糖尿病ラットにおけるY-迷路を介した視運動応答と認知機能の行動評価

Summary

糖尿病の結果としての目と脳の両方の神経変性は、げっ歯類に対して行われる行動検査を通じて観察することができる。Y迷路、空間認知の尺度、および視機能の尺度である光運動応答は、両方とも潜在的な診断と治療に関する洞察を提供する。

Abstract

視運動応答とY迷路は、それぞれ視覚機能と認知機能を評価するのに有用な行動検査である。検眼応答は、糖尿病性網膜症を含む多くの網膜疾患モデルにおける空間周波数(SF)およびコントラスト感受性(CS)閾値の経時変化を追跡するための貴重なツールです。同様に、Y迷路は、中枢神経系に影響を与える多くの疾患モデルにおける空間認知(自発的な交代によって測定される)および探索的行動(多数のエントリによって測定される)を監視するために使用することができる。光運動応答とY迷路の利点は、感度、テストの速度、自然応答の使用(トレーニングは必要ありません)、および目覚め(非麻酔)動物に実行される能力を含みます。ここでは、オプト運動応答とY迷路の両方についてプロトコルが記載されており、その使用例はI型およびII型糖尿病のモデルに示されている。方法には、げっ歯類や機器の調製、検眼応答とY迷路の性能、および試験後のデータ分析が含まれる。

Introduction

4億6,300万人以上の人々が糖尿病と一緒に暮らしており、世界で最大の病気の流行^{の1つとなっています}。糖尿病に起因する重篤な合併症の1つは、アメリカの成人の失明の主な原因である糖尿病性網膜症(DR)^である2。今後30年間で、DRのリスクを持つ人口の割合は2倍になると予測されるため、DRの開発を予防し軽減するために、初期段階でDRを診断する新しい方法を見つけることが重要です³。DRは従来、血管疾患^4,5,6であると考えられている。しかし、血管病理に先行する神経機能障害とアポトーシスの証拠が現在、DRは神経および血管成分^4,5,6,7,8,9を有すると定義されている。DRを診断する1つの方法は、他の神経組織¹⁰よりも糖尿病による酸化ストレスや代謝株に対してより脆弱である可能性のある組織であるレティナの神経異常を調べることである。

認知機能と運動機能の低下は、糖尿病でも起こり、しばしば、疾患の変化と相関する。II型糖尿病の高齢者は、ベースライン認知能力の低下を描写し、対照参加者¹¹よりも悪化した認知機能低下を示す。さらに、レティナは中枢神経系の延長として確立されており、病理は^retina12に現れる可能性がある。臨床的には、アルツハイマー病および他の疾患の文脈で、レティナと脳の関係は研究されているが、一般的に糖尿病^{12、13、14、15、16}で探索されていない。糖尿病の進行時の脳とレチナの変化は、STZラット(毒素、ストレプトゾトシンまたはSTZが膵臓ベータ細胞に損傷を与えるために使用されるI型糖尿病のモデル)や後頭柿ラット(動物が3週齢頃に高血圧を発症するII型糖尿病のポリジェニックモデル)を含む動物モデルを使用して探索することができる。このプロトコルでは、糖尿病性げっ歯類における認知的および視覚的変化を評価するためのY迷路および眼運動応答についての説明がそれぞれ提供される。光運動応答(OMR)は、各眼¹⁷の視覚閾値を測定するために特徴的な反射的なヘッド追跡の動きを監視することによって、空間周波数(視力に似ている)とコントラスト感度を評価します。空間周波数とは、バーの太さまたは細かさを指し、コントラスト感度とは、バーと背景のコントラストの程度を指します(図1E)。一方、Y迷路は、迷路の腕を通して自発的な交代とエントリを通して観察される短期的な空間記憶と探索的機能をテストします。

両方のテストは、目を覚まし、麻酔をしない動物で行われ、動物の生来の応答を利用する利点があり、訓練を必要としないことを意味する。どちらも比較的敏感であり、げっ歯類の糖尿病の進行の早い段階で赤字を検出するために使用することができ、信頼性があり、他の視覚、女性、または行動検査と相関する結果を生み出すという。さらに、OMRとY迷路を電気レチノグラムや光学コヘレンス断層撮影スキャンなどのテストと組み合わせて使用すると、疾患モデルにおいて、レチナル、構造、認知の変化が互いに相対的に発達する時期に関する情報を提供することができます。これらの調査は、糖尿病によって起こる神経退性を同定するのに役立つ可能性がある。最終的には、これは進行の初期段階でDRを効果的に識別する新しい診断方法につながる可能性があります。

このプロトコルの開発に使用されるOMRとY迷路システムは 、材料表に記載されています。OMRに関するこれまでの研究は、プルスキーら¹⁸、およびY迷路、モーリスら¹⁹によって、このプロトコルを開発するための出発点として使用された。

Protocol

すべての手続きは、アトランタ退役軍人事務施設動物のケアと使用委員会によって承認され、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイドに準拠しました(NIH出版物^、第8 版、2011年更新)。

1. オプトモーター応答(OMR)

1. OMR装置の設定(材料表の装置とソフトウェアの詳細)
   1. げっ歯類に適したサイズのプラットフォーム(マウス、ラット、または大/障害のあるラット)を選択します(図1A)。
   2. OMRソフトウェアを開き、オプションの複数のタブとOMR/仮想ドラムの内部のライブビデオフィードを持つウィンドウに開く必要があります(図1B)。必要に応じてビデオカメラでズームインまたはズームアウトして、プラットフォームとその周囲を表示します。
   3. ライブイメージの左側にあるアイコンを確認します(図1C)。緑色のアスタリスクと緑の回転ストライプの両方がライブフィードから消えるように、アスタリスクアイコンと回転ストライプアイコンをクリックします。
   4. コンパス アイコンをクリックして、緑色の円と 2 本の垂直線が表示されるようにします。緑色の円を伸ばしてプラットフォーム上の黒い円と完全に一致するようにして、OMR が完全に整列するようにします。
   5. テスト中に円を見る必要がないので、 コンパスアイコン をクリックしてください。 緑色のアスタリスクアイコン と 緑の回転ストライプアイコンを クリックすると、これらのアイコンが再表示されます。緑色のストライプはドラムのストライプと同じ方向に回転し、研究者はストライプの方向を知ることができます。
   6. [ テスト ] タブをクリックします。[ テスト] の [ 心理物理学 ] タブをクリックします。[ しきい値] で、[ 周波数 ] を選択して空間周波数を測定します。
      注: OMR ソフトウェアは、階段パラダイムを使用して、空間周波数 (SF) を自動的に計算します。コントラストは100%に維持されます。
   7. [ テスト] の [プリセット] タブ を クリックします。^Mouse18 または ^Rat20 のデフォルト設定を選択します。
   8. [ テスト] の [ ブランキング ] タブをクリックします。マウスが右クリックされるたびにドラム内のコンピュータ画面のストライプ/ブランクを一時停止する [トラッキング 時に空白]ボックスをオンにします。
   9. [ 結果 ] タブをクリックすると、テストの結果が表示されます。
2. 空間周波数の評価
   1. 12°/sの速度でチャンバを周回する垂直正音波格子を示す4台のコンピュータモニタからなるバーチャルリアリティチャンバーの中央にある円形プラットフォーム上にげっ歯類を置きます(図1D)。
   2. チャンバーの上部に配置されたビデオカメラは、げっ歯類の動作をコンピュータモニターに生き生きと映し出していることに注意してください。
   3. 格子が時計回りまたは反時計回りに移動する場合、げっ歯類の頭による反射的な動作の有無を探します。図示されたバーがプログラムに表示されていることを確認します。
      1. げっ歯類の頭がグレーティングと同じ方向に動くのを見てください。頭の動きの不安定なバーストではなく、スムーズな追求が起こるまで待って、追跡としてカウントします。
      2. [ はい ] または [ いいえ ] をクリックします。SF は 0.042 cyc/deg から始まり、各 yes と no を調整して、より簡単または難しくなるようにします(図 1E)。誤って [はい] と [いいえ] をクリックしたためにテストをリセットする必要がある場合は、[ リセット ] をクリックします。
   4. げっ歯類がテストされると、げっ歯類の頭の上にアスタリスクを置くようにしてください。
      注: これは 2 つの効果があります: 1) 正しい空間周波数を維持します。たとえば、アスタリスクが肩の間に配置されている場合、空間周波数が低くなり、バーが見やすくなり、スコアが誤って高くなります。2)わずかな頭の動きを持つげっ歯類の場合、アスタリスクは、頭が実際に動いているかどうかを測定することが容易になります。
   5. げっ歯類の空間周波数に達したときにシステムが「完了」と言うのを見てください。 [はい ] ボタンと [いいえ ] ボタンはクリックできなくなります。
   6. [ 結果 ] タブをクリックすると、左目、右目、および結合された目の空間周波数が表示されます。
      注:ソフトウェアは、結果が反転する、すなわち、右目が左目として報告され、左目が右目として報告されるように設定されている場合があります。これは、緑内障モデルで1つの目しか病変していなかったげっ歯類を評価する際に発見された。
3. コントラスト感度の評価
   注: コントラスト感度テストは、空間周波数測定ステップの直後または同じ日または別の日に、空間周波数テストの後にげっ歯類が疲労しているように見える場合に実行できます(コントラスト感度のみをテストする場合は、手順1~2.2に従います)。
   1. [ テスト ] タブをクリックし、[ 精神物理学 ] タブをクリックします。[ しきい値] で [ コントラスト (単一)] を選択して、コントラスト感度を測定します。
   2. また、階段パラダイムを使用して、コントラスト感度(CS)曲線のピーク時にSF定数でグレーティングを開始します。これを行うには、[ 刺激 ]タブをクリックし、[ グレーティング ]タブをクリックします。[ 空間周波数 ] ボックスで、ラットの 場合は 0.064 、マウスの場合 は 0.103 と入力します。
   3. 100%からコントラストを開始し、空間周波数テストで見たのと同じ反射的な頭部の動きを探します。試験が進むにつれてコントラストは、げっ歯類が刺激に反応して反射的な頭部の動きを持たなくなるまで減少することに注意してください(図1E)。
   4. システムが「完了」と表示され、[ はい ]ボタンと [いいえ ]ボタンは、げっ歯類が視覚刺激に応答しなくなり、コントラスト感度のしきい値に達するとクリックできなくなるのを監視します。[ 結果 ]タブをクリックすると、左目、右目、および結合された目のコントラスト感度が表示されます。
4. テスト後の分析を実行する
   1. 両眼が同様の欠損を有すると予想される糖尿病性網膜症の研究では、組み合わせたスコア(左右の目の平均)を分析に使用します。眼に差動損傷を起こすモデル(例えば、爆風損傷や緑内障)については、左右の目のデータを別々に保ちます。
   2. [空間周波数] では、分析に生のスコア ( [結果 ] タブのデータ) を使用し、これらのスコアをグループ別に平均化します (たとえば、糖尿病、制御など)。
   3. コントラスト感度の場合、生の値を使用して、以前の画面の輝度の測定とは対照的に、ミッシェルソンのコントラストによって報告されたコントラスト感度を計算します。

2. Y迷路

1. テスト用のげっ歯類を準備する
   1. テスト前に30分間、げっ歯類を部屋に適応させろ。
      注:研究者はライトをつけたまま部屋に残ることができますが、この間は静かにしてください。
   2. 動物にとって安全な消毒液でY迷路を洗浄し、ペーパータオルですべての消毒液を拭き取ります。迷路が乾燥していることを確認します。
2. Y迷路を指揮する
   1. Y迷路の初期アームをB、他の2アームをAとCとラベル付けします(図2A)。Y迷路の中心近くの研究者(腕B)に最も近い腕にげっ歯類を1つ置きます。げっ歯類が配置されたら、タイマー( 材料のテーブルで迷路とタイマーの詳細)を開始します。
      1. 各げっ歯類が8分間Y迷路を探索できるようにします。この時間の間に録音を取り、任意の観察をメモします。迷路を視界に入れながら迷路から数フィート離れたところに座り、騒音を出さないようにしてください。
      2. 開始位置を A として記録し、げっ歯類が新しいアームに入るたびに、げっ歯類の新しい位置を記録します(図 2B)。げっ歯類の4つの手足すべてが腕の1つに入っているエントリとして定義します。
      3. げっ歯類が隠れて迷路の片腕に静止したままにするのを見てください。げっ歯類が60以上同じ場所に残っていて、探索的な行動を示していないように見える場合は、げっ歯類をY迷路の中心に向かって動かし、裁判を続けます。
   2. 各げっ歯類の後、任意の便を除去し、消毒溶液で迷路をきれいにします。
      1. すべての消毒液がペーパータオルで拭き取られ、迷路が完全に乾燥していることを確認してから、迷路に次のげっ歯類を置きます。
3. 自発的な交代と探索的挙動を計算する
   1. 探索的動作を 8 分の間に行われたエントリの合計数として計算します。
   2. 自発的な交代によって測定された空間認知を計算する:
      成功したオルターネーションの数/(エントリの合計数 - 2)
      1. げっ歯類が 3 つの異なる場所に順番に移動する際に、正常な交代を定義します (例: ABC、CAB、BCA など)。各正常な切り取りに注意してください(図 2B)。
      2. 動きがACABCABABCABCとして記録された場合、自発的な交代(分母に11の動きがある)を計算する際に、2つの初期の開始位置を無視してください。正確な動きの数を数えます(正確な動き= 8)。パーセント精度を計算します: 8/(13 - 2) = 72.7%

Results

空間周波数とコントラスト感度のしきい値をげっ歯類から取得できる場合、OMR は成功と見なされます。ここでは、空間周波数を評価するためのOMRの使用は、若い(3-6ヶ月)と高齢者(9-12ヶ月)の両方のナイーブコントロールブラウンノルウェーとロングエバンスラットで示されています。ブラウンノルウェーラットは、典型的には、ロングエバンスラットよりも高いベースライン空間周波数を示す。さらに、ロングエバンスラットでは空間周波数に対する老化効果が認められた(図3A)。若い結果と老化した結果が異なるコホートから来たため、データは一方向のANOVAを使用して分析され、その後ホルムス・シダックのポストホック比較が行われました。

OMRを用いてコントラスト感受性を評価することは、運動介入治療を受けたI型糖尿病のSTZモデルに示されている。ロングエバンスラットは、コントロール、コントロール+アクティブ、糖尿病、糖尿病+アクティブの4つのグループのいずれかに割り当てられました。糖尿病ラットは、膵臓ベータ細胞を損傷し、高血糖を誘導するために毒素ST...

Discussion

OMRとY迷路は、時間の経過とともにげっ歯類の視覚機能および認知機能の欠損の非侵襲的評価を可能にする。このプロトコルでは、OMRとY迷路が糖尿病のげっ歯類モデルにおける視覚および認知的欠陥を追跡することが実証された。

プロトコルの重要なステップ

ザ OMR

OMRを実行して視覚機能を評価する際に考慮すべき重要な点は、使用されるテストパラメータ、試験の実験設計とタイミング、および測定を行う研究者の経験です。プロトコルの中で重要な手順の 1 つは、パラメータが正しく設定されていることを確認することです。さらに、セットアップの一部として、OMRチャンバーは、各げっ歯類の前と後に消毒液または別の承認消毒剤で洗浄する必要があります。また、対策を実施する研究者が訓練を受け、対策を実施する経験を積むことも重要です。最良の結果は、げっ歯類が落ち着いていて、実験を開始する前に30分間ケージに入れて部屋に慣れているときに見られます。また、新しい歪みで作業を開...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
オプトモトリーHD	CerebralMechanics株式会社		OMR装置&ソフトウェア
タイマー	トーマス・サイエンティフィック	810029AR
Y-迷路装置	サンディエゴ・インスツルメンツ	7001-043	ラット専用に利用可能