方法論記事

マウスモデルにおける心筋梗塞後のMSC負荷注入性ヒドロゲルの筋内移植

DOI：

10.3791/61752

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2020年9月20日

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1Cardiovascular Research Institute for Intractable Disease, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 2Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 3Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Uijeongbu St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

この記事について

サマリー

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幹細胞ベースの治療は、心筋梗塞後に負傷した心臓組織を修復するための効率的な戦略として浮上している。酵素的に架橋できるゼラチンハイドロゲルを用いた幹細胞移植に最適なインビボアプリケーションを提供します。

要約

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梗塞後の心不全を予防するための現在の心臓幹細胞療法が直面している主要な問題の1つは、負傷した心筋内の移植細胞の低い保持率と生存率であり、治療効果を制限する。近年、スキャフォールディング生体材料の使用は、幹細胞治療の改善と最大化に注目されています。このプロトコルの目的は、注射用ヒドロキシフェニルプロピオン酸(GH)ヒドロゲルを使用して骨髄由来間葉系幹細胞(MCC)を移植するための簡単で簡単な技術を導入することです。ヒドロゲルは、その場で架橋され、高い生体適合性を持つ能力のために、心臓組織工学アプリケーション用の細胞送達プラットフォームとして好ましい。MSC負荷GHヒドロゲル(MSC/ヒドロゲル)を製造し、その生存と増殖を3次元(3D)インビトロ培養で評価する簡単な方法を紹介します。また、マウスにおけるMSC/ヒドロゲルの心筋内移植の手法を示し、左前下降(LAD)冠動脈結紮術とその後のMSC/ヒドロゲル移植を介して心筋梗塞(MI)を誘導する外科的処置を説明する。

概要

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心臓幹細胞療法は、心筋修復および再生1,2の潜在的アプローチとして出現した。動物モデルおよび臨床試験における最近の肯定的な結果にもかかわらず、心筋修復のための幹細胞ベース療法の適用は、梗塞した心臓組織3、4における注入された細胞の低い保持および生存不良のために制限される。その結果、細胞系組織工学の使用は、注射可能な生体材料5、心臓パッチ6、および細胞シート7を含む、宿主心筋内の細胞の保持および統合を改善するために集中的に研究されてきた。

生体工学的心臓組織修復に対する様々な潜在的アプローチの中で、間葉系幹細胞(MSC)、胚性幹細胞(ESC)、および人工多能性幹細胞(iPSC)などの適切な細胞タイプと組み合わせた注射可能なヒドロゲルは、心筋領域8,9に細胞を効果的に送達するための魅力的な選択肢である。ゼラチンは、よく知られている天然ポリマーであり、生物医学用途で使用される幅広い生体材料と比較して、その優れた生体適合性、かなりの生分解性、および免疫原性の低下により、注射可能なマトリックスとして使用することができます。ゼラチンベースの注入プラットフォームは大きな可能性を秘めていますが、生体内での適用性は、低い機械的剛性と生理学的環境における容易な劣化性に基づいて制限されたままです。

これらの制限を克服するために、インビボ用途に対してヒドロキシフェニルプロピオン酸からなるゼラチン系ヒドロゲルの新規かつシンプルな設計が提案されている。ゼラチンヒドロキシフェニルプロピオン酸(GH)コンジュゲートは、酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)の存在下でその時に架橋することができ、その後、様々な薬物、生体分子、またはヒドロゲル内の細胞を封入し、組織工学アプリケーション10、11、12、13、14に大きな可能性を示唆している。さらに、我々は最近、カプセル化されたMSCを含むGHヒドロゲルの治療効果を調査し、マウスモデル15におけるMI後の心臓修復および再生に成功した心臓修復および再生におけるそれらの使用を実証した。本プロトコルでは、GHヒドロゲル内のMCのカプセル化およびインビトロ3次元(3D)増殖に関する簡単な手法について述べた。また、梗塞した心臓へのMSC負荷GHヒドロゲルの冠動脈結紮および筋膜内移植を介してマウスMIモデルを生成するように設計された外科的処置を導入する。

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プロトコル

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すべての動物研究手順は、実験動物福祉法、実験動物のケアと使用のためのガイド、および韓国カトリック大学医学部の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)が提供するげっ歯類実験のガイドラインと方針に従って提供されました。

1. MSCおよび注射ゼラチンハイドロゲルの調製

  1. 37°Cと5%CO2で100mm培養皿で培養MSC.CSの成長が80%の合流に達したら、DPBSで皿を2回洗い、37°Cでトリプシン置換の1 mLを3分間加えます。
    注:MSCは、従来の手順16に従ってマウス骨髄から単離され、10%のウシ胎児血清(FBS)および1%抗生物質抗ミコティック溶液を含むダルベッコの修飾ワシ培地(DMEM)で培養され、この研究のために7\u20129の通過間に使用された。
  2. 培地と遠心分離機を500xgで9mL3分間加えます。次に、得られた上清を捨て、細胞をPBSの1mLで再懸濁し、細胞懸濁液を氷上に維持する。
  3. 10 μLのトリパンブルーで10 μLの細胞懸濁液を希釈し、自動化されたセルカウンターを使用して細胞濃度を得る。
  4. 1 x 107 細胞/mLの密度で1mLチューブに再中断し、MCを移します。
  5. PBSでGHコンジュゲート溶液の6.25重量%を調製し、2バイアルに分離します。次に、GH溶液をHRP(GH溶液A)の6μg/mLまたはH2O2(GH溶液B)の0.07重量%と混合します。
    注:ゼラチン-ヒドロキシフェニルプロピオン酸(GH)のコンジュゲートを公開されたプロトコル12、15に従って準備します。
    1. HRP(GH溶液A)とGH共役溶液に対するGHコンジュゲート溶液の9:1体積比をH2O2(GH溶液B)にそれぞれ保持する。
  6. GH溶液AとMSCを混合する前に、細胞懸濁液を1,000xgで短時間遠心分離し、得られた上清を慎重に吸引する。続いて、MCsを含むペレットをGH溶液Aと混合する。

2. SIU MSCローディングと3次元インビトロ培養

  1. GH溶液A(MSCを含む)とGH溶液Bを二重シリンジの両側にロードする。5 x 106 細胞/mLの最終的な密度のMSCとの結合されたGHの解決の300 μLを8ウェルの部屋のスライドに置く。
  2. 酵素架橋によるシトゥーヒドロゲル形成とその後のMSCカプセル化の後、10%FBSおよび1%抗生物質抗ミコティック溶液を含むDMEMの700 μLを加える。
  3. スライドを37°Cおよび5%CO2でインキュベートし、2\u20123日ごとに培地を交換します。

3. GHヒドロゲル内のインビトロ増殖とMSCの生存の確認

  1. GHヒドロゲル内の3D培養MCの生存率を決定するには、所定のインキュベーション時間後に生きた/死細胞染色アッセイを使用してください。
  2. 3、5、7または14日間のGHヒドロゲル中のカプセル化されたMSCのインキュベーションに続き、培地を吸引し、PBSで2回洗浄した。
  3. カルセインAM 5 μL、エチジウムホモジマー-1(EthD-1)を10 mLのDPBSで含む染色液を調製します。
  4. 200 μLの染色液をウェルに加え、室温で暗闇の中で30分間インキュベートします。
  5. 染色液を吸引し、PBSで2回洗浄します。
  6. 慎重にスライドからチャンバーを分離し、GHヒドロゲルの上に完全なカバースリップを置きます。コンフォーカル顕微鏡を使用して、カプセル化されたMSCの増殖および形態学的変化の程度を可視化する。
    注:蛍光画像は200倍倍の下で取得され、カルセインの場合は470/540 nm、EthD-1では516/607nmの励起/発光波長で画像化されました。

4. マウスの心筋梗塞の誘導

  1. 7週齢の雄C57BL/6マウス(20\u201222 g)を、ゾレチル(30mg/kg)とロンプン(10mg/kg)の混合物を生理膜内注射して生理学します。
  2. 手術前に、脱毛クリームを使用してマウスの胸部を脱毛し、ヨウ素で皮膚を殺菌します。
  3. 手術台の上にマウスを置き、カテーテルを気管に挿入して、機械的換気を介して補足的な酸素を提供します。
  4. 手術用ハサミを使って皮膚をそっと切り抜け、肋間筋をマイクロハサミで貫通する。5-0シルク縫合糸を使用して2番目と3番目の左肋骨を分離し、開いた胸腔を維持します。
  5. 8-0の針ホルダーを使用して、左前前下降(LAD)冠状動脈を慎重にリゲートするポリプロピレン縫合糸を電気焼き液を用いて縫合糸を切断する。
  6. 左心室前壁の色の変化を観察します。

5. MSC負荷GHヒドロゲルの心筋内移植

  1. LADライゲーションにより心筋梗塞を誘発した後、26G針を装着したデュアルシリンジを用いて、梗塞境界領域(合計:2 x 105 MSC/20 μL)の2つの異なる点に10μLのMSC負荷GH溶液を注入します。
    1. ステップ1で説明したのと同じ手順に従って、MSC-LOADING GH溶液を二重シリンジに準備し、移します。
      注:梗塞領域内のMSC負荷GHヒドロゲルの生着を評価するために、MSCおよびGHコンジュゲートは、それぞれPHK26およびフルオレセインイソチオシアネート(FITC)で事前に標識しました。
  2. 開いた胸腔を復元し、5-0縫合を使用して筋肉と皮膚を閉じます。
    注意:胸を閉める前に、カテーテルの注射器を使用して空気を取り除きます。
  3. 気管チューブを取り外し、回復中に赤外線ランプの下のケージにマウスを置きます。
  4. 術後鎮痛の場合、皮下ケトプロフェン注射剤(1日5mg/kg)を最低72時間投与する。すべてのマウスは、外科的処置と適切な疼痛治療の後に適切な回復を確実にするために適切な時間を注意深く監視する必要があります。

6. 心エコー検査

  1. 移植後4週間、最初に5%のイオブルランでマウスを麻酔し、イオブルラン濃度を1%に調整する。
  2. 脱毛クリームを使用して胸を脱退し、加熱パッドの上にマウスを置きます。胸部に超音波トランスデューサーゲルを適用します。
  3. 2次元の準船骨短軸ビューを取得し、乳頭筋のレベルでMモードトレースを記録します。
    注: 左寄尾線に線形配列トランスデューサ(7\u201215 MHz)を配置し、解剖構造を表示します。
  4. LVAW、LVID、LVPWの対応するラインを測定して、心臓壁の厚さ、チャンバー寸法、および分数短縮を得ます。
    注:同じ解剖学的位置で適切な評価を確実にするために、乳頭筋のレベルで、排出分率(EF)、分数短縮(FS)、および末収縮期容積(ESV)を含む心機能を比較してください。

7. 組織学的評価

  1. MSC負荷GHヒドロゲルを梗塞した心臓に移植した後の所定の時間に、マウスをCO2チャンバーに安楽死させ、組織学的分析用の心臓を集める。
  2. ヘマトキシリンとエオシン(H&E)とマッソンのトリクローム(MT)染色の場合、解剖した心臓組織を4%パラホルムアルデヒド(PFA)に固定し、パラフィンに埋め込みます。次に、パラフィン埋め込み心臓ブロックをミクロトームを用いて4μmシリアルセクションに切断し、標準プロトコル17に従ってMT染色でセクションを染色する。
  3. 20倍の倍率でスライドスキャナ上の画像を取得し、治療群の梗塞サイズを計算します。
    梗塞サイズ(%)=全梗塞周周/総LV周回×100
  4. 正中長の測定で両方の円周を計算します。LV中線周周では、心内膜面と心外膜表面の中心線の長さを測定します。中線梗塞の円周の場合、心筋18の全厚さの50%以上を含む梗塞の長さを測定する。
    注:すべての画像解析は、ImageJ ソフトウェアを使用して実行されました。
  5. 乳頭筋レベルでの瘢痕の壁の厚さを測定します。
  6. コラーゲン領域の分数を計算します。
    コラーゲン領域(%)=間質線維化/筋細胞領域の総面積 x 100

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結果

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梗塞心筋にMCを効果的に送達するために、 図1 に記載されたシンチクロスリンク可能なヒドロゲル中のMSC負荷をこのプロトコルで使用した。インビボ移植の前に、GHヒドロゲル中のMCの増殖および生存は、3Dインビトロ生きている/死細胞染色アッセイ(生:緑;死んだ:赤)によって確認された。 図2に示すように、代表的な画像は十分なMSC増殖を示し、GHヒドロゲル内の分岐ネットワークを示した。さらに、14日目にMSCの広範な多細胞3D構造が明確に観察され、GHヒドロゲルが封入された細胞に適切な微小環境を提供できることを示した。

LADライゲーションによるMIの誘導後、MSC負荷GHヒドロゲルを梗塞周部に心内移植した(図3A)。図3Bに示すように、MSCおよびゲルは梗塞領域内で適切に持続した。PHK26(赤)で染色されたMSCは、GHヒドロゲルにうまく組み込...

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ディスカッション

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注射可能なGHヒドロゲルは、多様な治療薬をその一体的にその中に組み込む能力のために、インビボアプリケーションに大きな可能性を秘めています。さらに、それらの物理的および生化学的特性は、疾患に依存する要件に基づいて容易に操作することができる。この点で、注射ヒドロゲルは、負傷した心臓19,20における生存不良および細胞保持(すなわち、<24時間以内に10%)の細胞保持によって妨げられる現在の心臓幹細胞療法における主要な制限に対処するために提案されている。この悪い結果を克服するために、本明細書に記載されているプロトコルは、心筋移植後にその中で架橋することができるGHヒドロゲルを使用して細胞の保持および生存を改善する簡単で実現可能な方法を提供し、これはマウスMIモデルにおける心臓構造および機能に好ましい影響を示している。

この技術の主な利点は、あらゆるタイプの細胞および生体分子との広いin vivoの適用性であり、注射前にプレゲルGH溶液と混合するだけでロードできる。さらに、...

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開示事項

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著者は、この作品で宣言する利益相反はありません。

謝辞

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本研究は、文部省が出資する韓国国立研究財団(NRF)を通じて基礎科学研究プログラム(NRF-2018R1D1A1A0202049346)の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4 % パラホルムアルデヒド (PFA)イントロンIBS-BP031-2
5-0 シルク縫合AILEESK534
8-0 ポリプロピレン縫合ETHICONM8732H
8 ウェルチャンバースライドNunc LAB-TEK154534
Angiocath Plus (22GA) カテーテルBD Angiocath PlusREF382423
抗生物質-抗筋ココGibco15240-062
遠心分離機GYROGEN1582MGR
共焦点顕微鏡ZeissLSM 510
カバースリップMARIENFELD101242
Deluxe High Temperature Cautery kitBovieQTY1
DMEMGibco11995-065
DPBSGibco14040-133
デュアルシリンジ
EOSINSIGMA-ALDRICH
エタノールEMSUREK49350783 739
FBSGibco16000-044
Fechtner 結膜鉗子 チタンWORLD PRECISISON INSTRUMENTSWP1820
フルオレセインイソチオシアネート異性体I(FITC)シグマ・アルドリッチF7250
鉗子HEBUHB0458
脱毛クリームイルドン製薬
加熱パッドストールティング50300ホメオサーミック・ブランケット・システム
5030150300 (10×12.5cm)用交換用加熱パッド
マトキシリンシグマ・アルドリッチHHS80
西洋わさび過酸化物 (HRP; 250-330 U/mg)SIGMA-ALDRICHP8375
過酸化水素 (H2O2; 30 wt % in H2O)SIGMA-ALDRICH216763
ヨウ素グリーン製薬
LIVE/DEAD 細胞染色キットサーモフィッシャーR37601
機械式ベンチレーターハーバード装置
マイクロ遠心分離機ハニルマイクロ12
マイクロニードルホルダーKASCO37-1452
マイクロハサミHEBUHB7381
顕微鏡オリンパスSZ61
MT 染色キットSIGMA-ALDRICHHT1079-1SETヴァイゲルト&RSQUO;鉄ヘマトキシリン溶液
HT15-1KTトリクローム染色 (マッソン) キット
パラフィンLK LABKOREAH06-660-107
PBS バッファーGibco10010-023
PHK26 染色キットSIGMA-ALDRICHMINI26
スライドスキャナーライカSCN400
手術用ハサミHEBUHB7454
サージカルテープ3M micopore1530-1
ティッシュカセットScilab KoreaCas3003
トランスデューサーゲルSUNGHEUNGSH102
トラウトバラカーニードルホルダー湾曲KASCO50-3710c
超音波システムフィリップスアフィニティ 50
キシレンJUNSEI25175-0430
糸 糸 HT110116 ヘ

参考文献

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