マウス初代肝細胞単離のための時間と労力の効率的なプロトコルの改善

Summary

初代肝細胞は、 インビトロで肝臓応答および代謝を研究するための貴重なツールである。市販の試薬を利用して、マウス初代肝細胞単離のための改善された時間効率および労力効率の高いプロトコールが開発された。

Abstract

初代肝細胞は、 インビトロ での肝臓研究、特に糖代謝研究において広く使用されている。基本技術は、時間、労力、コスト、原発性肝細胞の使用などのさまざまなニーズに基づいて適応されており、その結果、さまざまな初代肝細胞分離プロトコルが実現しています。しかしながら、初代肝細胞単離における多数のステップおよび時間のかかる試薬調製は、効率にとって大きな欠点である。それぞれの長所と短所について異なるプロトコルを比較した後、それぞれの利点が組み合わされ、迅速かつ効率的な初代肝細胞単離プロトコルが処方された。 わずか35分以内に、このプロトコルは、他のプロトコルと同じくらい、またはそれ以上ではないにしても、健康な初代肝細胞を産出する可能性があります。さらに、単離された初代肝細胞を用いて実施された糖代謝実験は、 in vitro 肝代謝研究におけるこのプロトコールの有用性を検証した。また、将来の研究者がニーズに基づいてこのプロトコルをさらに最適化できるように、この研究の各ステップの重要性と目的を広範囲にレビューおよび分析しました。

Introduction

肝臓は、食物消化、血液循環、解毒などの多数の生命維持機能において重要な役割を果たしているため、脊椎動物の体内で最も重要な器官の1つとして機能します。 体外培養における マウス初代肝細胞の使用は、炭水化物代謝および肝癌の研究においてますます人気が高まっている。したがって、マウス原発性肝細胞を先天的な生理機能を維持したまま単離するための簡便な方法を開発することが重要である。糖代謝のハブとして機能するため、肝臓はグルコース産生および貯蔵の中心でもある¹。 インビトロでの 初代肝細胞を用いた実験は、ほとんどのグルコース代謝研究にとって必須である。したがって、長年にわたり、様々な研究グループがマウス原発性肝細胞単離のためのプロトコルを開発してきた。

マウス肝細胞単離の一般的な手順は、まずリン酸緩衝生理食塩水(PBS)やハンクス平衡塩溶液(HBSS)などの等月間性液体で肝臓の血液を洗い流し、次にコラゲナーゼ含有溶液を使用して肝細胞を解離させることである。これらのプロトコルは一般的な手順を共有しますが、異なるニーズに基づいて試薬と手順が異なります。しかし、必要な試薬の準備や単離工程の実行には時間がかかります。現在のプロトコルの開発では、効率を優先事項として設定し、すべての試薬をすぐに使用でき、市場から入手でき、できるだけ少ないステップで設定しました。このプロトコールの全体的な目標は、単離された初代肝細胞の純....

Protocol

すべての手順は、ジョンズホプキンス動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。C57BL/6雌マウス(8週齢)を本試験に使用した。

1. 準備:

1. ウィリアムのE培地(GlutaMAXサプリメント)を10%FBSおよび1%抗生物質 - 抗真菌溶液と混合して培養培地を作ります。
2. 25 mL のコラゲナーゼ - ディスパーゼ培地(例えば、肝臓消化培地)を0.45 μmのシリンジフィルターを通してろ過し、粒子破片を除去する。
3. 50mLの二重蒸留_H2O(ddH2O)、35mLの灌流培地(例えば、肝臓灌流培地)(または、このプロトコールを初めて使用した時点で50mL)、および濾過したコラゲナーゼ - ディスパーゼ培地25mLを45°Cの水浴中で30分間温める。
4. 滅菌組織培養フード内で、2 mL の 10x HBSS と 18 mL のパーコールを 50 mL チューブに混ぜて 20 mL の 1x Percoll-HBSS を作り、氷上または 4 °C に保ちます。
   注:1x Percoll-HBSSは、少なくとも6ヶ月間4°Cに保つことができます。
5. 滅菌組織培養フード内で、30mLの洗浄培地(例えば、肝細胞洗浄培地)を清潔なペトリ皿に注ぎ、氷上に保管する。
6. ポンプ管を45°Cの水浴....

Results

効率を試験するために、本原発性肝細胞単離プロトコールを8週齢の雌性C57BL/6マウスに対して実施した。単離された初代肝細胞の付着および純度を試験した。初代肝細胞単離は、肝薬物効果および糖代謝、医薬バイオマーカー活性²、インスリン感受性、およびグルコース産生などの肝臓生理機能に関する多種多様な実験に使用される。したがって、このプロトコールで単離された初代肝細胞の活性を、以下の実験において試験した。

本プロトコールにおける初代肝細胞付着にはコーティングは必要とされなかった
単離した初代肝細胞を、6ウェルプレート上に5 x¹⁰⁵細胞/ウェルで播種した。1時間後、しっかりとした付着が観察され、初代肝細胞は播種後12時間で完全に膨張した(図3)。このことは、めっきの12時間後、細胞が実験に利用される準備ができていることを示した。肝臓内のマウス肝細胞の核形態に基づいて、単核球肝細胞は境界で濃縮されたが、末端分化のシグネチャー.......

Discussion

様々な初代肝細胞単離プロトコルが開発されている。また、さまざまなニーズに基づいて最適化および適応されています(表1)。単離プロトコルは、一般に、灌流(酵素消化を含む)および精製の2つの部分からなる。

灌流は、インビボ2、^20、21、²²、²³で肝臓全体に対して^、または解剖された肝葉²⁴を用いて行うことができる。解剖された葉の灌流は、技術的容易さのために一般に左葉および中葉に限定されていた。理論的には、インビボ灌流は、すべての葉を有する肝臓全体の使用のために、より多くの初代肝細胞を生じるはずである。灌流中に肝臓を所定の位置に保つことは、イ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
12ウェルプレート	FALCON	353043	コーティング不要
6ウェルプレート	FALCON	353046	コーティング不要
抗AKT	細胞シグナル伝達	2920S
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), 安定化	Sigma-Aldrich	A5955
抗 FOXO1	細胞シグナル伝達	97635S
抗 GAPDH	細胞シグナル伝達	2118S
抗 p-AKT (S473)	細胞シグナル伝達	9271L
抗 PEPCK	サンタクルーズ	SC-166778
抗 p-FOXO1 (S256)	細胞シグナル伝達	84192S
細胞ストレーナー、70&マイクロ;m	CELLTREAT	229483
クローズドIVカテーテル、24ゲージ 0.75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM、グルコース、グルタミン、フェノールレッドなし	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1443001
EnzyChromグルコースアッセイキット	BioAssay Systems	EBGL-100
ウシ胎児血清(FBS)	ハイクロン	SH30071.03
Forskolin	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glucagon	Sigma-Aldrich	G2044
ヤギ抗マウスIgG二次抗体	LI-COR	926-68070
ヤギ抗ウサギIgG二次抗体	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	NA
Hepatocyte Wash Medium	Gibco	17704-024
IBMX	Cell Signaling	13630S
Insulin	Lilly	NDC 0002-8215-01
Ketamine HCL (100 mg/mL)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-Glutamine	Gibco	25030081
Liver Digest Medium	Gibco	17703-034	組織培養フード内で50 mLチューブにそれぞれ25 mLに分注し、-20°Cに保ちます。C冷凍庫
肝臓灌流 ミディアム	Gibco	17701-038
ペン 連鎖球菌	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
蠕動ポンプ	Gilson	Minipuls 2	4 mL/分でポンピング可能
ペトリ皿	フィッシャーブランド	08-757-12
冷蔵遠心分離機	Sorvall	Legend RT	は、50 mLチューブを4°Cで遠心分離できます。C
ナトリウム L-乳酸	Sigma-Aldrich	L7022
ピルビン酸ナトリウム	Gibco	11360070
シリンジフィルター、PVDF 0.45 µm 直径 30mm	CELLTREAT	229745
シリンジ、0.5 mL	Becton Dickinson	329461
シリンジ、60 mL	Becton Dickinson	309653
Trypan Blue Solution、0.4%	Gibco	15250061
チューブ、15 mL	Corning	430052
チューブ、50 mL	Corning	430290
水バスタンク	コーニング	CLS6783	または、最大45°Cまで加熱できる任意のウォーターバスタンク。C
ウィリアムs E Medium (GlutaMAX Supplement)	Gibco	32551020
キシロジン (100 mg/mL)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10