方法論記事

ノンコード低分子RNA MicCは、 サルモネラ ・エンテリティディスの外膜タンパク質の病原性に寄与します

DOI：

10.3791/61808

⸱

2021年1月27日

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, 2Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, 3Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Agricultural Vocational College

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

λ-Red媒介組換え系を用いて、小さなノンコーディングRNA micCの欠失変異体を作製した。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ノンコーディング低分子RNA(sRNA)は、転写後レベルで遺伝子発現を制御する新しい因子です。大腸菌やネズミチフス菌で知られている一種のsRNA MicCは、外膜タンパク質の発現を抑制する可能性があります。サルモネラ・エンテリティディスにおけるmicCの制御機能をさらに調べるために、サルモネラ・エンテリティディス50336株のmicC遺伝子をクローニングし、λRedベースの組換えシステムによって変異体50336Δ micCを構築し、miccを発現する組換えプラスミドpBR322を保有する相補変異体50336ΔmicC/p micCを構築しました。 qRT-PCRの結果、50336Δ micCにおけるompDの転写は野生株のそれより1.3倍高く、50336ΔmicCにおけるompAおよびompCの転写は野生株のそれより2.2倍および3倍高いことが示された。 これらは、micCがompAおよびompCの発現を抑制することを示した。以下の研究では、50336ΔmicCの病原性は、6週齢のBalb / cマウスと1日齢のニワトリの両方に感染することによって検出されました。その結果、6週齢のBalb/cマウスの野生株50336のLD50、変異株50336ΔmicCおよび50336Δ micC/pmicCは、それぞれ12.59 CFU、5.01 CFU、および19.95 CFUであることが示された。1日齢ニワトリのLD50株は,それぞれ1.13 x 109 CFU,1.55 x 10 8 CFU,2.54 x 108 CFUであった。micCの欠失がSの病原性を亢進させることを示した。 外膜タンパク質の発現を調節することにより、マウスおよびニワトリにおける腸炎。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ノンコード低分子RNA(sRNA)は40〜400ヌクレオチド長であり、一般にタンパク質をコードしないが、細菌染色体1,2,3で独立して転写することができる。ほとんどのsRNAは、遺伝子コード領域間の遺伝子間領域(IGR)にコードされており、塩基対形成作用を介して標的mRNAと相互作用し、転写後レベルで標的遺伝子の発現を調節しています4,5。それらは、物質代謝、外膜タンパク質合成、クォーラムセンシング、および病原性遺伝子発現において重要な調節的役割を果たします5。

MicCは、大腸菌およびサルモネラ・エンテリカ・セロバー・チフィムリウムに存在する109ヌクレオチドの低分子RNA転写産物であり、OmpC、OmpD、OmpN、Omp35およびOmp36 6,7,8,9などの複数の外膜タンパク質発現を調節することができる。MicCは、in vitroでompC mRNAリーダーへのリボソーム結合を阻害することによってOmpCの発現を調節し、大腸菌での機能のためにHfq RNAシャペロンを必要とします6。ネズミチフス菌では、MicCはコード配列(コドン23〜26)内の≤12 bp RNA二重鎖を介してompD mRNAをサイレンシングし、エンドヌクレアーゼmRNA7を不安定にします。この調節プロセスは、シャペロンタンパク質Hfq10によって支援される。OmpCは豊富な外膜タンパク質であり、腸管など栄養・毒素濃度が高い環境では重要であると考えられていました6。OmpDポリンは、ネズミチフス菌の中で最も豊富な外膜タンパク質であり、全細胞タンパク質の約1%を占めています11。OmpDは、ヒトマクロファージおよび腸上皮細胞への接着に関与する12。MicCはまた、OmpCおよびOmpDポリンの両方の発現を抑制する。MicCは病原性を調節すると考えられています。MicCによって制御される新しい標的遺伝子を探索し、micCの病原性制御機能を研究するために、サルモネラ・エンテリティディス(SE)株50336のmicC遺伝子をクローニングし、変異体50336ΔmicCと相補変異体50336ΔmicC/pmicCを構築しました。新規標的遺伝子をqRT-PCRによりスクリーニングした。50336ΔmicCの病原性は、マウスおよびニワトリ感染によって検出された。

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プロトコル

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すべての実験は、国立研究評議会の実験動物の世話と使用のためのガイドに従って実施されました。揚州大学の動物管理および使用委員会は、動物に適用されるすべての実験と手順を承認しました(SYXK2016-0020)。

1. 細菌株、プラスミド、培養条件

  1. 表1に記載の細菌およびプラスミドを使用する。
  2. LBブロスまたはLB寒天プレート上で、必要に応じて50 μg/mLのアンピシリン(Amp)の存在下で37°Cで細菌を培養します。
  3. 温度感受性プラスミドを含む培養株は、30°Cでの欠失変異体構築に使用されます。

2. Sの クローンmicC 遺伝子 。 腸炎株50336

  1. Sの micC 遺伝子の上流および下流配列に基づく 。 チフィムリウムSL1344株は、SE50336ゲノムDNAを鋳型として用いたPCRにより micC 遺伝子を含む断片を増幅するプライマーvmicC-FおよびvmicC-Rを設計する。
  2. PCR用に、5 μLの10x PCR反応バッファー、2 μLのdNTP混合物(2.5 mM)、それぞれ1 μLのvmicC-FおよびvmicC-Rプライマー、5 μLのテンプレート、1 μLのTaq DNAポリメラーゼ、および35 μLのddH2Oを一緒に混合します。
  3. 以下のPCR反応条件を使用します:94°Cで4分間の予備変性;94°Cで30秒、53°Cで1分間、72°Cで1分間25サイクル、72°Cで10分間伸長します。
  4. PCR産物を配列決定し、 micC 遺伝子配列を取得する。

3. micC 欠失変異体の構築

注:サルモネラ・エンテリティディス50336株のmicC陰性変異体は、前述のようにλ-Red媒介組換えを用いて構築されました13,14。使用したプライマーを表2に記載する。

  1. micC遺伝子の相同性断片を含むクロラムフェニコールカセットを増幅する。
    1. micC遺伝子の5'および3'からの50 bp相同性拡張を含む、プラスミドpKD3からのクロラムフェニコール(Cm)カセットを増幅するためのmicC-FおよびmicC-Rプライマーを設計します。
    2. pKD3プラスミドをPCRテンプレートとして抽出します。
    3. 5 μLの10x PCR反応バッファー、2 μLのdNTP混合物(2.5 mM)、1 μLのmicC-FおよびmicC-Rプライマー、5 μLのテンプレート、1 μLのTaq DNAポリメラーゼ、および35 μLのddH2OをPCR反応混合物として混合します。
    4. 以下のPCR反応条件でCmカセットを増幅します:94°Cで4分間の予備変性;94°Cで1分間、52°Cで1分間、72°Cで1分間、10サイクル。94°Cで1分間、63°Cで1分間、72°Cで1分間25サイクル、72°Cで10分間伸長します。
    5. PCR産物のサイズをアガロースゲル電気泳動で検出します。DNAゲル回収キットでPCR産物を精製および回収し、分光光度計でDNAの濃度を測定します。
      注意:PCRは2回実行する必要があります。最初のPCR産物を1:200の比率で希釈し、二次PCRの鋳型として使用し、pKD3プラスミドによるさらなる組換えの干渉を排除した。
  2. 第1組換え株50336ΔmicC::cat を構築
    1. 100 μLのSE50336コンピテントセルと5 μLのpKD46プラスミドを均一に混合し、氷上で30分間インキュベートします。上記の混合物を42°Cで90秒間ヒートショックし、混合物を氷に2分間急速に移し、pKD46プラスミドをSE50336に形質転換した。Amp(50 μg/mL)耐性プレート上で30°Cで一晩培養することにより、陽性コロニーをスクリーニングします。
    2. SE50336/pKD46液体培養液に30 mM L-アラビノースを添加し、30°Cの振とう培養で1時間リコンビナーゼの発現を誘導します。それからコンピテントセルを準備します。
    3. 100 ng の精製 PCR 産物 (ステップ 3.1) と 40 μL の SE50336/pKD46 コンピテントセルを電気ショックカップ(バイオ・ラッドなど)に混合します。電圧1.8 kV、パルス25 μF、抵抗200 Ωのパラメータで感電変換を実行します。
    4. 電気変換後、混合物を1 mLのSOC培地に移し、150 rpmおよび30°Cで1時間振とう培養します。次に、混合物をCm(34 μg/mL)耐性LBプレートに塗抹し、37°Cで一晩培養して、陽性コロニーをスクリーニングします。
    5. 上記の陽性コロニーを42°Cで2時間培養する。Amp(50 μg/mL)に感受性があるがCm(34 μg/mL)に耐性のあるコロニーを37°Cで一晩スクリーニングし、pKD46を含まない第1組換え株を取得します。
  3. 第1組換え株50336ΔmicC::Catを同定する。
    1. 50336ΔmicC::CatゲノムDNAをPCRテンプレートとして抽出します。ステップ 2.1 と同じ PCR 反応成分を使用します。ステップ2.1と同様の条件でPCR反応を行う。
    2. アガロースゲル電気泳動によってPCR産物のサイズを検出し、PCR産物を配列決定します。
  4. 欠失変異体50336ΔmicCを構築します。
    1. プラスミドpCP20の100 ngを、電圧1.8 kV、パルス25 μF、抵抗200 Ωのパラメータを持つ40 μLの50336ΔmicC::Catコンピテントセルにエレクトロポレーションし、30°CでAmp(50 μg/mL)およびCm(34 μg/mL)耐性プレート上で陽性形質転換体をスクリーニングします。
    2. 上記の陽性形質転換体を非耐性LBに移し、42°Cで一晩培養した後、37°CのLBプレート上で単一コロニーを単離します。 AmpとCmの両方に敏感なコロニーを選択します。この変異体は、 micC 欠失変異体SE50336ΔmicCである。
    3. PCRにより50336ΔmicCを確認します。
      1. 50336ΔmicC ゲノムDNAをPCRテンプレートとして抽出します。PCR用に、5 μLの10x PCR反応バッファー、2 μLのdNTP混合物(2.5 mM)、1 μLのプライマーvmicC-F、1 μLのプライマーvmicC-R、5 μLのテンプレート、1 μLのTaq DNAポリメラーゼ、および35 μLのddH2OをPCR用に一緒に混合します。
      2. 以下のPCR反応条件を使用します:94°Cで4分間の予備変性;94°Cで30秒、53°Cで1分間、72°Cで1分間25サイクル、72°Cで10分間伸長します。

4. micC 補完株の構築

  1. プライマーpBR-micC-FおよびpBR-micC-RをNheIおよびSalI制限部位で設計します。
    1. 5 μLのSE50336ゲノムDNAを鋳型として含むPCR反応混合物、プライマーとして1 μLのpBR-micC-Fおよび1 μLのpBR-micC-R、5 μLの10x PCR反応バッファー、2 μLのdNTP混合物(2.5 mM)、2 μLのdNTP混合物(2.5 mM)、および35 μLのddH2Oを含むPCR反応混合物を使用して、フランク配列で完全長micC遺伝子を増幅します。
    2. 以下のPCR反応条件を使用します:94°Cで4分間の予備変性;94°Cで30秒、52°Cで50秒、72°Cで1分間25サイクル、72°Cで10分間伸長します。PCR産物を精製して回収します。
  2. PCR産物およびプラスミドpBR322を制限酵素 NheI および SalIを用いてそれぞれ消化し、T4リガーゼを用いて16°Cで一晩ライゲーションし、プラスミドpBR322-micCを得た。
  3. pBR322-micCをSE50336ΔmicCコンピテントセルに形質転換し、陽性形質転換体をスクリーニングして相補株SE50336ΔmicC/pmicCを取得します。相補株からプラスミドpBR322-micCを抽出し、制限酵素消化およびシーケンシングによって検証します。

5. RNA単離と定量リアルタイムPCR

  1. LB培地中のSE50336、50336ΔmicC、および50336ΔmicC/pmicC をLB培地で一晩24°Cで180 rpm振とう培養し、OD600 を2.0にしました。13000rpmで2分間遠心分離して細菌培養物を収集します。
  2. TRIzol試薬を用いて全RNAを抽出します。単離した RNA 50 μLを DNaseI 2 μL、および 10x バッファー 6 μL と共に 37 °C で 30 分間インキュベートし、DNA を除去します。1 μLのRNAサンプルをマイクロ分光光度計にピペッティングしてRNA量を測定します。
  3. cDNAの合成
    1. 20 μLの逆転写反応系(4 μLの5xバッファー、1 μLのRT酵素ミックス、1 μLのRTプライマーミックス、1 μLのトータルRNA、および4 μLのddH2O)でcDNA合成に1 μgのトータルRNAを使用します。上記の反応系を37°Cで15分間インキュベートした後、85°Cで5秒間インキュベートします。
  4. 標的遺伝子ompA、ompCおよびompDの配列に基づいてプライマーを設計する。RT試薬キットを用いて逆転写PCRを行います。PCR反応成分には、2.5 μLの10x PCR反応バッファー、1 μLのdNTP混合物(2.5 mM)、1 μLの標的遺伝子(ompA、ompCまたはompD)プライマー、2.5 μLのテンプレート、0.5 μLのTaq DNAポリメラーゼ、および17.5 μLのddH2Oが含まれています。
    1. 以下のPCR反応条件を使用します:94°Cで4分間の予備変性;94°Cで30秒、60°Cで1分間、72°Cで1分間25サイクル、72°Cで10分間伸長します。
  5. トリプリケートのRT-PCT装置でSYBRグリーンRT-PCRキットを使用してリアルタイムPCRを実行します。
    1. 次のPCR反応成分を使用してください:10 μLの2x SYBRバッファー、0.4 μLのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、0.4 μLのRoxDye II、2 μLのcDNA、および6.8 μLのRNaseフリーH2O。
    2. 次のPCR反応条件を使用します:95°Cで1分間、1サイクルで予備変性します。95°Cで5秒間、60°Cで34秒間、40サイクル。
    3. すべてのデータを内因性参照遺伝子gyrAに正規化します。データの定量化には2-ΔΔCT法を使用する15.

6. 病原性アッセイ

  1. LB培地から初期固定相(OD600の2-3)中のSE50336、50336ΔmicCおよび50336ΔmicC/pmicCを24°Cで培養し、遠心分離により回収し、滅菌PBSで適切なCFU mL-1に希釈します。
  2. マウス感染症の場合は、培養株を10 CFU/200 μL、102 CFU/200 μL、および10 3 CFU/200 μLグラジエント再懸濁液に希釈します。皮下注射により、株ごとに5匹の6〜8週齢のBalb / cマウスのグループに感染させます。対照群に200μLの生理食塩水を注射する。
  3. ニワトリ感染症の場合は、3株以上に希釈して107 CFU/200 μL、108 CFU/200 μL、109 CFU/200 μLのグラジエント再懸濁液にします。皮下注射によって株あたり20羽の1日齢のニワトリのグループに感染する。
  4. 実験動物の病気や死亡の兆候を毎日監視します。前述のように感染後のLD50 (致死量中央値)14dを計算する16。データ分析ソフトウェアを使用してデータを処理します。
  5. 感染グループでは、死んだばかりのひよこの心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓を収集します。上記の組織0.5 gを別々に秤量し、滅菌操作でそれらを粉砕します。粉砕サンプルを徐々に希釈し、LBプレート上に広げ、37°Cで8〜10時間培養します。ひよこ組織にコロニーを形成した サルモネラ 菌株の量を記録します。

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結果

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変異株50336ΔmicCおよび相補株50336Δ micC /pmicCの構築
micC遺伝子クローンの結果は、この遺伝子がSの遺伝子と100%同一性を示す109 bpで構成されていることを示しました。 チフィムリウム。配列データに基づいて、欠失変異体50336ΔmicCおよび相補変異体50336ΔmicC/pmicCの構築に成功しました。詳細には、シーケンシングの結果は、1.1kb Cmの抵抗カセットが増幅され、1番目の組換え体の構築に使用されたことを示しました。1番目の組換え体50336ΔmicC::catは、プライマーvmicC-FおよびvmicC-Rを用いたPCRによって検証され、野生株...

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ディスカッション

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S. 腸炎は、若いニワトリに感染する可能性があり、腸炎から全身感染および死亡までの症状を引き起こす重要な通性細胞内病原体です17,18。さらに、S. enteritidisは成鶏に潜伏感染を引き起こし、慢性保菌者は家禽製品を汚染し、ヒトに食品媒介感染症を引き起こします19。S. Enteritidisの病原性メカニズムは、まださらに調査されていません。現在までに、IsrJ、SroA、IsrMなどのいくつかのsRNAは、サルモネラ菌の病原性に影響を与えることがわかっています20,21,22,23。非コード低分子RNA micC遺伝子は...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は、中国国家科学基金会(第31972651号、第31101826号)、江蘇省高等教育科学基金会(第14号KJB230002号)、獣医バイオテクノロジー国家重点研究所(第SKLVBF201509号)、揚州自然科学財団助成金(第YZ2014019号)、江蘇省高等教育機関(PAPD)の優先学術プログラム開発プロジェクトからの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
デキストロースサンゴン バイオテックA610219ブロス調製用
DNA精製キットTIANGENDP214DNA精製用
Ex TaqTaKaRaRR01APCR
KH2PO4Sinopharm ブロス調製用10017608
K2HPO4Sinopharm 化学試薬20032116スープ調製用
L-アラビノースサンゴン バイオテクノロジーA610071&ラムダ;-レッド リコンビネーション
ミニ プラスミド キットTIANGENDP106プラスミド抽出
NaClシノファーム 化学試薬10019308ブロス調製用
(NH4)2SO4Sinopharm 化学試薬10002917スープ調製用
PrimeScriptRRT 試薬キット gDNA消去剤付き TaKaRaRR047qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qRT-PCR
T4 DNA LigaseNEBM0202Ligation
TRIzol Invitrogen15596018RNA 単離
トリプトンオキソイドLP0042ブロス調製用
酵母抽出物オキソイドLP0021ブロス調製用
遠心分離機エッペンドルフ5418遠心分離
電気泳動装置バイオ・ラッド164-5050電気泳動
 エレクトロポレーションシステムBio-Rad165-2100細菌形質転換用
分光光度計BioTekエポック吸光度検出
リアルタイムPCRシステムApplied Biosystems7500 システムqRT-PCR
化学試薬

参考文献

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