方法論記事

マウス初代肝細胞単離のための時間と労力の効率的なプロトコルの改善

DOI：

10.3791/61812

⸱

2021年10月25日

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1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

この記事について

サマリー

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初代肝細胞は、 インビトロで肝臓応答および代謝を研究するための貴重なツールである。市販の試薬を利用して、マウス初代肝細胞単離のための改善された時間効率および労力効率の高いプロトコールが開発された。

要約

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初代肝細胞は、 インビトロ での肝臓研究、特に糖代謝研究において広く使用されている。基本技術は、時間、労力、コスト、原発性肝細胞の使用などのさまざまなニーズに基づいて適応されており、その結果、さまざまな初代肝細胞分離プロトコルが実現しています。しかしながら、初代肝細胞単離における多数のステップおよび時間のかかる試薬調製は、効率にとって大きな欠点である。それぞれの長所と短所について異なるプロトコルを比較した後、それぞれの利点が組み合わされ、迅速かつ効率的な初代肝細胞単離プロトコルが処方された。 わずか35分以内に、このプロトコルは、他のプロトコルと同じくらい、またはそれ以上ではないにしても、健康な初代肝細胞を産出する可能性があります。さらに、単離された初代肝細胞を用いて実施された糖代謝実験は、 in vitro 肝代謝研究におけるこのプロトコールの有用性を検証した。また、将来の研究者がニーズに基づいてこのプロトコルをさらに最適化できるように、この研究の各ステップの重要性と目的を広範囲にレビューおよび分析しました。

概要

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肝臓は、食物消化、血液循環、解毒などの多数の生命維持機能において重要な役割を果たしているため、脊椎動物の体内で最も重要な器官の1つとして機能します。 体外培養における マウス初代肝細胞の使用は、炭水化物代謝および肝癌の研究においてますます人気が高まっている。したがって、マウス原発性肝細胞を先天的な生理機能を維持したまま単離するための簡便な方法を開発することが重要である。糖代謝のハブとして機能するため、肝臓はグルコース産生および貯蔵の中心でもある1。 インビトロでの 初代肝細胞を用いた実験は、ほとんどのグルコース代謝研究にとって必須である。したがって、長年にわたり、様々な研究グループがマウス原発性肝細胞単離のためのプロトコルを開発してきた。

マウス肝細胞単離の一般的な手順は、まずリン酸緩衝生理食塩水(PBS)やハンクス平衡塩溶液(HBSS)などの等月間性液体で肝臓の血液を洗い流し、次にコラゲナーゼ含有溶液を使用して肝細胞を解離させることである。これらのプロトコルは一般的な手順を共有しますが、異なるニーズに基づいて試薬と手順が異なります。しかし、必要な試薬の準備や単離工程の実行には時間がかかります。現在のプロトコルの開発では、効率を優先事項として設定し、すべての試薬をすぐに使用でき、市場から入手でき、できるだけ少ないステップで設定しました。このプロトコールの全体的な目標は、単離された初代肝細胞の純度および生存率を危険にさらすことなく、マウスから初代肝細胞を単離するための迅速かつ労働効率の高い方法を提供することである。

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プロトコル

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すべての手順は、ジョンズホプキンス動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。C57BL/6雌マウス(8週齢)を本試験に使用した。

1. 準備:

  1. ウィリアムのE培地(GlutaMAXサプリメント)を10%FBSおよび1%抗生物質 - 抗真菌溶液と混合して培養培地を作ります。
  2. 25 mL のコラゲナーゼ - ディスパーゼ培地(例えば、肝臓消化培地)を0.45 μmのシリンジフィルターを通してろ過し、粒子破片を除去する。
  3. 50mLの二重蒸留H2O(ddH2O)、35mLの灌流培地(例えば、肝臓灌流培地)(または、このプロトコールを初めて使用した時点で50mL)、および濾過したコラゲナーゼ - ディスパーゼ培地25mLを45°Cの水浴中で30分間温める。
  4. 滅菌組織培養フード内で、2 mL の 10x HBSS と 18 mL のパーコールを 50 mL チューブに混ぜて 20 mL の 1x Percoll-HBSS を作り、氷上または 4 °C に保ちます。
    注:1x Percoll-HBSSは、少なくとも6ヶ月間4°Cに保つことができます。
  5. 滅菌組織培養フード内で、30mLの洗浄培地(例えば、肝細胞洗浄培地)を清潔なペトリ皿に注ぎ、氷上に保管する。
  6. ポンプ管を45°Cの水浴の水に浸す。結果は、室温が25°Cの場合に最も信頼性があります。
  7. 225 μLのケタミンHCL、93.75 μLのキシラジン、および1x PBSの1681 μLを混合して、2 mLの1x麻酔薬を調製する。
  8. 承認された方法を使用して1匹のマウスを麻酔する。ここで、マウスに150μLの1x麻酔薬を腹腔内注射した。つま先のつまみに対する反応などの反射神経の喪失の検査を行い、完全な麻酔を確実にします。
  9. マウスの背中を4本の手足で解剖パッドに固定し、防水テープを固定するか、または施設の動物愛護および使用委員会(または同等のもの)によって承認されたその他の方法を使用します。
  10. 殺菌された鉗子とはさみを解剖のために準備する。汚染の可能性を避けるため、滅菌フード内ですべての手順を実行します。

2. 手順:

  1. ペリスタルティックポンプを使用して、ウォームアップしたddH2Oを4mL/minの速度で5分間ポンピングを開始します。ポンプチューブを水からウォームアップした灌流培地に変更します。
  2. 麻酔をかけたマウスの腹部を70%EtOHで消毒し、はさみで切り開いて肝臓、門脈、下大静脈(IVC)を露出させます。
  3. ペリスタルティックポンプを停止します。24 G カテーテル (例: クローズド IV カテーテル、24 G、0.75 IN) を IVC に挿入します。ポンピングを開始し、門脈を切断します。
  4. 洗い流された液体が透明になるまで(約3〜5分)ポンピングを続けます。液体が肝臓の隅々まで届くように、門脈を毎分押します。IVCに気泡が入らないように注意してください。
    注:このステップは、肝臓からできるだけ多くの血液を洗い流すことです。
  5. ポンピングチューブを灌流培地からコラゲナーゼ-ディスパーゼ培地に変更する。ステップ 2.6 の実行中に、コラゲナーゼ - ディスパーゼ培地の 25 mL がすべて枯渇するまでポンピングを続けます。
  6. 液体が肝臓の隅々まで届くように、門脈を毎分押します。
    注:この段階では、血液の完全な損失はマウスにとって致命的です。マウスの死は、実験後の心拍の欠如によって確認することができる。施設のポリシーに従って死体を処分してください。
  7. 胆嚢なしで肝臓全体を氷上のペトリ皿の30mL洗浄培地に隔離する。
  8. 鉗子でそれを細かく引き裂き、原発性肝細胞を溶液中に放出する。このステップは、洗浄培地を、放出された初代肝細胞および小さな肝臓片でいっぱいの濁った溶液に変えるであろう。
  9. ステップ 2.8 で白濁した溶液を 70 μm のセルストレーナーを通して、氷上の 50 mL チューブ内の 20 mL 1x Percoll-HBSS にろ過します。チューブを20回反転させて混合する。
  10. 300 x g で4°Cで10分間遠心分離する。
  11. 組織培養フード内で、上清を吸引する。ペレットを冷たい30mLの洗浄媒体で洗浄する。
  12. 50 x g で4°Cで5分間遠心分離する。
  13. 上清を除去し、ペレットを組織培養フード内の25mLの培養液(または適切な他の容量)に再懸濁する。
  14. 細胞数をカウントし、実験計画に従って所望の培養プレート上に細胞をプレートする。
    注:8週齢のマウス1匹から適切に単離された初代肝細胞は、通常、4枚の6ウェルプレートまたは4枚の12ウェルプレートに播種するのに十分である。

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結果

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効率を試験するために、本原発性肝細胞単離プロトコールを8週齢の雌性C57BL/6マウスに対して実施した。単離された初代肝細胞の付着および純度を試験した。初代肝細胞単離は、肝薬物効果および糖代謝、医薬バイオマーカー活性2、インスリン感受性、およびグルコース産生などの肝臓生理機能に関する多種多様な実験に使用される。したがって、このプロトコールで単離された初代肝細胞の活性を、以下の実験において試験した。

本プロトコールにおける初代肝細胞付着にはコーティングは必要とされなかった
単離した初代肝細胞を、6ウェルプレート上に5 x105細胞/ウェルで播種した。1時間後、しっかりとした付着が観察され、初代肝細胞は播種後12時間で完全に膨張した(図3)。このことは、めっきの12時間後、細胞が実験に利用される準備ができていることを示した。肝臓内のマウス肝細胞の核形態に基づいて、単核球肝細胞は境界で濃縮されたが、末端分化のシグネチャー...

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ディスカッション

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様々な初代肝細胞単離プロトコルが開発されている。また、さまざまなニーズに基づいて最適化および適応されています(表1)。単離プロトコルは、一般に、灌流(酵素消化を含む)および精製の2つの部分からなる。

灌流は、インビボ2、20、21、22、23で肝臓全体に対して、または解剖された肝葉24を用いて行うことができる。解剖された葉の灌流は、技術的容易さのために一般に左葉および中葉に限定されていた。理論的には、インビボ灌流は、すべての葉を有する肝臓全体の使用のために、より多くの初代肝細胞を生じるはずである。灌流中に肝臓を所定の位置に保つことは、イ...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

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この研究は、国立衛生研究所(Grant 5R01HD095512-02 to S.W.)の支援を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1x PBSGibco10010023
10x HBSSGibco14065-056
12ウェルプレートFALCON353043コーティング不要
6ウェルプレートFALCON353046コーティング不要
抗AKT細胞シグナル伝達2920S
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), 安定化Sigma-AldrichA5955
抗 FOXO1細胞シグナル伝達97635S
抗 GAPDH細胞シグナル伝達2118S
抗 p-AKT (S473)細胞シグナル伝達9271L
抗 PEPCKサンタクルーズSC-166778
抗 p-FOXO1 (S256)細胞シグナル伝達84192S
細胞ストレーナー、70&マイクロ;mCELLTREAT229483
クローズドIVカテーテル、24ゲージ 0.75 INBecton Dickinson383511
DMEM、グルコース、グルタミン、フェノールレッドなしサーモフィッシャーサイエンティフィックA1443001
EnzyChromグルコースアッセイキットBioAssay SystemsEBGL-100
ウシ胎児血清(FBS)ハイクロンSH30071.03
ForskolinMilliporeSigmaF3917-10MG
GlucagonSigma-AldrichG2044
ヤギ抗マウスIgG二次抗体LI-COR926-68070
ヤギ抗ウサギIgG二次抗体LI-COR926-32211
GraphPad Prism 8GraphPad SoftwareNA
Hepatocyte Wash MediumGibco17704-024
IBMXCell Signaling13630S
InsulinLillyNDC 0002-8215-01
Ketamine HCL (100 mg/mL)Hospira IncNDC 0409-2051-05
L-GlutamineGibco25030081
Liver Digest MediumGibco17703-034組織培養フード内で50 mLチューブにそれぞれ25 mLに分注し、-20°Cに保ちます。C冷凍庫
肝臓灌流 ミディアムGibco17701-038
ペン 連鎖球菌Gibco15140122
PercollGE Healthcare17-0891-01
蠕動ポンプGilsonMinipuls 24 mL/分でポンピング可能
ペトリ皿フィッシャーブランド08-757-12
冷蔵遠心分離機SorvallLegend RTは、50 mLチューブを4°Cで遠心分離できます。C
ナトリウム L-乳酸Sigma-AldrichL7022
ピルビン酸ナトリウムGibco11360070
シリンジフィルター、PVDF 0.45 µm 直径 30mmCELLTREAT229745
シリンジ、0.5 mLBecton Dickinson329461
シリンジ、60 mLBecton Dickinson309653
Trypan Blue Solution、0.4%Gibco15250061
チューブ、15 mLCorning430052
チューブ、50 mLCorning430290
水バスタンクコーニングCLS6783または、最大45°Cまで加熱できる任意のウォーターバスタンク。C
ウィリアムs E Medium (GlutaMAX Supplement)Gibco32551020
キシロジン (100 mg/mL)Vetone Anased LANDC13985-704-10

参考文献

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