解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー

Summary

解剖されたインプラントからの細胞の単離とフローサイトメトリーによる特性評価は、インプラントに対する免疫応答のパターンの理解に大きく貢献します。この論文では、解剖したインプラントから細胞を単離し、フローサイトメトリー解析のために染色するための正確な方法について説明します。

Abstract

実験室で培養した組織または医療機器を個人に埋め込むことの成功は、レシピエント宿主の免疫応答の影響を受けます。インプラントを異物と見なすと、敵対的で調節不全の免疫応答はインプラントの拒絶反応につながる可能性がありますが、調節された反応とホメオスタシスの回復はインプラントの受容につながる可能性があります。 in vivo または ex vivo 環境で解剖されたインプラントの微小環境を分析することは、免疫応答のパターンを理解するのに役立ち、最終的には新世代の生体材料の開発に役立ちます。フローサイトメトリーは、細胞表面マーカーに基づいて免疫細胞とそのサブセットを特徴付けるためのよく知られた手法です。このレビューでは、解剖されたインプラント組織から均一な細胞懸濁液を単離するための、手動ダイシング、酵素消化、およびセルストレーナーによるろ過に基づくプロトコルについて説明します。さらに、マルチカラーフローサイトメトリー染色プロトコルと、フローサイトメトリーによってこれらの単離細胞を特徴付けおよび定量するためのサイトメーターの初期設定の手順について説明しました。

Introduction

医学分野の進歩により、損傷した組織の機能や再成長をサポートするために、埋め込まれた材料が頻繁に使用されるようになりました^1,2。これらには、ペースメーカー、再建美容インプラント、骨折固定に使用される整形外科用プレートなどのデバイスが含まれます^3,4。しかし、これらのインプラントを製造するために使用される材料とそれらが埋め込まれる場所は、これらのインプラントの成功を決定する上で重要な^{役割を果たします5,6,7}。異物として、これらのインプラントは宿主から免疫応答を引き起こし、拒絶反応または耐性^{につながる可能性があります8。}この要因により、生体材料研究は、移植後に望ましい免疫応答を引き付けることができる材料を生成するように推進されています9,10,11,12。

Protocol

注: 図1 に、フローサイトメトリープロトコルの概要を示します。

1)試薬調製

1. 酵素を希釈し、組織培養用の培地を調製します。
   1. 5 mLの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)緩衝液を500 mLのRPMI培地に添加し、よく振とうします。さらに使用するまで、培地を4°Cで保管してください。
2. 酵素溶液の体積を計算します。
   注:酵素溶液の容量は、6ウェルプレートでさいの目に切った組織を消化するために必要な酵素(コラゲナーゼおよびDNase I)を含む培地の容量です。サンプル数によります。
   1. 次の式を使用して、必要な体積を計算します。
      (消化するサンプル数) × 5 mL の無血清 RPMI と 10 mM HEPES バッファー
      注:例えば、0.1〜0.3gの解剖された脾臓の場合、5 mLの培地を使用して酵素溶液を調製します。この原稿に記載されている酵素消化プロトコルは、主に脳、腎臓、皮膚、肝臓、肺、脾臓、筋肉、および合成材料または細胞外マトリックスタンパク質で作られた皮下インプラントの周りのカプセルを含むマウスから解剖された軟組織(0.1〜1 gの範囲)用です。硬い軟骨組織を消化するには、さまざまな条件と消化酵素の量が必要になる場合がありますが、これは最適化によってのみ確認できま....

Results

免疫解析用のフローサイトメトリーパネルの開発プロセスでは、多くの場合、既存のデータやその分野の文献との結果との比較に依存しています。フローサイトメトリーで集団がどのように現れるかに関する知識は、データを適切に解釈するために重要です。いずれにせよ、集団や細胞の種類は組織によって異なるように見えるため、ある程度のばらつきが予想されます。明確に定義されたコントロール組織の場合、このような染色の最適化は、十分に研究された細胞型を有する既知の組織に対して評価することができる。 図3 は、コントロールマウス組織に対する14色FACSの結果を示しています。この場合、脾臓は、染色されたすべてのマーカーを識別し、染色が技術的に機能的であることを示すために使用されました。この時点から、未知の条件での試験、蛍光色素の選択に自信を持つこと、さまざまな組織源に対するプロトコルの最適化が容易になりました。 図3 はまた、マウス脾臓から単離された異なる細胞型の集団を示す

Discussion

このレビューでは、生体材料インプラントから細胞を単離し、均一な細胞懸濁液を得るための詳細な方法論について述べる。さらに、マルチカラーフローサイトメトリー用の細胞懸濁液を染色するための詳細なプロトコルと、最適な結果を得るためにフローサイトメーターを構成するための手順が提供されています。細胞単離法には複数のステップがあり、多くの場合、手動の組織解剖とそれに続くタンパク質分解酵素による酵素消化を利用して、組織内の細胞外マトリックスを解離し、細胞間接合部を破壊して個々の細胞を組織から遊離させます。消化後、残った破片を除去し、単一細胞懸濁液を確保するために、細胞の濾しなどのさらなる処理が必要です。高レベルの破片または他の細胞型(腫瘍など)を有するいくつかの試料は、密度分離媒体²³の使用を通じて、より徹底的なクリーンアップを必要とする場合がある。適切なサンプルクリーンアップを行わないと、破片や他の細胞集団が目的の集団を覆い隠すため、データが歪む可能性があります。また、過剰な破片は、サイトメーター流路系の全体的または部分的な目詰まりにつながる可能性があります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL コニカルチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14-432-22
6 ウェルプレート	フィッシャーサイエンティフィック	07-000-646
BD ブリリアントステインバッファープラス	BD バイオサイエンス	566385
BD サイトフィックス	BD バイオサイエンス	554655	細胞の固定のみ
ウシ血清アルブミン	ミリポアシグマ	A7906	FACSの調製用染色バッファー
CD11b AF700	Biolegend	101222	クローン:M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5	Biolegend	117325	クローン:N418
CD197 PE/Dazzle594	Biolegend	120121	クローン:4B12
CD200R3 APC	Biolegend	142207	クローン:Ba13
CD206 PE	Biolegend	141705	クローン:C068C2
CD45BUV737	BD Biosciences	612778	クローン: 104/A20
CD86 BUV395	BD Biosciences	564199	クローン: GL1
CD8a BV421	Biolegend	100737	クローン: 53-6.7
Comp Bead 抗マウス	BD Biosciences	552843	補償制御用
DNase I	ミリポアシグマ	11284932001	ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼ I (DNase I)
F4/80 PE/Cy7	Biolegend	123113	クローン:BM8
fc Block	Biolegend	101301	クローン:93
固定・透過化ソリューションキット	BD Biosciences	554714	細胞の固定・透過化に。
HEPESバッファー	サーモフィッシャー	15630080	細胞培地を補うためのバッファー
リベラーゼ	ミリポア シグマ	5401127001	精製コラゲナーゼIとコラゲナーゼII
のブレンド LIVE/DEAD 固定可能なブルーデッドセルステインキット	サーモフィ	ッシャーL23105	生存率色素
Ly6c AF488	バイオレジェンド	128015	クローン:HK1.4
Ly6g BV510	バイオレジェンド	127633	クローン:1A8
MHCII BV786	BD Biosciences	742894	クローン:M5/114.15.2
リン酸緩衝生理食塩水	Thermo	Fisher D8537
RPMI	Thermo Fisher	11875176	細胞培養培地
Siglec F BV605	BD Biosciences	740388	クローン:E50-2440
V底 96 ウェルプレート