Method Article

コンピュータベースの画像解析を用いて4T1乳がんモデルにおける肺転移の定量化を改善

DOI:

10.3791/61805

⸱

October 2nd, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, 2Graduate Program in Translational Biology, Medicine and Health, Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biomedical Engineering and Mechanics, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Basic Science Education, Virginia Tech Carilion School of Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、フィジー-ImageJを用いて4T1乳癌モデルにおける肺転移を定量化するためのより一貫した迅速な方法を記述する。

Abstract

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乳癌は壊滅的な悪性腫瘍であり、2019年だけで米国で40,000人の女性死亡と新しい女性癌診断の30%を占めています。乳癌関連死の主な原因は転移性負担である。したがって、乳癌の前臨床モデルは、臨床的に関連する転移性負担を分析する必要があります。4T1乳癌モデルはステージIVのヒト乳癌のための自然転移、定量化可能なマウスモデルを提供する。しかし、ほとんどの4T1プロトコルは、組織培養プレート上の染色されたコロニーを手動でカウントすることによって、転移性負担を定量化する。これは転移負担の少ない組織では十分ですが、手動カウントの人為的ミスは、プレートがコンフルでカウントが困難な場合に矛盾した可変結果を引き起こします。この方法は、人間のカウントエラーに対するコンピュータベースのソリューションを提供します。ここでは、4T1モデルにおける転移性の高い組織である肺を用いてプロトコルを評価する。フィジー-ImageJで分析のためにメチレンブルー染色プレートの画像を取得し、アップロードします。フィジー-ImageJは、画像の選択された領域の青の割合を、転移性負担を持つプレートの割合を表す割合を決定します。このコンピュータベースのアプローチは、転移性の高い組織に対する手動カウントや組織病理学的評価よりも、より一貫した迅速な結果を提供します。フィジー-ImageJの結果の一貫性は、画像の品質に依存します。画像間の結果のわずかな変化が発生する可能性があるため、複数の画像を撮影し、結果を平均化することをお勧めします。その制限は最小限に抑え、この方法は、一貫した迅速な結果を提供することにより、肺の転移性負担を定量化するための改善である。

Introduction

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女性の8人に1人は生涯に乳がんと診断されますが、複数の治療オプションにもかかわらず、乳癌はアメリカの女性における癌関連死の第2位の原因です。これらの女性は、彼らの胸の原発性腫瘍で死んでいない。その代わりに、転移性負担は、一般的に肺、骨、脳、肝臓、およびリンパ節2に広がるにつれて、この疾患の死亡率を担う。このため、乳がんモデルは転移を評価してこの疾患の死亡率を抑制する必要があります。4T1マウス乳癌モデルはこれを達成するためのすばらしいプロトコルである。ここで説明する方法は、フィジー-ImageJを使用して肺転移を定量化し、一貫した迅速な結果を生み出すことで、4T1モデルの改善を提供します。

4T1モデルは確立されており、ほとんどのラボでは、2001年にプラスキとオストランド・ローゼンバーグが記述したプロトコルを使用しています。4T1細胞株は、6-チオグアニン(6TG)耐性であり、ステージIV、トリプルネガティブ乳癌3、4、5の代表である。それは、直交性モデルであり、ヒト乳癌3,4<....

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Protocol

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ここに記載されているすべての方法は、バージニア工科大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されており、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイドに従って承認されています。このプロトコルを実行するには、適切な機関からの許可とすべての適切なガイドラインへの遵守が必要です。

1. 細胞培養

  1. 完全な培養培地(RPMI + 10%胎児血清 +1%ペンストレップ) を作ります。ATCCプロトコル10 に従って4T1細胞を蘇生し、コンフルエントになるまでT-25 フラスコで37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。復活した翌日にメディアを変更して死んだ細胞を取り除き、細胞が通過するのに十分なコンフルエントになる前にメディアが費やされた場合。
  2. T-25フラスコがコンフルエントになると、培地を廃棄し、1xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)の5mLでフラスコを洗浄し、500 μLのトリプシン-EDTAを加えることによって、T-75フラスコへの細胞を通過させる。細胞が外れるまで37°Cで5〜10分間インキュベートする。
    1. 取り外し後、5 mLの温め完全な培養培地を細胞に加えます。吸引し、5 mLを15mLの温めた完全な培養培地を含むT-75フラスコに移します。
  3. T-75フラスコの通過細胞は少な....

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Results

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この方法には、プラスキおよびオストランド-ローゼンバーグ 4T1 プロトコル3からの簡単な調整が含まれ、図 1に表示できます。3人の別々の研究者が12個の肺プレート(1:10希釈)の転移コロニーを手動で数えた場合、結果は異なるカウンター間で非常に矛盾していた(図2A)。研究者は全員「青い点として現れる転移性コロニーを数える」ように指示されましたが、不整合は、転移性の高いプレートを手動で数えることで問題を示しています。研究者たちは4T1モデルの経験の様々なレベルを持っていました。ボード認定の獣医病理学者は、フィジー-ImageJ肺板分析と比較する別の方法として、転移のためのH&E染色された肺スライドを分析しました(図2B)。

フィジー-ImageJ分析を用いて、3人の別々の研究者が12枚のプレートのコレクションの3つの別々の画像を分析しました(1:2希.......

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Discussion

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示されているように、各肺板上の転移コロニーを手動で数えることは、肺転移を定量する不正確で不正確な方法であり、より良い定量手段の必要性を示す(図2)。H&Eスライドは臓器全体の代表的なサンプルではないため、組織病理学的分析は手動計数とフィジー-ImageJ分析(図2Bおよび4D)の両方とは若干異なった。プロトコルは肺全体を収穫し、したがって、総肺転移のより代表的であり、手動カウントよりも一貫している。フィジー-ImageJ分析に対していくつかの異なるアプローチが試みられ、以下で説明されていますが、上記のプロトコルは優れた方法のようです。

この研究のために肺、血液、および脳サンプルを採取した。しかし、血液と脳のサンプルは、転移性コロニーがほとんどなかった。転移性コロニーを手動で数えることは、これらの転移性の低い組織に最適であると判断したため、血液および脳データは含まれなかった。転移負担が手動でカウントしやすい場合(例えば、数千人ではな.......

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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この研究は、バージニア・メリーランド州獣医学部(IA)、バージニア工科大学臨界技術・応用医療センター(IA)、国立衛生研究所R21EB028429(IA)によって支援されました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
麻酔室コメントを見る コメントを見る材料を所属機関のポリシーで使用する
麻酔薬コメントを見る コメントを見る材料を所属機関のポリシーで使用する
BALB/c メスジャクソン研究所000651
鈍いハサミロボズRS-6700
電卓AnyAny
カメラAnyAny最低8メガピクセル
遠心分離機AnyAny125 x gおよび300 x g
CO2安楽死のセットアップコメントを見る コメントを見るのポリシーで承認された資料を使用する
冷蔵室、冷蔵庫、冷蔵倉庫AnyAny
Fiji-ImageJAnyAnyNeeds to be capable of running Fiji-ImageJ
CountingChamber Fisher Scientific02-671-10
湾曲ハサミRobozRS-5859
蒸留水AnyAny
エラスターMP Biomedicals 100617
電子スケールAnyAny
ウシ胎児血清(FBS)R&D SystemsS11150
鉗子RobozRS-8100
IceN/AN/A
インキュベーターコメントを見るコメントを見る% CO2 および 37 ° の能力が必要です。C
メタノールフィッシャーサイエンティフィックA412SK-4
メチレンブルーシグマアルドリッチ03978-250ML
ペニシリンストレプトマイシン
ピンまたは針任意の検中にマウスをピン留めするため
キャリパーVWR25729-670
RMPI-1640ミディアムATCC30-2001
ロッカーまたは回転ホイール任意の
シャープハサミRobozRS-6702
PES膜付き滅菌使い捨てフィルターサーモフィッシャーサイエンティフィック568-0010
T-150フラスコフィッシャーサイエンティフィック08-772-48
T-25フラスコフィッシャーサイエンティフィック10-126-10
T-75 フラスコフィッシャー・サイエンティフィック13-680-65
三角プラスチックビーカーフィッシャー・サイエンティフィック14-955-111Fマウスの計量に使用
トリパンブルーVWR97063-702
トリプシン-EDTAATCC30-2101
IV型コラゲナーゼシグマ・アルドリッチC5138
3.5cm組織培養プレートNunclon153066
1 mL シリンジBD309659
1.7 mL 微量遠心チューブVWR87003-294
10 cm 組織培養プレートフィッシャーサイエンティフィック08-772-22
12 ウェルプレートコーニング3512
15 mL 遠心分離チューブフィッシャーサイエンティフィック14-959-70C
1X ダルベッコ・ポーストフェート緩衝生理食塩水 (DPBS)Fisher ScientificSH30028FS
1X Hank'S Balanced Saline Solution (HBSS)Thermo ScientificSH3026802
27 g 1/2 in needlesFisher Scientific14-826-48
4T1 (ATCC®CRL­2539™)ATCCCRL-2539
50 mL 遠心分離管フィッシャー サイエンティフィック14-959-49A
6-チオグアニンSigma-AldrichA4882
70 μM細胞ストレーナーFisher Scientific22-363-548
70% エタノールSigma AldrichE7023DI水で70%に希釈
承認された 認定マウス が可能である必要がある 機関 Any ゼ 5ATCC30-2300剖プラスチック

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. American Cancer Society. , (2019).
  2. Yousefi, M., et al. Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology. 41 (2), 123-140 (201....

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