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方法論記事

コンピュータベースの画像解析を用いて4T1乳がんモデルにおける肺転移の定量化を改善

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DOI:

10.3791/61805

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2020年10月2日

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1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, 2Graduate Program in Translational Biology, Medicine and Health, Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biomedical Engineering and Mechanics, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Basic Science Education, Virginia Tech Carilion School of Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

この記事について

サマリー

我々は、フィジー-ImageJを用いて4T1乳癌モデルにおける肺転移を定量化するためのより一貫した迅速な方法を記述する。

要約

乳癌は壊滅的な悪性腫瘍であり、2019年だけで米国で40,000人の女性死亡と新しい女性癌診断の30%を占めています。乳癌関連死の主な原因は転移性負担である。したがって、乳癌の前臨床モデルは、臨床的に関連する転移性負担を分析する必要があります。4T1乳癌モデルはステージIVのヒト乳癌のための自然転移、定量化可能なマウスモデルを提供する。しかし、ほとんどの4T1プロトコルは、組織培養プレート上の染色されたコロニーを手動でカウントすることによって、転移性負担を定量化する。これは転移負担の少ない組織では十分ですが、手動カウントの人為的ミスは、プレートがコンフルでカウントが困難な場合に矛盾した可変結果を引き起こします。この方法は、人間のカウントエラーに対するコンピュータベースのソリューションを提供します。ここでは、4T1モデルにおける転移性の高い組織である肺を用いてプロトコルを評価する。フィジー-ImageJで分析のためにメチレンブルー染色プレートの画像を取得し、アップロードします。フィジー-ImageJは、画像の選択された領域の青の割合を、転移性負担を持つプレートの割合を表す割合を決定します。このコンピュータベースのアプローチは、転移性の高い組織に対する手動カウントや組織病理学的評価よりも、より一貫した迅速な結果を提供します。フィジー-ImageJの結果の一貫性は、画像の品質に依存します。画像間の結果のわずかな変化が発生する可能性があるため、複数の画像を撮影し、結果を平均化することをお勧めします。その制限は最小限に抑え、この方法は、一貫した迅速な結果を提供することにより、肺の転移性負担を定量化するための改善である。

概要

女性の8人に1人は生涯に乳がんと診断されますが、複数の治療オプションにもかかわらず、乳癌はアメリカの女性における癌関連死の第2位の原因です。これらの女性は、彼らの胸の原発性腫瘍で死んでいない。その代わりに、転移性負担は、一般的に肺、骨、脳、肝臓、およびリンパ節2に広がるにつれて、この疾患の死亡率を担う。このため、乳がんモデルは転移を評価してこの疾患の死亡率を抑制する必要があります。4T1マウス乳癌モデルはこれを達成するためのすばらしいプロトコルである。ここで説明する方法は、フィジー-ImageJを使用して肺転移を定量化し、一貫した迅速な結果を生み出すことで、4T1モデルの改善を提供します。

4T1モデルは確立されており、ほとんどのラボでは、2001年にプラスキとオストランド・ローゼンバーグが記述したプロトコルを使用しています。4T1細胞株は、6-チオグアニン(6TG)耐性であり、ステージIV、トリプルネガティブ乳癌3、4、5の代表である。それは、直交性モデルであり、ヒト乳癌3,4と同じ器官に自発的に転移するので、臨床的に関連している。4T1細胞は、3,4を注入した細胞の量に基づいて予測可能な速度で自発的に転移する。重要なことに、ここで使用されるマウス間の遺伝的な違いは、転移性負担における予想される個人間変動を引き起こした。転移を評価するために、組織を採取して、6TG選択とメチレンブルー染色を用いて遠方の部位で癌細胞を採取し定量します。結果は、転移性コロニーを表す青い点を有する組織培養プレートの集合である。しかし、プラスキとオストランド・ローゼンバーグのプロトコルは、転移性コロニーを手動で数えることによって定量化するため、このモデルの転移を評価する標準的な手段となっています。これは転移性負担の少ない組織では容易であるが、肺のような組織はしばしば転移を伴う。肺プレートは非常にコンフルエントであり得るため、手動カウントによって転移性コロニーを正確かつ正確に定量化することは困難であり、人為的ミスを起こしやすい。転移性の負担をより良く定量化するために、人数カウントエラーに対するコンピュータベースのソリューションに Fiji-ImageJ を使用する方法について説明します。ヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色を用いた病理組織学的解析は、肺転移を定量するもう一つの手段であり、興味深いことにフィジー-ImageJソフトウェア6,7で改善された。しかし、組織病理学的分析は肺の単一のスライスを観察するので、不正確で非代表的である可能性があります。これは、4T1モデルが均一に分布していない器官全体でいくつかの転移性病変を引き起こすからです。組織病理学的解析と手動カウントの全体的な傾向は8と似ていますが、個々の値は異なるため、組織病理学的分析は定量の唯一の手段として使用しないでください。我々は、異なるカウンタ間の手動カウントにおける組織病理学的分析との比較に比べて利点を示し、同時にFiji-ImageJを使用する一貫性を実証する。さらに、この方法は、インキュベーション時間を10〜14日から5日に短縮できることを示し、研究者は手動カウントに頼るときよりもはるかに早く研究のデータを分析できることを示しています。

この方法は、プラスキとオストランド・ローゼンバーグプロトコル3に対する簡単な調整のコレクションです。4T1モデルは広く使用されており、肺転移は前臨床モデルで測定する重要なパラメータであるため、この方法は広く使用でき、乳がん研究者にとって非常に価値があると考えています。必要な追加の供給は、カメラとフィジー-ImageJ、画像解析9で頻繁に使用されるフリーソフトウェアを搭載したコンピュータへのアクセスです。この方法は特に肺転移に焦点を当てていますが、転移性の大きな負担を伴う他の組織に使用することができます。

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プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、バージニア工科大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されており、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイドに従って承認されています。このプロトコルを実行するには、適切な機関からの許可とすべての適切なガイドラインへの遵守が必要です。

1. 細胞培養

  1. 完全な培養培地(RPMI + 10%胎児血清 +1%ペンストレップ) を作ります。ATCCプロトコル10 に従って4T1細胞を蘇生し、コンフルエントになるまでT-25 フラスコで37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。復活した翌日にメディアを変更して死んだ細胞を取り除き、細胞が通過するのに十分なコンフルエントになる前にメディアが費やされた場合。
  2. T-25フラスコがコンフルエントになると、培地を廃棄し、1xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)の5mLでフラスコを洗浄し、500 μLのトリプシン-EDTAを加えることによって、T-75フラスコへの細胞を通過させる。細胞が外れるまで37°Cで5〜10分間インキュベートする。
    1. 取り外し後、5 mLの温め完全な培養培地を細胞に加えます。吸引し、5 mLを15mLの温めた完全な培養培地を含むT-75フラスコに移します。
  3. T-75フラスコの通過細胞は少なくとも4回である。フラスコが8 mLの1x DPBSで洗浄し、細胞を剥離するためのトリプシンEDTAの1 mLを加え、細胞に10mLの温められた培地を加え、1:6-1:8を20mLの温められた完全な培養培地を含む新しいT-75フラスコに希釈することによって、これをコンフルエントにします。
  4. 40 mLの温め込み完全培養培地を含むT-150フラスコの適切な数までの通過細胞を、注射するマウスの数に対する。ほとんどの研究は、注入のための十分な細胞を確保するために複数のT-150フラスコを必要とします.
  5. マウスを注射する準備ができたら(IACUCまたは制度プロトコルに応じて、8週齢または20g以上の体重)、培地を廃棄し、各フラスコを10 mLの1x DPBSで洗浄し、トリプシン-EDTAを2mL加えて細胞を収穫する。細胞が外れるまで37°Cで5〜10分間インキュベートする。
  6. 完全な培地の10 mLでフラスコを洗浄し、次のフラスコにすべての内容物(10 mLの培地+2 mLのトリプシン-EDTA細胞混合物)を移します。過剰な量の媒体を使用しないように、同じ10 mLの培地を使用して各フラスコから細胞を洗浄し、収集し続けます。
    1. すべてのフラスコを採取したら、内容物を50 mL遠心管に移します。マイクロ遠心チューブに計数する10 μLサンプルを収集し、50 mL円錐管を125 x g で5分間回収します。
  7. 細胞が遠心分離されている間、細胞サンプルの10 μLにトリパンブルーの10 μLを加えます。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数える。細胞の総数が決定されたら、マウスを1匹あたり1.2 x106 細胞(100μLあたり)に注入するために必要な細胞の濃度を計算します。
  8. 遠心分離後、デカント培地および再懸濁液細胞ペレットを100μLあたり1.2 x 106細胞に対して1.2 x106 細胞に対して、正しい量の無菌1x DPBSで再懸濁した。細胞/DPBS混合物をマイクロ遠心チューブに分割し、注射用の細胞を吸い込むときに注射器で簡単にアクセスできます。細胞を氷の上に置いておき、その後すぐに細胞が長期間氷上に置かれて死に始めるので注入する。

2. 注射

  1. マイクロ遠心分離チューブをタップまたは軽く混合して細胞を再懸濁し、600 μLを1 mLシリンジに吸引して注射用の細胞を準備します。注射器を上向きに回し、プランジャーを引き下げて、細胞をシリンジの開口部から遠ざけます。シリンジをタップして気泡を取り除く。
  2. 針ベベルを取り付け、500 μL だけがシリンジに残るまで、マイクロ遠心分離チューブに細胞を分配します。シリンジを氷の上に平らに置きます。
    注:4T1細胞はすぐに懸濁液から落ちる。したがって、頻繁にタップして細胞を懸濁液に戻して混合することが重要です。
  3. イゾフルランまたは他の承認された麻酔薬を使用して8週齢/>20gの女性BALB /cマウスを麻酔します。マウスの呼吸を監視して麻酔の深さを評価します。
  4. 角膜反射の欠如によって示されるようにマウスが適切に麻酔されたら、その背中にマウスを置きます。親指、ポインタ、中指を使って、マウスを軽く押し続けます。マウスの上半身と親指を左後ろ足に押し続けるには、ポインタと中指を使用します。優しく、しかししっかりしてください。
  5. 針のベベルを上にして、マウスの左腹部乳腺脂肪パッドに皮下100μLの細胞を注入します。良好なブレブと漏出を監視し、マウスが目を覚まし、注射後に簡単に動かされることを確認します。
    1. 各マウスの間の針を変更します。
      注:針が腹腔に入ることを許さないで下さい。これは癌が急速に広がり、モデルの代表ではない原因となる。皮下注射を確実にするために、左腹部乳腺脂肪パッドに挿入すると針を上にそっと引っ張ります。針が上方に持ち上げられやすく、皮下に正しく配置されます。

3. モニタリング

  1. 体重、体の状態スコア、腫瘍サイズ、腫瘍の状態、呼吸、活動レベル、外観、および運動について、少なくとも週に3回マウスを監視する。腫瘍が直径0.7〜0.8cmに達したら、毎日監視を開始します。
    1. 腫瘍のサイズが1.5cmに達した場合、または体重減少が20%に達した場合、または身体状態スコア、腫瘍状態、呼吸、活動レベル、外観、または運動の重度の臨床的低下が制度的ガイドラインに基づいて観察される場合に安楽死を考慮してください。
      注:体の状態スコアは、腫瘍の大きさが増加するにつれて体重が増加し、病気の負担による身体状態の損失を否定するので、監視することが重要です。正確な監視プロトコルは、承認されたIACUCまたは機関プロトコルに依存します。

4. 壊死

  1. 制度ガイドラインに従って、CO2 を使用してマウスを安楽死させる。
  2. 消毒するために70%エタノールでマウスをスプレーします。マウスの腹側中線を切開して体腔を露出させます。
  3. 腎臓を取り除く。横隔膜が見えるまで、正中線を切り取り続けます。はさみを使って横隔膜を穿刺して肺を収縮させる。ダイヤフラムを整え、空洞へのアクセスを改善します。
  4. 胸部の中心を切り取るために鈍いはさみを使用してください。胸部をピンで戻し、肺と心臓を露出します。
  5. 腎臓が取り除かれた腹腔に溜まるまで心臓の頂点に針を挿入することによって、2 mLの非無菌1x DPBSで心臓を浸透させる。
  6. 心臓と肺を取り除くために、鈍いはさみを使って心臓の真上の食道と気管を切ります。鉗子を使用して、心臓を体から引き離し始め、それを取り付けたまま任意の結合組織で切り取る。肺は心臓で出てきます。
  7. マルチロブ(右)と単一葉(左)の肺を特定します。心臓を参照のために取り付けたままにしておきますが、肺が特定されたら、心臓を切り取ります。
  8. 各ウェルに1x Hankのバランスド生理液(HBSS)を含む12ウェルプレートにラベルを付けます。各マウスは2つの井戸を必要とします。転移評価のために12ウェルプレートにマルチロブ(右)肺を入れ、氷の上に置きます。今のところ、隣人はよく空のままにしてください。
    注:各サンプルのサイズが近いように、すべてのマウスから同じ肺(マルチロブ)を使用することが重要です。単一葉肺は、組織病理学のような他の分析に使用することができる。
    注:サンプルは氷上または4°Cで数時間安定しています。

5. ティッシュの処理

注: このセクションのすべての手順は、滅菌技術を使用して行う必要があります。

  1. 1本のマウス1本につき15mLの円錐管にラベルを付け、各チューブにIV型コラゲナーゼ混合物2.5mLと30単位のエラスターゼを加えます。IV型コラゲターゼ混合物を作るために、1mL HBSSおよび滅菌フィルターあたりIV型コラゲターゼの2mgを溶解する。これは-20°Cで12ヶ月まで貯えることができ、必要に応じて解凍することができる。
  2. 肺を2番目のサンプルに対して1x HBSSをきれいに移します。残りの血液を除去するために鉗子を使用して渦巻く。清潔な肺を空の3.5cm組織培養プレートに移す。はさみで肺をミンチ。2.5 mLの1x HBSSを使用して、1x HBSSと肺片をコラゲナーゼ/エラスターゼカクテル(合計5 mL)を含む15 mL円錐形チューブに移します。
  3. 4°Cで75分間インキュベートする。 この間サンプルを混合し続けるので、ロッカーまたは回転ホイールにチューブを置きます。このインキュベーション工程中に、各マウスに対して50 mL遠心管および10cmの組織培養プレートをラベル付けします。希釈を行う場合は、希釈のために十分な10cmの組織培養プレートにラベルを付けます。
    メモ:ティッシュ培養プレートの蓋にラベルを付けます。プレート自体にラベルを付けると、書き込みがフィジー-ImageJ分析に干渉します。
  4. 1x HBSSで各チューブの容積を合計10 mLまで持ち込みます。70 μmのセルストレーナーの上に内容物を注ぎ込み、各サンプルに対して50 mLの円錐チューブを取り込みます。1 mL シリンジのプランジャーを使用して、ストレーナーを通してサンプルをそっと粉砕し、より多くの細胞がフィルターを通せるようにします。
  5. 室温(RT)で350 x g で5分間遠心分離機。上清を捨て、1x HBSSの10 mLでペレットを洗浄します。この手順を 2 回繰り返します。
  6. 60 μM 6TG 完全培養培地(RPMIまたはIMDM)の10 mLでペレットを再懸濁します。10cmの細胞培養板のプレートサンプルは、必要に応じて希釈スキームを用いた。37°Cでインキュベートし、5日間のCO2 を5%にします。
    注: 1:2、1:10、および 1:100 は、研究パラメータに基づいて経験的に決定する必要がある一般的な希釈剤です。
    注意:6TGは有毒です。取り扱う際は注意し、すべての環境安全衛生ガイドラインに従って処分を行ってください。

6. 染色プレート

  1. 適切な廃棄物容器にプレートから培養培地を注ぎます。1皿あたり5mLの希釈されていないメタノールを加えて細胞を固定し、RTで5分間インキュベートし、プレート全体を覆えるようにメタノールを旋回させます。
    注意:メタノールは、摂取、吸入、または皮膚上にある場合に危険です。このステップにはヒュームフードを使用してください。
  2. 適切な廃棄物容器にプレートからメタノールを注ぎます。1皿あたり5mLの蒸留水でプレートをすすい、適切な廃棄物容器に水を注ぎます。プレートあたり0.03%メチレンブルーの5 mLを加え、RTで5分間インキュベートし、メチレンブルー溶液を旋回させ、プレート全体を覆います。
  3. 適切な廃棄物容器にメチレンブルーを注ぎます。プレートあたり5mLの蒸留水で再びプレートをすすい。プレートを裏返し、ペーパータオルにブロットして余分な液体を取り除きます。蓋にプレートを置き、RTで一晩空気を乾燥させます。
    注: 転移コロニーは青色になります。プレートを乾燥させると、RTで無期限に保存できます。

7. 画像解析

  1. ラベル付きの蓋をプレートから取り除き、サンプルの明確な識別を確実にします。すべての染色された肺プレートを清潔で軽い表面に並び、すべてのプレートを1つの画像で撮影します。
  2. 明るい領域にプレートのコレクションの写真を撮り、プレートが非常に反射するので反射を最小限に抑えます。プレート内の反射は画像解析に影響するため、避ける必要があります。
    注:フィジー-ImageJには2ギガピクセルの上限があります。現代のスマートフォンのほとんどは十分なカメラを持つことになります。8 メガピクセル未満のカメラは使用しないでください。この実験で使用されたカメラは、Google Pixel 2の12.2メガピクセルでした。
  3. イメージをトリミングしてプレートを含めますが、画像の背景に蓋やその他の内容を除外します。トリミングした画像をフィジー-ImageJにアップロードします。
  4. イメージ、調整、色のしきい値、しきい値の方法: 既定、しきい値の色: B&W、しきい値の領域: ラボ. 暗い背景ボックスの選択を解除します。イメージは白黒になります。黒は明るい背景を表し、白は青い転移性コロニーを表します。
  5. フィジー-ImageJ ツールバーの円ツールを使用して、分析する領域を選択します。すべてのプレートに使用する円を 1 つ描き、各プレートが同じ大きさの領域で確実に分析されるようにします。プレートのエッジに表示されるバックグラウンドノイズを最小限に抑えながら、プレート上の解析領域を最大化するサイズを選択します。サイズは、描画時にツールバーに表示されるので、円の描画に合わせて高さと幅を監視することで、完全な円を作ることができます。
  6. 選択した円を分析して、青い転移性のコロニーがあるプレートの面積を表す白の領域の割合を特定します。次のコマンドを使用します。
    分析、パーティクルの分析、サイズ(ピクセル2):0-無限、円形: 0.00-1.00、表示: 何も表示しない、および[集計]ボックスをオンにします。OKを押します。
  7. 面積の割合の結果を記録します。これは、選択した領域の白の割合であり、したがって、転移性の負担を表します。
    注: 結果をフィジー-ImageJで保存するか、結果ページ全体を別のドキュメントにコピー/貼り付けることをお勧めします。% エリアの結果が予期しない、または疑わしい場合、他の測定値も疑わしいか、または % Area が正しく記録されていないかどうかを確認できます。
  8. 円を中央に移動してサイズを変更せずに、写真の次のプレートに移動します。図のすべてのプレートについて、手順 7.6 と 7.7 を繰り返します。
  9. 少なくとも2枚の画像に対して、手順7.1~7.8を繰り返します。すべてのプレートと画像を分析したら、各プレートの異なる画像間の面積の結果の割合を平均して、画像間の不一致を軽減します。

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結果

この方法には、プラスキおよびオストランド-ローゼンバーグ 4T1 プロトコル3からの簡単な調整が含まれ、図 1に表示できます。3人の別々の研究者が12個の肺プレート(1:10希釈)の転移コロニーを手動で数えた場合、結果は異なるカウンター間で非常に矛盾していた(図2A)。研究者は全員「青い点として現れる転移性コロニーを数える」ように指示されましたが、不整合は、転移性の高いプレートを手動で数えることで問題を示しています。研究者たちは4T1モデルの経験の様々なレベルを持っていました。ボード認定の獣医病理学者は、フィジー-ImageJ肺板分析と比較する別の方法として、転移のためのH&E染色された肺スライドを分析しました(図2B)。

フィジー-ImageJ分析を用いて、3人の別々の研究者が12枚のプレートのコレクションの3つの別々の画像を分析しました(1:2希...

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ディスカッション

示されているように、各肺板上の転移コロニーを手動で数えることは、肺転移を定量する不正確で不正確な方法であり、より良い定量手段の必要性を示す(図2)。H&Eスライドは臓器全体の代表的なサンプルではないため、組織病理学的分析は手動計数とフィジー-ImageJ分析(図2Bおよび4D)の両方とは若干異なった。プロトコルは肺全体を収穫し、したがって、総肺転移のより代表的であり、手動カウントよりも一貫している。フィジー-ImageJ分析に対していくつかの異なるアプローチが試みられ、以下で説明されていますが、上記のプロトコルは優れた方法のようです。

この研究のために肺、血液、および脳サンプルを採取した。しかし、血液と脳のサンプルは、転移性コロニーがほとんどなかった。転移性コロニーを手動で数えることは、これらの転移性の低い組織に最適であると判断したため、血液および脳データは含まれなかった。転移負担が手動でカウントしやすい場合(例えば、数千人ではな...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、バージニア・メリーランド州獣医学部(IA)、バージニア工科大学臨界技術・応用医療センター(IA)、国立衛生研究所R21EB028429(IA)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
麻酔室コメントを見る コメントを見る材料を所属機関のポリシーで使用する
麻酔薬コメントを見る コメントを見る材料を所属機関のポリシーで使用する
BALB/c メスジャクソン研究所000651
鈍いハサミロボズRS-6700
電卓AnyAny
カメラAnyAny最低8メガピクセル
遠心分離機AnyAny125 x gおよび300 x g
CO2安楽死のセットアップコメントを見る コメントを見るのポリシーで承認された資料を使用する
冷蔵室、冷蔵庫、冷蔵倉庫AnyAny
Fiji-ImageJAnyAnyNeeds to be capable of running Fiji-ImageJ
CountingChamber Fisher Scientific02-671-10
湾曲ハサミRobozRS-5859
蒸留水AnyAny
エラスターMP Biomedicals 100617
電子スケールAnyAny
ウシ胎児血清(FBS)R&D SystemsS11150
鉗子RobozRS-8100
IceN/AN/A
インキュベーターコメントを見るコメントを見る% CO2 および 37 ° の能力が必要です。C
メタノールフィッシャーサイエンティフィックA412SK-4
メチレンブルーシグマアルドリッチ03978-250ML
ペニシリンストレプトマイシン
ピンまたは針任意の検中にマウスをピン留めするため
キャリパーVWR25729-670
RMPI-1640ミディアムATCC30-2001
ロッカーまたは回転ホイール任意の
シャープハサミRobozRS-6702
PES膜付き滅菌使い捨てフィルターサーモフィッシャーサイエンティフィック568-0010
T-150フラスコフィッシャーサイエンティフィック08-772-48
T-25フラスコフィッシャーサイエンティフィック10-126-10
T-75 フラスコフィッシャー・サイエンティフィック13-680-65
三角プラスチックビーカーフィッシャー・サイエンティフィック14-955-111Fマウスの計量に使用
トリパンブルーVWR97063-702
トリプシン-EDTAATCC30-2101
IV型コラゲナーゼシグマ・アルドリッチC5138
3.5cm組織培養プレートNunclon153066
1 mL シリンジBD309659
1.7 mL 微量遠心チューブVWR87003-294
10 cm 組織培養プレートフィッシャーサイエンティフィック08-772-22
12 ウェルプレートコーニング3512
15 mL 遠心分離チューブフィッシャーサイエンティフィック14-959-70C
1X ダルベッコ・ポーストフェート緩衝生理食塩水 (DPBS)Fisher ScientificSH30028FS
1X Hank'S Balanced Saline Solution (HBSS)Thermo ScientificSH3026802
27 g 1/2 in needlesFisher Scientific14-826-48
4T1 (ATCC®CRL­2539™)ATCCCRL-2539
50 mL 遠心分離管フィッシャー サイエンティフィック14-959-49A
6-チオグアニンSigma-AldrichA4882
70 μM細胞ストレーナーFisher Scientific22-363-548
70% エタノールSigma AldrichE7023DI水で70%に希釈
承認された 認定マウス が可能である必要がある 機関 Any ゼ 5ATCC30-2300剖プラスチック

参考文献

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再版と許可

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