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方法論記事

ミツバチの経口感染のためのウイルス富化接種剤の調製(Apis mellifera)

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DOI:

10.3791/61725

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2020年8月26日

 ,  , 
1Department of Entomology, University of Illinois, 2Department of Microbiology, Center for Scientific Research and Higher Education of Ensenada (CICESE)

この記事について

サマリー

ここでは、ミツバチの蛹を除去する方法を含む大量のミツバチ非エンベロープウイルス粒子を伝播、抽出、精製、定量すること、および2番目の2つのプロトコルについて説明します。

要約

ミツバチは世界中で生態学的および農業的に非常に重要ですが、ウイルス病原体への曝露を含むミツバチの健康に悪影響を及ぼすさまざまな圧力にもさらされています。このようなウイルスは、多種多様な壊滅的な影響を引き起こす可能性があり、実験的治療の効果を既存の背景感染から分離することを困難にする複数の要因のために、研究が困難な場合が多い。ここでは、大量のウイルス粒子を大量生産する方法と、ウイルス感染と効果をテストするためのハイスループットバイオアッセイを紹介します。連続したウイルスのないミツバチ細胞株の現在の欠如によって必要とされる、ウイルス粒子は、最小限のストレスの方法論を用いて巣箱から大量に抽出されるミツバチの蛹を用いて 生体内で 増幅される。これらのウイルス粒子は、その後、ミツバチケージバイオアッセイで、接種剤の生存率、ならびに栄養、農薬、および他の病原体との相互作用を含む様々な他のウイルス感染動態を試験することができる。このような粒子を使用する主な利点は、感染したミツバチの血リンパ液やホモジネートを介した感染などの現在の代替手段と比較して、その後の実験で未知の変数を導入する可能性を大幅に減らすことですが、バックグラウンドウイルス汚染を最小限に抑えるために、ミツバチを調達する際には注意が必要です。ケージアッセイは、コロニーレベルでウイルス感染効果をテストする大規模でフィールド現実的な実験に代わるものではなく、代わりに、半純粋なウイルス粒子と組み合わせて、ミツバチとウイルスの生理学的相互作用の様々な次元を調べるための重要なツールとして役立つベースラインウイルス応答を確立する方法として機能する。

概要

ミツバチ(Apis mellifera)は、現代の世界の農業景観において重要な役割を果たしていますが、現在、農薬曝露、飼料不足、寄生虫、病原体など、生物的および非生物的ストレッサーの組み合わせに苦しんでいます1,2。懸念される最も重要な病原体の1つはウイルスであり、その多くは別の主要なミツバチストレッサーである寄生性Varroaダニ(Varroa destructor)によってベクター化されています。これらのウイルスは、繁殖期の生存率の低下、発達上の欠陥、および越冬期間の前後に完全な巣箱の崩壊につながる可能性のある麻痺を含む、ミツバチに一連の悪影響を引き起こす可能性があります3,4,5。ウイルス感染と戦うために使用される技術の開発には有望な進歩がありましたが、6,7,8,9、多くのウイルスがミツバチやコロニー内で伝播、拡散、相互作用するダイナミクスはまだよく理解されていません5,10.ミツバチとウイルスの相互作用の基本的な生物学と他の環境要因との関係を理解することは、効果的なウイルス管理技術を開発するために不可欠です。

しかし、ミツバチとウイルスの相互作用を研究することは、プロセスを複雑にする多数の既知および未知の要因を伴う課題を提起する。これらには、食事11,12との相互作用、農薬曝露13、およびミツバチの遺伝的背景14,15が含まれる。ウイルス感染のみに焦点を当てた場合でも、ミツバチの個体群(管理されたミツバチと野生の両方)は、急性症状を示さないことが多いが、常にある程度の背景ウイルス感染を有するため、合併症は一般的である16,17、ウイルス共感染の影響はよく理解されていない18。これにより、ミツバチウイルスの影響の研究を解きほぐすことが難しくなっています。

多くのミツバチウイルス研究は、状況ウイルス感染を使用して他のストレッサーとの相互作用を探し、バックグラウンド感染が他の治療法とどのように変化するかを観察しています12,19,20,21。このアプローチは、重要な効果の同定、特に農薬や食事療法がウイルスのレベルと複製にどのように影響するかを発見することに成功していますが、既知の含有量と濃度のウイルス治療を接種することは、ウイルス感染ダイナミクスの実験的試験にとって重要です。それでも、実験的治療をバックグラウンド感染から分離することも課題を引き起こす可能性があります。フィールド研究では、研究者はミツバチからマルハナバチへのウイルス感染の証拠を提供するために、変形した翼ウイルス(DWV)の株を分化させました22が、このアプローチを使用することはミツバチだけでは困難です。ウイルス感染性クローンは、感染の追跡23,24,25だけでなく、ミツバチウイルスの逆遺伝学研究やウイルス宿主相互作用研究26,27,28のための強力なツールです。しかし、ほとんどの場合、感染性クローンは、粒子を生成するために細胞内の感染サイクルを満たすために依然として必要とされる。このような粒子は、その感染力が裸のウイルスRNAよりも高く、かつ、キャプシドゲノムによる接種が自然感染を模倣するため、実験的処置のための接種剤として好ましい。

純粋で汚染されていないミツバチウイルス接種剤(野生型ウイルス株または感染性クローンに由来するもの)の生産も課題を提起する。これらは主に、純粋株ウイルス29,30を産生するための信頼性が高く、連続的に複製され、ウイルスを含まないミツバチ細胞株を得ることの困難さによるものである。いくつかの細胞株が産生されているが、これらのシステムは不完全なままである。それでも、生存可能な細胞株29を生産できるという希望があり、ウイルス産生と調査をより細かく制御できるようになるでしょう。このようなラインが広く利用可能になるまで、ほとんどのウイルス産生プロトコルは、インビボウイルス産生および精製の使用に依存し続けるであろう18、31、32、33、34。これらのアプローチには、目的のウイルス粒子を同定して精製すること(または感染性クローンを産生すること)と、それらを使用してミツバチ(通常は蛹として)に感染することが含まれる。蛹に標的ウイルスを注射し、次いで屠殺し、さらに粒子を抽出および精製する。しかし、そもそもウイルスのないミツバチはいないため、そのような濃縮物には他のウイルスの痕跡から常にある程度の汚染があるため、バックグラウンド感染の可能性が低いミツバチを選択する際には細心の注意を払わなければなりません。さらに、これらのプロトコル33で使用するための櫛細胞から蛹を除去するための方法は、非常に労働集約的であり、ミツバチにストレスを誘発することができ、これらの手段18、32によって産生を制限する。ここでは、ミツバチへの労力と機械的ストレスを少なくして幼虫を大規模に除去できる代替方法を報告する。

蛹が得られ、開始ウイルス接種剤を注射したら、ウイルスが複製する時間を提供するためにインキュベートされなければならない。その後、産生されたウイルス粒子は、実験ミツバチに感染するのに使用可能な形態に加工することができる。これを達成するためのいくつかの簡単な方法があり、感染源37としてウイルス感染したミツバチから生成された粗ホモジネート35、36または血リンパ液を使用することを含む。これらの方法は有効であるが、バックグラウンド基板から未知の変数(例えば、死んだミツバチホモジネート中の他の因子)を導入する可能性が高くなる。さらに、実験で大量の既知の用量のウイルスを短時間で与える必要がある場合は、粒子を濃縮することが望ましい。したがって、より良好な制御のために、ウイルス粒子のある程度の精製および濃縮を可能にする方法を使用することが好ましい。一般に、一連の沈殿および遠心分離ステップは、ほとんどすべての可能な非標的ウイルス材料33の除去をもたらすであろう。

この濃縮接種剤を製造した後、ウイルス力価(qPCR)を定量し、in vivoバイオアッセイでそれを特徴付けて、その生存率および死亡率を引き起こす能力をテストし、感染後に増加したウイルス力価が得られることを裏付けることが有益である。これは、注射実験(蛹または成虫のいずれか)または摂食実験(幼虫または成虫への)によって達成することができる。これらのアプローチはすべて可能ですが、ケージ内の成虫ミツバチのグループに餌をやることは、しばしば最速かつ最も簡単です。ケージアッセイ法は、農薬毒性38、卵巣発生39、および行動に対する栄養的影響40,41を含むミツバチに対する様々な他の治療法の試験にも広く使用されており、したがって、ウイルス感染を他の因子42と結びつける実験のための良好な基礎を形成することができる。

ここでは、ミツバチの労力と機械的ストレスを軽減する蛹を除去する方法や、ウイルス感染と影響をテストするための再現性の高いハイスループットバイオアッセイなど、高価な超遠心分離機を使用せずに大量の半純粋で高濃縮のウイルス粒子を製造するための信頼性の高い方法について説明します。ウイルス接種剤の純度を厳密に制御することにより、研究者は他のウイルス接種方法と比較してミツバチウイルス応答の変動を低減することができる。さらに、バイオアッセイは、現場で現実的な設定にスケーリングする前に、再現性の高い実験ユニットを使用して小グループレベルでウイルス効果をスクリーニングすることができ、これは管理にはるかに労力がかかります。これら2つの方法を組み合わせることで、ミツバチとウイルスの生理学的相互作用の全体的な理解を深めるのに役立つ研究に必要なツールを提供します。

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プロトコル

1.ミツバチの大量抽出オプション1:幼虫の自己除去

  1. ミツバチの女王を空っぽのラングストロスのフレームに檻に入れ、コロニーに戻す。女王がこのフレームに24時間卵を産むのを許してください。
    1. 24時間後にフレームをチェックして、ほとんどの櫛細胞に新しく産まれた卵が含まれていることを確認してください。女王とコロニーによっては、卵は最初の24時間であまりうまく産まれないことがあります。このような場合は、さらに 24 時間待ってから、必要に応じて時間を調整します。
  2. 24時間の産卵期間の後、女王を解放します。フレームにはっきりとマークを付け、コロニーに戻します。
  3. 女王をケージに入れてから正確に192時間(8日)後(最初の24時間以内に通常の産卵を仮定し、8日が蛹化の直前のポイントをマークします)、コロニーからマークされたフレームを削除します。すべての成虫ミツバチをはがし、ハイブの内部条件(34°C、相対湿度50%(RH))に合ったインキュベーターにフレームを移します。
    1. フレームの大部分が5番目の 齢幼虫で満たされていることを確認し、櫛細胞の下端にしっかりと押し付けられた大きな白いc字型の体によって認識することができます。また、特にフレームの中央付近に、ワックスキャッピングで既に覆われているセルがいくつかある可能性があります。
  4. 幼虫充填フレームの高さと幅に合った容器を準備し、石鹸と水で内面と外面を徹底的に洗浄し、続いて漂白剤溶液、最後にエタノールで5齢 幼虫を受け入れる。先に進む前に容器を徹底的に乾かしてください。
    1. 容器の底にペーパータオルを何枚か敷きます。次に、より薄くて吸収性のクリーニングワイプ(繊細なタスクワイパーなど)またはろ紙の重なり合う層をいくつか追加します。材料は吸収性でなければなりません。将来の幼虫の移動の容易さを改善するために、最上層が重ならないようにする。
  5. 幼虫が洗浄ワイプの層に落ちることができるように、容器の上にフレームを裏返して(焦点幼虫を下向きにして)置く。
    1. 容器とフレームをテント付きのアルミホイルまたは他のカバーで覆い、水分を保持し、セットアップをインキュベーターに戻します。セットアップは一晩放置してください。幼虫の自然な食物を求める傾向は、それらが彼らの細胞から這い上がり、下のパッド入りの表面に落ちる原因となります。
  6. 1.4で詳述されているのと同じ手順を使用して、それらを徹底的にクリーニングして、別々の転写トレイを準備します。トレイを乾かし、底面をクリーニングワイプで重ねます。トレイは特定の寸法と一致する必要はありませんが、より浅いトレイは幼虫の操作を容易にします。
    1. 容器の最上層から個々のワイプを慎重に持ち上げ、幼虫をトレイに静かに注ぐことによって、幼虫を容器からトレイに移し始める。幼虫は一晩で容器に落ち、いくつかの粘着性のある塊を形成したはずです(図1A)。
    2. 鈍い柔らかい鉗子を使用して幼虫を分離し、トレイの表面全体に配置します。それらは等間隔である必要はなく、互いに近接することができますが、触れるべきではありません。分離された幼虫の視覚的描写については 、図1B を参照されたい。
    3. この機会に、損傷した(変色した)または平均サイズ以下の幼虫を除去してください。これらは成熟プロセス中に死亡する可能性が高く、トレイ全体に感染/真菌の成長をもたらす可能性があります。
  7. トレイをテント張りのアルミホイルで覆い、水分を保持し、セットアップをインキュベーターに戻します。
  8. 幼虫を毎日チェックし、変色しているもの(濃い茶色または黒色)を取り除きます。
    注:幼虫/蛹前はクリーニングワイプに排便し、小さな茶色の斑点として現れます。彼らはまた、キャッピングプロセスの一環として、少量の白く、ふさふさしたウェビングを生成することがあります。これらの発生のどちらも、吸収性である限り、クリーニングワイプの交換を必要としません。
  9. 幼虫が蛹化し、白目段階に成熟するのを許し、それは彼らの目と彼らの体の他のほとんどに色素沈着を欠いている間、成虫の蜂のそれと一致する彼らの一般的な形によって識別することができます。これは、女王のケージの14〜15日後に起こるはずです。蛹はウイルス注射の準備が整いました。 図1C、白 目蛹の例についての1D。

2.ミツバチの大量抽出オプション2:手動蛹切除

注:オプション2(蛹切除)はミツバチの抽出の実行可能な方法ですが、オプション1(幼虫の自己除去)と比較するといくつかの欠点もあります。オプション2ははるかに労働集約的で、蛹の年齢のために制御するのが難しく、そして一般的にミツバチ自身にとってよりストレスがかかります。可能な限り、オプション 1 をお勧めします。

  1. 適切なコロニーから、白目段階またはその近くで蛹を含む帽子をかぶったミツバチの群れのフレーム(説明については1.9を参照)を選択します。フレームの中心と縁の近くにある櫛歯細胞からキャッピングを外して、適切な発達段階の存在を確認します。
  2. フレームを34°C、相対湿度50%に設定したインキュベーターに移す。すぐに使用しないときは、必ずフレームをインキュベーターに戻してください。
  3. 1.6で説明したものと同じ転写トレイを準備して清掃します。
  4. インキュベーターからフレームを取り外し、光源の下の斜めのスタンドに置きます。ペーパータオルの小さな山を水で湿らせます。
  5. エタノールを使用して鈍い硬い鉗子のペアをきれいにする。きれいな鉗子を使用して、白目の蛹を含む細胞からキャッピングを取り除き、その過程で蛹を傷つけないように注意してください。
  6. 一つずつ、櫛細胞から蛹を静かに切り取ります。十分なスペースがある場合は、鉗子の先端を使用して胸部と腹部の周りの蛹をつかむのが最も安全です。しかし、そうでない場合は、蛹は頭をつかみ、ゆっくりと体の周りをつかむのに十分な距離まで揺らすことによっても取り除くことができます。
    1. すぐには手が届かないフレームの部分を濡れたペーパータオルで覆い、湿気を保ちます。切除プロセス中に必要に応じて取り外して交換してください。
  7. 切り取った蛹をクリーニングワイプに沿って転写トレイに置き、触れていないことを確認します。変貌または変色した蛹は捨てるべきです。蛹は今、ウイルス注射の準備ができています。
    1. ワイプと接触すると液体を放出する蛹を捨てる。彼らはおそらく穴があいているでしょう。時々、蛹は除去後1時間以内に鉗子との接触点の近くにメラニン化の小さな暗い斑点を示す。これは生存に影響を与えないはずです。メラニン化の大きなパッチが現れた場合は、罹患した蛹を捨てるべきです。

3. 蛹ウイルス注射

注:このプロトコールを初めて行う場合(すなわち、事前のウイルス接種ストックを使用せずに)、まず、感染が疑われるコロニーから成虫、蛹、または幼虫を用いて粒子を抽出および濃縮する。ステップ5で説明したように、得られた接種物中のウイルス力価を測定し、どの粒子をさらに増殖させるかを決定する。

  1. ミツバチウイルスで作業を開始する前に、漂白剤水とエタノールを使用してすべての作業面を滅菌してください。ニトリル手袋は、プロセス全体を通して着用する必要があります。
  2. 〜1μL量の流体を注入することができるインジェクタ装置を調製する。
    注:安価でありながら効果的なアプローチの1つは、柔軟なエポキシまたは他の液体接着剤を使用して、100μLのマルチディスペンサーチップ( 材料表を参照)の先端に30G皮下針を取り付けることによって、手作りのデバイスを作成することです。ニードルキャップの端がマルチディスペンサーの先端に対してしっかりと密閉されていることを確認し、装置が乾くようにします。インジェクタ装置例の視覚的描写については、 図2 を参照されたい。
  3. 15 mL円錐遠心管で滅菌した1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水)と所望のタイプのウイルス粒子を混合することによって、ウイルス注入希釈溶液を調製する。必要な総量は、注射する必要がある蛹の数に依存し、各蛹は1μL注射を必要とする(例えば、500匹の蛹= 5μLのウイルス粒子+ 495μL PBS)。
  4. インジェクター装置を手動マルチピペットに取り付け、別のビーカーから100 μLの水を採取し、1 μLの用量で分配することによって有効性をテストします。分配されるすべての量が等しいことを確認し、必要に応じてインジェクタ装置を交換します。インジェクターから残りの水を取り除きます。
  5. ステップ1またはステップ2で発生した蛹のトレイをインキュベーターから取り出し、アルミニウム箔カバーを取り外します。
  6. エタノールを使用して鈍い硬い鉗子のペアをきれいにする。胸郭に沿って個々の蛹を優しくつかみ、腹部に内部流体を強制するのに十分な圧力をかけます。これにより、テルガイト分割がより明確になるはずです。
  7. マルチピペットを使用してウイルス粒子溶液100 μLを採取し、第3腹部と第4腹部のテルギートの間に針を挿入し、1 μLのウイルス溶液を注入する。トレイにレイアウトされたすべての蛹について繰り返し、注射を繰り返さないように注意してください。プロセス中に損傷した蛹は捨てるべきです。
    警告: すべてのウイルス製剤関連物質はバイオハザードに指定されており、機関のガイドラインに従ってオートクレーブ処理して廃棄する必要があります。針はまた、制度上のガイドラインに従って処分されるべきである。
  8. 注入された蛹のトレイをアルミホイルで覆い、インキュベーターに戻ります。ウイルス粒子が蛹内で3〜5日間伝播するのを許します。
    1. 蛹の毎日の検査を行い、細菌や真菌の蓄積を防ぐために、死んだり腐ったりした標本を取り除きます。メラニン化の小さな点が腹部の注射部位に現れることがありますが、生存には影響しません。
  9. 蛹を50mLの円錐遠心管にサンプリングし、渦を巻いて内容物を均質化し、コロニー源によって蛹をチューブにサンプリングして非標的ウイルスからの汚染を減らすように注意してください。蛹全体が残っていないことを確認し、ウイルス粒子の沈殿と濃縮の準備が整うまでチューブを-80°Cの冷凍庫に移します。

4. ウイルス粒子濃度

メモ: このプロトコルは、エンベロープウイルスの回復についてテストされていません。

  1. 使用前にすべての材料と容器をオートクレーブします。ニトリル手袋、ラボコート、および目の保護具は、このプロセス全体を通して着用する必要があります。開始する前に、漂白水、エタノール、およびRNase不活性化溶液を使用して、すべての作業面を滅菌してください。
    1. 1x TES (トリス-EDTA-塩) バッファーを調製する: 10 mM Tris-HCL pH 7.5、2 mM EDTA、および 150 mM NaCl を混合します。オートクレーブで滅菌する。
  2. 均質化した蛹を解凍し、遠心分離機ボトルに移す。約3容量の1x PBSを追加し(例えば、1x PBSの150mLに蛹のフル50mLチューブを加える)、最大ボトルのボリュームに容量を均等化する。
  3. 最初に手で混ぜ合わせ、次に室温でオービタルシェーカーの上に10分間置きます。
  4. 15,000 x g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞破片を除去した。細胞の破片が残っている場合は、必要に応じてこの手順を繰り返します。
    1. 上清の表面に脂肪の大きな小球が浮かんでいる場合は、チーズクロスを通して別々の滅菌遠心分離機ボトルにろ過してから進めてください。
  5. 上清を0.3倍量の24:1クロロホルム:イソアミルアルコール溶液(例えば、上清190mL+クロロホルム:イソアミルアルコール57mL)で抽出し、逆転させて混合する。21,000 x g で4°Cで20分間遠心分離する。
    警告: クロロホルムと皮膚や目に直接触れないでください。常に適切なPPEを着用してください。すべてのクロロホルム廃棄物は、機関のガイドラインに従って処分する必要があります。
  6. 氷浴中または4°Cの低温室で上清を別々の滅菌500mLビーカーにデカントすることによって、各ボトルから水相を回収する。上清をクロロホルムで汚染しないように注意してください。水相を少し失う方が良いです。
  7. RNase自由水を加えて、各ビーカーを200mLの容量まで持って行きます。ビーカーを磁気攪拌板の上に置き、中型の攪拌子に落とす。プレートを中低設定で攪拌するように設定します。
  8. 一定の穏やかな攪拌下で各ビーカーにNaClをゆっくりと加え、それぞれを最終濃度2.3%(例えば、上清200mLあたり4.6gのNaCl)まで引き上げる。ポリエチレングリコール8000(PEG)を終濃度7%(例えば、上清の200mLあたり14g PEG)まで各ビーカーに加える。
  9. ビーカーをアルミホイルで覆い、氷の上または冷蔵室で中低速で1〜5時間攪拌してPEGを溶解させ続けます。攪拌に時間が費やされるほど、PEGはより完全に溶解します。
  10. 攪拌プレートの電源を切ります。覆われたビーカーを氷の上または冷たい部屋で1〜3日間インキュベートして、ウイルス粒子およびタンパク質を沈殿させる。インキュベートに費やされる時間が長ければ長いほど、沈殿する粒子が増えます。
  11. 各ビーカーの内容物を別々の清潔な遠心分離機ボトルに移し、15,000 x g で4°Cで30分間遠心分離し、PEG粒子ペレットを回収した。上清を捨てる。
  12. PEG粒子ペレットをボトルの側面から慎重にこすり落とし、ペレットに少量のTESをゆっくりと加えて、清潔なビーカー内の最小容量の1x TESバッファーに再懸濁します(元のミツバチ100匹あたり約10mL)。
  13. 懸濁したペレットを18 G針に少なくとも10回通してから、2 mLの遠沈管に分注します。4.14の準備ができるまで、すべてのチューブを氷の上に保管してください。
  14. 2 mL チューブを 13,000 x g で 4 °C で 15 分間遠心分離し、追加の PEG を除去しました。上清を1,000 μLピペットを使用して別の2 mL遠沈管に移し、遠心分離ステップを繰り返して、すべてのPEGの完全な除去を確実にします。
  15. 遠心フィルターユニット(100 kDaカットオフ)を使用して、元の濃度の約5分の1に達するまで、室温(RT)で14,000 x g で数回の遠心分離を行い、上清内の残りの粒子を新しい遠沈管に濃縮します(10 mLの粒子-TES溶液を約2 mLの濃縮粒子に)。フィルターユニットにはさまざまなサイズがあります。処理するサンプル数に最も適したものを選択します。通常、15 mLサイズの円錐形チューブに収まるユニットが最も適切です。
  16. 濃縮粒子を再懸濁するには、26 G 皮下注射針と遠心分離機を RT で 14,000 x g で 5 分間通過させ、最終ラウンドの PEG 除去を行います。流体がまだ白濁している場合は、すべてのPEG沈殿物が除去されるまで繰り返す。
  17. 粘性のある上清を所望の量にアリコートし、使用準備が整うまで-80°Cで保存する。

5. ウイルスRNAの抽出と定量

  1. 任意の適切なRNA抽出方法(例えば、TRIzol RNA抽出試薬に続いてDNase処理)を用いて、ミツバチ全体または濃縮ウイルス粒子からRNAを抽出する。
  2. ステップ5.1で生成された接種物中のウイルス力価をRT-qPCRを介して定量し、好ましくは宿主遺伝子発現に依存しない標準曲線ベースの方法18を使用するが、他の方法も推定を可能にする可能性がある。

6. ウイルス供給バイオアッセイ

  1. バイオアッセイに必要なすべての材料をフレーム収集ステップの前(6.2)または24時間のミツバチ出現期間(6.3)に準備する。
    1. バイオアッセイに必要な数のミツバチを収容できる清潔なケージまたはその他のエンクロージャー(例:10.16 cm x 10.16 cm x 7.62 cmのアクリル製の箱ケージ)を準備し、すべてのフィーダー穴を適切なサイズの遠沈管で塞ぎます(図3)。ケージ内の治療を決定してランダム化し、それぞれに指定された治療でラベルを付け、後で簡単に参照できるようにします。
    2. 個々の中型計量ボートに対応するケージと治療にラベルを付けて、接種剤トレイを準備します。
    3. 適量のスクロースとイオン交換水(例えば、30%スクロース溶液の場合は水1Lあたりスクロース300g)を混合して給餌溶液を調製し、スクロースを添加する前後で水を殺菌する。滅菌スクロース溶液は、4°Cの冷蔵庫で数週間保存することができますが、白濁が現れた場合は廃棄する必要があります。
    4. 15 mL の遠沈管に 6.1.3 で製造された給餌溶液を部分的に充填し、反転させ、チューブの先端に 1 ~ 2 個の穴を鋲で突いてフィーダーチューブを準備します。穴は、炎の上に加熱された18G皮下注射針を使用して溶融させることもできる。フィーダーチューブキャップは、緩いフィットキャップが一晩でケージの住民を溺れさせる遅い漏れを引き起こす可能性があるため、非常にしっかりとねじ込まれていることを確認してください。
      注:給餌溶液とフィーダーチューブの容積は、実験ニーズに合わせて必要に応じて調整できます。
    5. 大きな浴槽の端を植物油または同様の脂っこい物質で軽くコーティングすることによって、新しく出現したミツバチのためのコレクション受容性を準備する。別々に、同じコーティング方法を使用していくつかの小さなカップを準備します。
  2. 少なくとも3つの別々の巣箱から供給された侵入の危機に瀕しているミツバチのひなのフレームを選択して取り除きます。適切に老化したミツバチは、櫛細胞キャッピングの下に完全に色素沈着した成虫に似ています。進行中の出現の確かな兆候は、細胞の住民がゆっくりと噛み砕くのを観察し、および/またはワックスキャッピングに沿って特徴的なギザギザの咀嚼痕を有する最近空になった細胞を観察している。
    注:必要なフレームの正確な量は、実験のサイズ、フレームあたりの出現するひなの量、および時期によって異なります。標準的なラングストロートの深いフレームには、片側あたり約3,000個の櫛歯セルが含まれています。主に帽子をかぶった蛹を含むフレームは、いくつかの観察された出現で、24時間で400匹以上のミツバチを簡単に生産することができます。必要に応じて、シーズンを通して調整してください。
  3. フレームを出現箱に入れ、巣箱の内部条件(34°Cおよび50%RH)に一致するインキュベーターに移す前に、すべての成虫ミツバチをはがします。ミツバチが24時間出現するのを許してください。
  4. インキュベーターから出現箱を取り出し、新しく出現したすべてのミツバチを収集浴槽にブラシをかけます。その後のブラッシングに誤って老化したミツバチが含まれるのを防ぐために、出現ボックスからすべてのミツバチも必ず取り除いてください。飛ぶことができるミツバチは24時間前>出現し、バイオアッセイから除外する必要があります。
  5. 収集浴槽内のミツバチを手で優しく混合することによって(この年齢では刺すことができない)、個々のコロニーからの巣箱の遺伝的影響を最小限に抑えることによって、新しく出現したミツバチの均質化された混合物を作り出す。特定の用途のためには、コロニー源のための他の配置が望ましい場合がある。
  6. 35匹のミツバチを数え、それぞれを同じグリースカップに入れてから、内容物をアクリルケージに移します。あるいは、ミスカウントエラーを避けるために、小さな倍数のミツバチをいくつかのグリースを塗ったカップ(例えば、それぞれ7匹のミツバチの5カップ)に分ける方が簡単かもしれません。使用されるミツバチの数は、ニーズや用途に基づいて変更することができます。
  7. ミツバチのケージをインキュベーター(34°C、50%RH)に移し、6.1.1で作成されたランダム化された配置順序に従って、微気候の影響を最小限に抑えるようにしてください。
  8. 開始前に、漂白水、エタノール、およびRNase不活性化溶液ですべての表面とピペットを洗浄して、ウイルス作業用のワークスペースを準備します。ウイルス粒子を取り扱うときは必ずニトリル手袋を着用してください。
  9. 適量の濃縮ウイルス粒子を解凍し(ステップ4.17)、滅菌容器内で十分なスクロース溶液(ステップ6.1.3)と十分に混合することによって、所望の濃度のウイルス接種剤を調製する。35匹のミツバチのケージの場合、それぞれに600μLの接種剤が必要です。段階希釈は、所望のウイルス濃度が0.1%以下である場合に推奨される。
    1. 例えば、1%のウイルス接種剤を必要とする40ケージを含む実験では、24mLのウイルス溶液が必要であり、これは240μLの濃縮ウイルス粒子と23.76mLのスクロース溶液を組み合わせることによって作成することができる。粘性のある液体ではいくつかの損失が予想されるため、初期ボリュームに約15%の超過を含めることをお勧めします。
  10. 6.1.2で調製した種菌トレイを処理タイプ別に選別し、適切な接種剤600 μLを各トレイ上に並べる。
    1. 接種剤トレイを対応するケージに慎重に挿入し、誤ってミツバチを放さないように注意してください。この機会にミツバチをスキャンし、転送プロセスで死亡した可能性のあるミツバチを交換してください。
  11. 6.1.4で調製した適切なフィーダーチューブを挿入して上部フィーダー穴を塞ぐ遠沈管を取り外す前に、接種剤(約12〜14時間)を完全に消費してください。これは、ケージ内のミツバチが集団全体で均等に接種物を共有することを確実にするのに役立ちます。スクロース溶液は 自由摂取 で提供され、チューブは実験の過程で必要に応じて補充されるべきである。
  12. 各実験の最初の72時間について、各ケージ内の死亡率を12時間間隔で記録し、その後、記録を24時間間隔にシフトする。死んだミツバチをケージから取り除き、ケージのドアを鉗子のペアが届き、死んだミツバチをすくい取るのに十分なだけ上にスライドさせることで、将来のカウントの容易さを高めます。ウイルスの交差汚染を防ぐために、ケージ間のアルコールランプの上の鉗子を滅菌してください。
  13. ウイルス力価測定(5.1~5.2)のためにミツバチをサンプリングするには、各ケージ内の生きた標本を無計画に選択し、ドライアイス上の遠沈管に入れます。典型的には、3匹のミツバチは、ケージの人口を減らすことなく、任意の時点でウイルス力価測定値を生成するのに十分である。
  14. 必要な限り、定期的な死亡率測定を継続します。

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結果

蛹注射とウイルス抽出のプロトコル(図1)に首尾よく従うと、大量のウイルス粒子が生成されます。しかし、さまざまなコロニーから供給された蛹を複数の時点でサンプリングして注入することで、汚染の少ない標的ウイルスを獲得する可能性が最大化されます。ミツバチの中でウイルスが複製し、互いに相互作用するダイナミクスはよく理解されていません。既存の感染の可能性と相まって、たとえ蛹が同じ元のコロニーからサンプリングされたとしても、注入された(望ましい)ウイルスが任意の所与の蛹において優勢になるという保証はない。 図4は 、抽出後に予想されるウイルス比率の潜在的な範囲を示しています。表示された4つのコロニーは、すべての蛹が最初に〜95%のイスラエル急性麻痺ウイルス(IAPV)接種剤を注射されたより大きなウイルス収穫努力のサブセットを表す。これらの抽出に関与する16のコロニーサンプルのうち10は、99%(例えば、コロニー1)の一部を含む、高純度のIAPV(>95%)を含>ていたが、他のサンプルはIAPVの割合が異なり(例えば、コロニー2〜3)、変形した翼ウ...

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ディスカッション

ここでは、幼虫の収集、ウイルスの繁殖、抽出、濃縮、ならびにケージ給餌実験の形でのウイルス処理を含む、ウイルス増幅および接種剤ストック調製プロセスのすべてのステップを詳述する方法を概説した。これらの方法は、半純粋なウイルス粒子の生成を可能にし(図4)、その有効性は、成人にとって致死的であるウイルスの用量反応死亡率試験によって一貫して定量化することができる(図5)。感染能や病態を確認した後、生成した粒子をバイオアッセイに利用し、ミツバチとミツバチウイルスの相互作用を解明することができます。

記載されたプロトコルの最も特徴的な利点の1つは、蛹の収穫、粒子の産生、またはバイオアッセイの実施のいずれであっても、それぞれが容易に大量のものにスケーリングされることです。蛹切除方法33を使用すると、1時間あたり約100匹の蛹を除去することが期待できますが、この数は熟練度に応じて拡大します。しかし、ここで報告した幼虫の自己除去方法は、...

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開示事項

著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

プロトコル作成プロセスにおけるジュリア・ファイン博士のアイデアと議論、そして編集中の有益なコメントを寄せてくれたカッソンドラ・ヴェルニエ博士に感謝します。これらの資料は、食糧農業研究財団によって部分的に支援されたプロジェクトに貢献し、助成金ID 549025の下で。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10% 漂白剤溶液
24:1 クロロホルム:イソアミルアルコールSigmaAldrichC0549
70% エタノール溶液
バイオアッセイ実験セットアップによる
Combitips Advanced 0.1mL Eppendorf30089405オプション (インジェクター アパルタスが利用できない場合)
幼虫の自己除去、約19 "x 9-1 / 8"(Langströthの深いフレーム寸法)鉗
子鈍い、幼虫の分離のための柔らかい鉗子;蛹の切除のための鈍い、硬い鉗子
ヒュームフード
キュベーター34ºを維持することができます。Cおよび50%の相対湿度
Kimwipes FisherScientific06-666どんな吸収性ワイプでも機能します
中型重量のボート接種トレイとして機能します
Microcon-100kDa、Biomax膜MilliporeSigmaMPE100025
NaCl
ニトリル手袋
リン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS)SigmaAldrichP5119
ポリエチレングリコール 8000 (PEG)SigmaAldrich1546605
冷蔵ベンチトップ遠心分離機15,000 x g 冷蔵
遠心分離機21,000 x g
リピータ M4 マルチピペットエッペンドルフ4982000322オプション (インジェクター appartus がない場合利用可能)
RNAse AwayThermoFisher7000TS1
RNAseフリー水SigmaAldrichW4502
ショ糖
TESSigmaAldrichT1375
用ケージ のための容器はを測定する必要がありますイン

参考文献

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