Method Article

細菌性内眼炎マウスモデルにおけるウイルス感染の注入と感染量の定量

DOI:

10.3791/61749

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February 6th, 2021

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1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは細菌性内膜炎のマウスモデルにおけるビトリアル内注射とその後の細菌定量の方法について説明する。このプロトコルは、宿主の免疫応答および細菌および宿主遺伝子発現を測定するために拡張することができる。

Abstract

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眼内細菌感染は視力にとって危険である。研究者は、動物モデルを使用して、感染に関連する宿主および細菌因子および免疫応答経路を調査し、実行可能な治療標的を同定し、失明を予防するための薬物を検査する。細胞内注射技術は、眼の後部の膜腔に生物、薬物、または他の物質を直接注入するために使用される。ここでは、マウス眼での感染を開始するこの注射技術と眼内細菌を定量する技術を実証した。 セレウス菌 は脳心注入液培地中で18時間成長し、100コロニー形成ユニット(CFU)/0.5μLの濃度に再懸濁した。ケタミンとキシラジンを併用してC57BL/6Jマウスを麻酔した。ピコリットルマイクロインジェクターとガラス毛細血管針を用いて、0.5μLの バチルス 懸濁液をマウス眼の中硝子に注入した。対照眼は滅菌培地を注射したか(外科的制御)、注入されなかった(絶対対照)。感染後10時間で、マウスを安楽死させ、無菌手術用ピンセットを使用して目を採取し、400μLの無菌PBSおよび1mmの無菌ガラスビーズを含むチューブに入れた。ELISAまたは骨髄ペルオキシダーゼアッセイの場合、プロテイナーゼ阻害剤をチューブに添加した。RNA抽出のために、適当なリシスバッファーを添加した。目を組織ホモジナイザーで1〜2分間ホモジナイザー化した。ホモジェナートをPBSで10倍に連続して希釈し、寒天プレートにトラック希釈した。ホモジエートの残りの部分は、追加のアッセイのために-80°Cで保存した。プレートを24時間インキュベートし、1眼当たりのCFUを定量化した。これらの技術は、マウスの目に再現性の感染症をもたらし、生存可能な細菌、宿主の免疫応答、および宿主および細菌遺伝子発現のオミックスの定量を促進する。

Introduction

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細菌性心内炎は炎症を引き起こす壊滅的な感染症であり、適切に治療しないと視力や失明を引き起こす可能性があります。眼内炎は、目1、2、3、4、5の内部に細菌が入り込んだ結果である。一度目に入ると、細菌は複製し、毒素やその他の有害因子を産生し、繊細な眼下の細胞および組織に不可逆的な損傷を引き起こす可能性がある。眼の損傷は、炎症によっても引き起こされ得るが、眼の内部に炎症細胞が流入する炎症経路の活性化に起因する1、5、6。子宮内膜炎は、眼内手術(術後)、眼への貫通傷害(心的外傷後)、または異なる解剖学的部位(内因性)7、8、9、10から眼への細菌の転移性の広がりから起こり得る。細....

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Protocol

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すべての手順は、実験動物のケアと使用のためのガイドと眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚および眼科研究協会の勧告に従って行われました。このプロトコルは、オクラホマ大学保健科学センターの施設動物管理および使用委員会(プロトコル番号15-103、18-043、および18-087)によって承認されました。

1. 滅菌ガラス針

  1. 針ピペットの引き手を オンに します。
  2. ディスプレイに 12.6 が表示されるまで ヒーター ノブを調整します。
  3. ドアを開けて、5 μL のキャピラリーチューブを上部クランプとヒーターフィラメントに手動で供給し、チューブの半分がフィラメントの下に広がるまで(図 1A)。
  4. キャピラリーチューブが上部クランプの「V」溝に入っていることを確認します。上部クランプを締めます。
  5. 下側のクランプを開いた後、下側クランプが上限に達するまで垂直スライドを手動で調整します。チューブが下側クランプの「V」溝に入っていることを確認します。下側クランプを締めます。
  6. ドアを閉めて、「レディ」ライトが点灯していることを確認します。[スタート]ボタンを押してヒーターとプルシーケンスを開始します(

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Results

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再現性の接種およびビトウィーン内注入手順の精度を生成することは、微生物内眼炎のモデルを開発する上で重要なステップです。ここでは、グラム陽性 バチルスセレウスを用いたビトリア内注入手順を実証した。5匹のC57BL6マウスの中部に100CFU/0.5μLの B.セレウス を注入した。10時間の後の感染後、我々はおよそ1.8 x 10 5 CFU/眼に B.セレウス の眼内成長を 観察した。 図1 は、マウスの目の中に細菌を送達するためのガラス針の構造を示しています。血液寒天板や培養管に成長する セレウス菌 を 図2に示す。 図3 は、空気加圧注入システムを用いたマウスのビトリアル内注入手順を示す。 図4 は、感染した眼を所望のポスト感染後に収穫する過程を示す。 図5

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Discussion

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強力な抗生物質、抗炎症薬、および虚内切開手術が可能であっても、細菌性子宮内膜炎は患者を盲目にすることができます。臨床研究は、眼内炎の研究に有用であった;しかし、眼科医炎の実験モデルは、迅速かつ再現性の高い結果を提供し、治療水準の進歩に変換することができ、患者の視覚結果を向上させます。

マウスアイの膜状ボリュームは約7μL40です。この小さい容積は限られた量の物質を注入することを可能にする。1.0 μL を超えるボリュームは、眼の損傷を避けるために注入しないでください。このプロセスでは、再現性と正確性を確保するために、特定の機器と技術の実践が必要です。内眼炎は霊長類、豚、ウサギ、ラット、モルモット、マウス28、41、42、43、44、45で研究されている。

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Disclosures

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著者らは開示する財政的な矛盾を持っていません。

Acknowledgements

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著者らは、フェン・リー博士とマーク・ディットマー博士(OUHSC P30ライブアニマルイメージングコア、ディーンA.マギーアイ研究所、オクラホマシティ、OK、米国)の支援に感謝します。私たちの研究は、国立衛生研究所の助成金R01EY028810、R01EY028066、R01EY025947、およびR01EY024140によってサポートされています。また、P30EY21725(生きた動物イメージングと分析、分子生物学、細胞イメージングのためのNIH CORE助成金)によっても研究が支援されています。私たちの研究はまた、NEIビジョンサイエンス博士後期研修プログラム5T32EY023202、長老派健康財団研究支援助成金、および失明防止研究からディーンA.マギーアイ研究所への無制限の助成金によってサポートされています。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-20 & マイクロ;LピペットRANINL0696003GNA
37oC インキュベーターフィッシャーサイエンティフィック11-690-625DNA
バクトブレイン ハートインフュージョンBD90003-032NA
セルマイクロインジェクターMicroData Instrument, Inc.PM2000NA
細い先端の鉗子サーモフィッシャーサイエンティフィック12-000-122NA
ガラスビーズ 1.0 mmBioSpec11079110NA
インキュベーター シェーカーニューブランズウィックサイエンティフィックNB-I2400NA
マイクロキャピラリーピペット 5 マイクロリットルキンブル71900-5NA
マイクロピペット ベベラーサッター インストゥルメント Co.BV-10NA
顕微鏡 Axiostar PlusZeissNA
顕微鏡 OPMI LumeraZeissNA
Mini-Beadbeater-16BioSpecModel 607NA
マルチチャンネルピペット 30-300 µLBiohit15626090NA
マルチチャンネルピペット 5-100 µLBiohit9143724NA
ニードル/ピペットプーラーKopf730NA
PBSGIBCO分子グレード
プロテアーゼ阻害剤 カクテルロシュ4693159001分子グレード
逆作用鉗子KatenaK5-8228NA
1897315

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S.

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Intravitreal InjectionBacterial EndophthalmitisMouse ModelCFU QuantitationTissue HomogenizationSerial DilutionAgar Plate IncubationColony Forming UnitsProtease InhibitorGlass Capillary Needle

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