアップのスループットを向上させ、すべての標本に対して同様の周囲条件を保証します。まず、光シート蛍光顕微鏡の校正ガイドラインを提供します。第2に、試料回転に適合する複数の胚の実装方法を提案する。第三に、ショ ウジョウバエの典型的な3次元ライブイメージングデータセットを提供し、蛍光標識核と3つのトランスジェニックラインと Triboliumを並置し、同じ遺伝子を運ぶ3つのトランスジェニックサブラインの性能を比較しますが、ゲノムの異なる場所で比較します。私たちのプロトコルは、連続ライブイメージングで常に存在する周囲分散に積極的に対処するため、比較研究のために特別に設計されています。これは、ノックアウト実験などから生じる非収量性の型の定量的分析と特徴付けに特に重要です。また、全体的なスループットが向上し、蛍光顕微鏡の光シートへのアクセスが制限される場合に非常に便利である。最後に、提案された取り付け方法は、他の昆虫種およびさらなるモデル生物、例えばゼブラフィッシュに対して、基本的に最適化努力を伴わない適応することができる。

Introduction

蛍光顕微鏡は、生命科学、特に細胞生物学および発生生物学において最も重要なイメージング技術の1つです。共焦点蛍光顕微鏡¹では、1990年代半ば以降の3次元蛍光イメージングの最先端のものであり、同じレンズが蛍光色素励起および発光光検出に使用されている。照明レーザービームは、照明/検出軸に沿ってすべての蛍光を励起し、それぞれの焦点外信号はピンホールによって検出される前に識別されます。したがって、各2次元画像について、全体の標本が照らされます。その結果、各3次元画像、すなわち、空間的に連続した2次元画像の積層に対して、検体全体が数十〜数百倍²回照らされ、光漂白および光毒性を促進する^3。

約20年前、光シートベースの技術⁴ は、3次元蛍光イメージングの有望な代替手段として登場し、発生生物学⁵において貴重なツールとなりました。このアプローチでは、照明と検出が分離されます。照明レンズは、垂直に配置された検出レンズの焦点面内に数マイクロメートルの深さの光シートを生成するために使用される。したがって、2 次元イメージごとに、焦点面の周りの薄い平面ボリュームのみが照らされます。その結果、各3次元画像について、検体全体が一度だけ照射され、光漂白と光毒性

Protocol

1. 準備作業

1. 科学的な質問に合ったLSFM用の照明レンズ/検出レンズ/カメラの組み合わせを選択し、顕微鏡を設定します。視野の大きさは、カメラチップサイズの商と検出レンズの倍率です。照明レンズは、視野全体が平面ライトシート³⁴で覆われるように選択されるべきである。3 つの推奨される組み合わせを 表 1に示します。
2. アガロースアリコートと検索皿を調製するには、200mLオートクレーブ水道水に2gの低溶融アガロースを加え、すべてのアガロース粒子が溶解するまで600〜800 Wの電子レンジで混合物を加熱します。1.5 mL または 2 mL 反応チューブに 1 mL アガロースアリコートを用意し、高さ 3~5 mm の高い 90 mm の Ø ペトリ料理をアガロースで満たします。固めたアリコートと料理を4°Cで保管してください。
3. ショウジョウバエの場合:新鮮な飼育バイアルを準備するには、十分な量のカスタムメイドまたは市販のショウジョウバエ培地を調理し、5〜15mLを広いバイアルに移し、4°Cで保管してください。 産卵皿を準備するには、低融解アガロース1gを50mLのオートクレーブ水道水に加え、すべてのアガロース粒子が溶解するまで600-800 Wの電子レンジで混合物を加熱します。混合物を45°Cまで冷やし、50 mLフルーツジュース(好ましくはリンゴまたは赤ブド....

Results

我々のプロトコルは、サンプルチャンバーベースのLSCMにおける比較蛍光ライブイメージングのための実験的枠組みについて説明する。例えば、フレームワークは、2種以上の(i)胚、(ii)1つ以上の遺伝子がノックアウトされるラインの胚と野生型コントロール、(iii)同じトランスジェニックラインの複数の胚、(iv)異なるトランスジェニックラインからの複数の胚、または(v)同じトランスジーンを運ぶサブラインからの胚を並置するために使用することができるが、異なるゲノムの場所で。このセクションでは、最後の 2 つのシナリオの例を示します。

我々の最初の例示的な適用では、我々は、異なるトランスジェニックショウジョウバエラインに由来する3つの胚の蛍光シグナルダイナミクスを示す(表2)約1日間にわたって(図4、補足ムービー1)。これらのラインについては、おそらくユビキタスで構成的に活性なプロモーターの制御下で核に局在するEGFP/GFPを発現するため、かなり似.......

Discussion

LSFの排他的な応用分野の1つは、発生生物学です。この分野では、生きた標本を見ることは重要であり、そうでなければ形態形成プロセスは動的に記述することはできません。ここで説明するサンプルチャンバベースのLSFMにおける同時ライブイメージングの実験的フレームワークは、2つの大きな理由から便利である。

連続ライブイメージングでは避けられない周囲分散は、積極的に対処することができます。昆虫胚関連の生画像では、例えば、次の感受性が見られます。卵の採取培養物は、胚採取時に異なる年齢を有し得る。 ショウジョウバエでは、これが子孫⁴⁵の性質に影響を与えることを示している。適切に非同期化されたカルチャを使用することもできますが、同期カルチャとの同時イメージングの方が便利です。 ショウジョウバエと トリボリウムベースの代表的な結果は、両方とも同期した卵の採取培養に由来し、異なる蛍光特性が親の老化の意図しない効果であることを確信して排除することができます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6ウェルプレート	Orange Scientific	4430500
24ウェルプレート	Orange Scientific	4430300	Tribolium
>35-mmとOslashを含むライブイメージングのみ。ペトリ皿	フィッシャーサイエンティフィ	153066	Drosophilaを含むライブイメージング専用。
90 mm&オスラッシュ;ペトリ皿	フィッシャーサイエンティフィック	L9004575
100 & マイクロ;mメッシュサイズセルストレーナーBD	Biosciences	352360
250 µmメッシュサイズふるい	VWRインターナショナル	200.025.222-038	Tribolium
300µを含むライブイメージングのみ;mメッシュサイズふるい	VWRインターナショナル	200.025.222-040	Tribolium
710µを含むライブイメージングのみ;mメッシュサイズふるい	VWRインターナショナル	200.025.222-050	Tribolium
800µを含むライブイメージングのみ。mメッシュサイズふるい	VWRインターナショナル	200.025.222-051	Tribolium
>405細かい小麦粉	Demeter e.V.	SP061006	Tribolium
>市販のショウジョウバエ培地	Genesee Scientific	66-115	Drosophila / カスタムメイドのDrosophilaを含むライブイメージングのみ、
蛍光マイクロスフェア、1.0 & マイクロ;メートル&オスラッシュ;	サーモフィッシャーサイエンティフィック	T7282
不活性ドライイースト	ジェネシーサイエンティフィック	62-108
低融点アガロー	カールロス	6351.2
ナローバイアル	ジェネシーサイエンティフィック	32-109	ショウジョウバエ
小さなペイントブラシ	VWR International	149-2121
を含むライブイメージングのみ次亜塩素酸ナトリウム(NaOCl)、~12%活性Cl	ロス	9062.3	注意:次亜塩素酸ナトリウムは腐食性
全粒小麦粉	ですデメテルe.V.	SP061036	Tribolium / 英国: 全粒粉
ワイドバイアル	ジェネシー サイエンティフィ	32-110	ショウジョウバエ