方法論記事

重合・脱重合サイクルによる限定的な供給源からの制御された翻訳後修飾と同一型を用いたチューブリンの精製

DOI：

10.3791/61826

⸱

2020年11月5日

 ,  ,  , 
1PSL Research University, CNRS UMR3348, Institut Curie, 2Université Paris-Saclay, CNRS UMR3348, Université Paris Sud

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、培養細胞や単一マウス脳などの中小規模の源からのチューブリン精製を、重合および非重合サイクルを用いて記述する。精製されたチューブリンは、特定のアイソタイプで濃縮されるか、または特定の翻訳後修飾を有し、微小管のダイナミクスおよび相互作用を研究するためにインビトロ再構成アッセイで使用することができる。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微小管細胞骨格の研究の重要な側面の1つは、インビトロ再構成実験における微小管挙動の研究である。これらは、ダイナミクスなどの微小管の本質的な特性と、微小管関連タンパク質(MAPs)との相互作用を分析することを可能にする。「チューブリンコード」は、微小管の特性および機能の調節因子として、異なるチューブのアイソタイプおよび様々な翻訳後修飾(PTM)を指し示す新しい概念である。チューブリンコードの分子機構を調べるには、特定のアイソタイプとPTMを用いた精製チューブリンを用いたインビトロ再構成実験を行うことが重要です。

現在までに、これはインビトロ実験で広く使用されている脳管状突管として技術的に困難であり、多くのPTMを抱え、定義されたアイソタイプ組成を有する。そこで、重合と非重合サイクルの古典的アプローチを用いて、異なる供給源から、異なるアイソタイプ組成および制御PTMを用いてチューブリンを精製するこのプロトコルを開発しました。アフィニティ精製に基づく既存の方法と比較して、このアプローチは、純粋で重合能力のある管状尿管を生成し、重合または脱重合に耐性のあるチューブリンが連続した精製工程中に廃棄されるようにする。

懸濁液または付着培養物として、そして単一マウスの脳から成長した細胞株からのチューブリンの精製について述べた。この方法は、まず、懸濁および付着性の両方の設定における細胞塊の生成、リシス工程、続いて重合脱重合サイクルによるチューブリン精製の連続段階について説明する。我々の方法は、チューブリンコードが微小管の固有特性および関連タンパク質との微小管相互作用に及ぼす影響に対処する実験に使用できるチューブリンを生み出す。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微小管は、多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たします。彼らは細胞に形状を与え、染色体分離のための大動脈および有糸性紡錘を構築し、細胞内輸送のトラックとして機能する。これらの多様な機能を実行するために、微小管はさまざまな方法で自分自身を整理します。この分野で興味深い質問の1つは、構造的および進化的に保存された微小管が、この多くの組織や機能に適応することを可能にする分子メカニズムを理解することです。潜在的なメカニズムの1つは、「管状コード1、2、3」と呼ばれる概念によって定義される微小管の多様化である。この管状には、αおよびβ-チューブリン遺伝子産物(チューブリンアイソタイプ)を微小管およびチューブリンの翻訳後修飾(PTM)に差動する2つの主要成分が含まれる。

1970年代以降、インビトロ再構成実験は、進化する光顕微鏡技術と組み合わせることで、微小管の特性に関する重要な発見への道を開いてきた:動的不安定性4とトレッドミリング5、およびその他のメカニズムおよび機能6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。これまでに行われたインビトロ実験のほとんどすべては、重合および脱重合16、17の繰り返しサイクルを用いて脳組織から精製されたチューブリンに基づいている。脳組織からの精製は、高品質のチューブリンを大量に得る利点(通常はグラム量)を与えるが、脳組織から精製されたチューブリンが異なるチューブリンアイソタイプの混合物であり、多くのチューブリンPTMで濃縮されるという1つの重要な欠点がある。この異種性は、微小管の特性および機能の制御における特定の管状PTMまたはアイソタイプの役割を表解することを不可能にする。したがって、管内管制御PTMと均質なアイソタイプ組成物を有するアセンブリ管管ビンの製造は、管状コードの分子機構に対処するために不可欠である。

近年、酵母Stu2pの微小チューブ結合TOG(腫瘍過剰発現遺伝子)ドメインを用いたアフィニティークロマトグラフィーによるチューブリンの精製法が開発された。この方法では、細胞または組織の粗いライセート中のチューブリンは、マトリックス固定化TOGドメインに結合するカラムを通過し、非常に小さなサンプルであっても、与えられたチューブリンプール全体の分析を可能にする。近年、組換え尿細管を精製する待望のアプローチも記載されている。これは、バキュロウイルス系に基づいており、αおよびβ-チューブリン遺伝子を含むバイシストロニックベクターが昆虫細胞19に発現する。しかし、この方法は非常に煩雑で時間がかかるため、尿細管変異20およびチューブリンアイソタイプ21、22、23 in vitroの影響を研究するためにほとんど使用される。

現在のプロトコルでは、細胞株またはマウス脳組織24から異なるレベルの修飾を有するチューブリンを生成する青写真として、確立され広く使用されている重合脱重合アプローチを用いる方法を説明する。この手順では、チューブリンは可溶性(4°Cのチューブリンダイマー)と重合形態(グアノシン5'-三リン酸[GTP]の存在下で30°Cで微小管)との間で循環する。各形態は遠心分離の連続したステップによって分離される:管状のダイマーは、冷間(4°C)の回転後に上清に残り、微小管は30°Cでペレット化される。 さらに、1つの重合工程は、高ピペラジン-N,N-ビス(2-エタンスルホン酸)(PIPES)濃度で行われ、微小管から微小管関連タンパク質を除去し、したがって、最終的に精製されたチューブリンから行う。懸濁または付着培養物として増殖したHeLa S3細胞から精製されたチューブリンは、ほとんど全く全くチューブリンPTMを含まないものであり、最近のインビトロ再構成実験25、26、27、28で使用されている。さらに、単一マウス脳からチューブリンを精製する方法を適応させ、チューブリンアイソタイプおよびPTMの変化を伴う多数のマウスモデルに使用することができる。

プロトコルでは、まず、原料物質(細胞質量または脳組織)の生成、その分解(図1A)、次いでチューブリン重合および脱重合の連続したステップを記述して、チューブリンを精製する(図1B)。精製されたチューブリンの純度(図2A,B)と量(図3A,B)を評価するプロセスについてさらに説明します。この方法は、チューブリン精製前の細胞内で修飾酵素を過剰発現させることにより、選択したPTMを濃縮したチューブリンを製造するように適合させることができる(図4B)。あるいは、チューブリン修飾酵素は、精製プロセス中にチューブリンに添加することができる。最後に、対応するチューブリン修飾酵素に欠乏しているマウスの脳から特定のアイソタイプまたはPTMを欠いた管状またはPTMを欠いて、精製することができる(図4B)29。

ここで説明する方法には、(i)比較的短時間で十分に大量のチューブリンを生産でき、(ii)特定のチューブリンアイソタイプ組成物またはPTMのいずれかで高品質で純粋なチューブリンを生成するという2つの主な利点があります。この原稿の関連ビデオでは、この手順に関連する重要な手順のいくつかを強調しています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究のための動物のケアおよび使用は、欧州共同体(2010/63/UE)の勧告に従って行われた。実験的手続きは、国際ガイドラインに準拠したキュリーCEEAIC#118(国家当局が与えた承認番号04395.03)の倫理委員会によって明確に承認されました。

1. チューブリン精製用試薬の製造

注:尿細管の精製に使用されるすべてのバッファーは、カリウム塩とナトリウム塩30を含んではなりません。

  1. 完全な培地の1 Lを準備する:ダルベックの改変されたイーグル培地(DMEM)、10%のウシ胎児血清(FBS、100 mL)、200mM L-グルタミン(2Mストックの10 mL)、および1xペニシリンストレプトマイシン(10mLの100xストック)4 °Cで保管。
  2. 140gのKOHを水に溶解して10Mの水酸化カリウム(KOH)を調製し、最終体積を250mLに調整し、室温で保存します。
  3. 0.5 Mエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を調製し、pH8、36.5 gのEDTAを水中に溶解させて、KOH(それ以外の場合EDTAが溶解しない)を用いてpHを8.0に調整し、最終容積を250mLに調整し、フィルター滅菌し、室温で保存する。
  4. 5 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)EDTA を 5 mL の 0.5 M EDTA に加えて PBS 500 mL に加え、フィルター滅菌し、室温で保存します。
  5. 0.5 M K-PIPES、pH 6.8を水に溶解して、PH 6.8に調整し、KOH(そうでない場合はPIPESが溶解しません)でpH 6.8に調整し、最終容積を500mLに調整し、フィルター滅菌し、4°Cで保管します。
  6. 1 M K-PIPES、pH 6.8を水に溶解して、PH 6.8に調整し、KOHでpH6.8、最終容積を50mLに調整し、フィルター滅菌し、4°Cで保管します。
  7. 0.5 Mカリウムエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N',N'-テトラ酢酸(K-EGTA,pH 7.7)を水中に47.5 g溶解して調製し、KOHでpH 7.7に調整し、最終体積を250mL、滅菌フィルター、および室温で処理します。
  8. BRB80(80 mM K-PIPES、pH 6.8;1 mM K-EGTA;1 mM塩化マグネシウム[MgCl2])溶液を0.5Mパイプの3.2 mL、0.5 M K-EGTAの40 μL、1 MMgCl2 の20 μLを混合して調製し、最終容積を20mLに調整します。4 °Cで保管。
  9. 435mgのPMSFをイソプロパノールに溶解して0.1Mのフェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)を調製し、25mLの最終容積を得て、-20°Cで保存します。
  10. プロテアーゼ阻害剤を調製し、10mgのアプロチニン、10mgのロイペプチン、4-(2-アミノエチル)-フルオライド10mgを水中に溶解して2.5mLの最終体積を得、100μLのアリコートを作り、-20°Cで保存する。
  11. トリトンX-100の5 mLを45mLの水に混ぜ、フィルター滅菌し、室温で保存して10%トリトンX-100を調製します。
  12. リシスバッファーを準備する (BRB80 1 mM 2-メルカプトエタノールを添加, 1 mM PMSF, 1xプロテアーゼ阻害剤は、必要に応じてHEK-293細胞、0.2%トリトンX-100)2.5μLの2-メルカプトエタノールとBRB80の20 mLを混合することにより、2.2%トリトンX-100)を混合し、200μLの0.1 M PMSF、100 μLのプロテアーゼ阻害剤を混合し、かつ29K-HE-23-293細胞の場合、400 μLの 10% トリトン X-100。
    注:2-メルカプトエタノールは有毒であり、ヒュームフードに使用する必要があります。
  13. 9.5mLの水にGTPの1gを溶解して0.2 M GTPを準備し、KOHを用いてpHを7.5に調整し、20μLのアリコートを作り、-20°Cで保存します。 フリーズ解凍サイクルを繰り返さないようにしてください。
  14. 60.56 gのトリスを水に溶解して1Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris-HCl)を調製し、HClでpH6.8に調整し、最終容積500mLに完全に調整し、フィルター滅菌し、室温で保存します。
  15. 5xレムリサンプルバッファー(450 mMジチオスライト(DTT);10%ドデシルスルフェートナトリウム(SDS);400 μM Tris-HClを準備し、 pH 6.8; 50% グリセロール; 〜0.006% ブロモフェノールブルー) 16 mLの予熱 1 M トリス-HClの 4 g を加えることによって、 pH 6.8, 溶液を穏やかに混合した。2.6 gの DTT と 20 mL のグリセロールを混合し、溶液が均質になるまでかき混ぜます。必要な色の強度に到達するために、希望する量のブロモフェノールブルー(2.5mg)を加えます。5 mLアリコートを作り、-20 °Cで保管してください。 5xストックを蒸留水に希釈して、レムリサンプルバッファーの2倍の作業溶液を調製します。

2. 管状の源の増幅と収穫

注:このプロトコルでは、3つの尿管源が使用されました:(i)細胞(HeLa S3およびHEK-293)は懸濁培養物として増殖しました。(ii) 細胞を接着培養物として増殖 (HEK-293, HeLa, U2 OS);(iii)マウス脳組織。このプロトコルは、尿細管精製の日を「0日目」と考え、それに応じて、0日目に対して他のステップが記載されている。

  1. 細胞の増幅
    1. 懸濁培養液として増殖した細胞
      注:懸濁液培養からチューブリンを正常に精製するには、少なくとも2Lの懸濁液培養液を使用してください。
      1. 2Lの懸濁液培養については、好ましい細胞型を復活させ、調製日の10日前に6×107個の細胞を得た。日-10に、プレート1板あたり107細胞で6つの15 cm直径の皿の上に細胞を版。
      2. 8日目に、必要な量の完全な培地を37°Cに予熱します。 滅菌条件下で各スピナーボトルに1Lの予熱媒体を加えます。20~25 rpmの細胞培養インキュベーター内にセットされたスターラーテーブルの上にスピナーを置き、外側のスピナーキャップを少し開けて、培地をインキュベーターの雰囲気に平衡させます。
        注:汚染を避けるために、70%エタノールを使用してメディアとスピナーボトルの外面を徹底的に清掃してください。
      3. 7日目に、トリプシン化し、合流率80~90%(約1.8×108細胞)に成長した細胞を集めます。一度に3皿から細胞を収集し、スピンダウン(200×g、5分、室温)、DMEMの10 mL内のすべての細胞を再中断します。
        注:この時点での細胞の徹底的な解離は、細胞の生存に影響を与え、低い尿管収量をもたらすスピナーボトル内のより大きな凝集体の形成を避けるために非常に重要です。
      4. DMEMの1 Lを含む各紡皮瓶に細胞懸濁液の5 mLを加え、細胞培養インキュベーターのスターラーテーブルにスピナーを戻し、細胞が1週間増殖することを可能にする。
    2. 接着培養物として増殖する細胞
      注:接着細胞からチューブリンを正常に精製するには、80〜90%の合流度の10皿以上を使用してください。
      1. 目的の細胞タイプを復活させ、増幅し、11×108細胞を、尿管製剤の日の3日前に得る。
      2. 3日目に、10個の15cm皿に10個の15cmの皿を10個皿10×10個7個の細胞に入れ、合流率80~90%成長させます。
      3. 1日目には、必要に応じて、プラスミドを用いたトランスフェクト細胞を、チューブリン修飾酵素または特定のチューブリンアイソタイプを発現させる。
  2. 細胞/脳組織の収穫
    1. 懸濁培養液として増殖した細胞
      1. 250×g、15分、室温で1L遠心分離機ボトル(材料表)とペレット細胞にスピナーからの細胞懸濁液を移します。すぐにスピナーボトルにHeLa S3細胞の別の培養を開始するために、スピナーに細胞懸濁液の100 mLを残し、スピナーボトルに完全な、事前加熱されたDMEMの1 Lを追加します。
        注:チューブリンの精製を進める前に、細菌汚染を慎重に確認してください。
      2. 10 mLの氷冷PBSで各遠心分離器ボトルからペレット化された細胞を再懸濁し、すべての細胞を50 mLスクリューキャップチューブに移します。再懸濁時には、細胞を氷の上に置いておきます。250×gで細胞をペレット、15分、4°C。
        注:スピナーボトルのクリーニングと保管に関する推奨事項に従ってください( 資料表を参照)。
      3. 上清を捨てて、細胞ペレットの体積を決定します。2 Lの懸濁液培養液(2本のスピナーボトル)から、5~6 mLの細胞ペレットを期待します。
        注: 以下に説明するプロトコルでは、セルペレットの体積は 10 mL であると想定しています。ペレットの体積に応じて実験を調整します。
      4. 1ボリューム(10mL)のリシスバッファーを加え、細胞ペレットを再中断します。
        注: 細胞ペレットの体積とリシスバッファーの体積の比率は、尿細管の精製を成功させるために非常に重要です。より多くのリシスバッファーを追加すると、チューブリン濃度が低下し、重合に必要な臨界濃度に達しないため、チューブリン収率が大幅に低下します。
        注:リシスバッファーに再懸濁した細胞は、液体窒素でスナップ凍結し、2ヶ月間-80°Cで保存することができます。
    2. 接着培養物として増殖する細胞
      注:接着培養物の細胞は、尿細管の精製を成功させるために非常に迅速に収穫する必要があります(15cmの皿を10個収穫するための約15分)。このプロトコルのステップには3人が参加しました。
      1. 皿を傾けて15cmの皿から培地を取り出し、室温でPBS-EDTAの7mLで細胞を静かに洗います(人1)。ミディアムやバッファなしで細胞を残すことを避けるために、一度に3つの15 cmの皿でのみ動作します。
      2. 5 mLのPBS-EDTAを細胞に加え、室温で5分間インキュベートします。
      3. セルリフターを使用して、細胞を皿の片端(人2)にシャベルで優しく取り外し、50 mLスクリューキャップチューブ(人3)にすべての細胞を集めます。PBS-EDTAの追加の2 mLで各プレートを洗いすき、残りの細胞を皿から採取します。このステップの間、氷の上に細胞懸濁液を含む50 mLスクリューキャップチューブを保ちます。
      4. 250×gで細胞をペレット、10分、4°C。 上清を捨てて、細胞ペレットの体積を決定します。10個の15cmの皿から〜1mLの容積を期待してください。
        注: 以下に説明するプロトコルでは、セルペレットの体積は 10 mL であると想定しています。ペレットの体積に応じて実験を調整します。
      5. 細胞を1体積(10mL)のリシスバッファーで再懸濁します。
        注:リシスバッファーに再懸濁した細胞は、-80 °Cで最大2ヶ月間保存することができます。
    3. 脳組織
      注:任意の年齢、性別、または遺伝的背景のマウスを使用することができます。トランスジェニックマウス株の選択は、対処されるべき科学的な質問に依存します。本稿では、ttll1-/-マウスから精製されたチューブリンの例を示し、主要な脳グルタミン酸酵素を欠き、チューブリンチロシンリガーゼ様1(TTLL1)タンパク質31を示す。
      1. 頸部脱臼でマウスを犠牲にし、すぐに首を切り落とし、脳を丸底チューブに集める。脳に過剰な血液がある場合は、すぐにリシスバッファーで洗浄します。死後の遅延が尿管の精製の成功に影響を与える可能性があるとして、マウスが犠牲になるとすぐに脳を収集します。均質化に使用するプローブの幅に合わせて、丸底チューブを使用します。
        注:収集されたマウスの脳は液体窒素でスナップ凍結することができ、3年まで-80°Cで保存することができます。
      2. 成虫マウスから抽出した単一の脳に500μLのリシスバッファーを加えます。プロトコルの残りの部分については、追加されるリシスバッファの体積は10 mLであると仮定する。使用する脳の数に応じて実験を調整します。

3. 細胞または脳組織のリシス

  1. 懸濁培養液として増殖した細胞
    1. HEK-293の場合、異なる幅のピペットチップを使用して繰り返し上下にピペットを使用して、氷上の細胞を分解します。まず、p1000チップを10 mLピペットに取り付け、5分ごとに細胞懸濁液を上下にピペットし、10分間(ピペットングの3サイクル)します。次に、p200チップをp1000チップに取り付け、さらにピペットを5分ごとに20分間(ピペットの5サイクル)に取り付けます。
    2. HeLa S3 の場合、フランス語プレスを使用してセルをライスします (設定については 、資料一覧 を参照)。
    3. 1/100ボリューム のリシスミックス(L)(200 μL、20mL L)を取り、同じ体積の2xレムリバッファーを加え、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
  2. 接着培養物として増殖する細胞
    1. 超音波処理器プローブに対応するために高さが減少した14 mLラウンドボトムチューブにセルを転送します(設定については 、材料表 を参照)。細胞を~45パルスに超音波処理し、顕微鏡下でリシスミックスの滴をサンプリングして細胞のライシスを確認します。
      注:パルスの数は、チューブリンの精製に使用される細胞タイプによって異なる場合があります。細胞を超音波処理しすぎると、チューブリンが沈殿し、精製収量に悪影響を及ぼす可能性があります。
    2. p200チップを使用して、5分ごとに氷の上で細胞を上下にピペット(ピペットの5サイクル)にピペットします。
    3. 1/100体積 のリシスミックス(L)(200 μL、L20mL)を取り、同じ体積の2xレムリバッファーを加え、5分間沸騰し、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
  3. 脳組織
    1. 組織ブレンダーを使用して脳組織をライゼします(設定については 、材料表 を参照)。あるいは、マイクロチューブの害虫または同等の装置を使用して組織をライスし、18G針の1 mLシリンジを用いて氷の上でピペットを上下にする。
    2. 1/100体積 のリシスミックス(L)(200μL、L20mL)を取り、同じ体積の2xレムリバッファーを加え、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。

4. チューブリンの精製

  1. リセートの明確化
    1. 150,000×g、4°C、30分で遠心分離することにより、溶解液(溶解液の分離、溶解液の溶解分率)をクリアします。超遠心回転子とチューブの詳細については、資料表を参照してください。細胞抽出物の場合、遠心分離後に白い浮遊層が形成されることがよくあります。この浮遊層は上清と共に、チューブリン重合を妨げるので転写しないでください。長い20Gまたは21Gの針に取り付けられた適切なボリュームの注射器を使用して、浮遊層を邪魔することなく優しく上清を除去します。上清がまだ曇っている場合は、5,000×gで遠心分離機、4°Cで10分間。
    2. 上清(SN1)を超遠心チューブに移し、その体積をメモします。10 mLのセルペレットの場合、SN1の体積は〜12 mLと期待されます。
    3. SN1の1/100体積 (SN1の12mLのための120 μL)を取り、2xレムリバッファーの同じ容積を加え、5分間沸騰し、さらに分析のために-20°Cで保存します。
    4. SN1 と同じボリュームを使用して、BRB80 (材料表) のペレット (P1) を再懸濁します。P1の1/100体積 (P1の20mLのための200 μL)を取り、2xレムリバッファーの同じ容積を加え、5分間沸騰し、さらに分析のために-20°Cで保存します。
  2. 低モルティリ度バッファーにおける第1重合
    1. SN1(12 mL)の1体積、0.2M GTP(60μL;最終濃度1mM)の1/200体積 、適当な体積のスクリューキャップチューブ内の0.5体積のプリ加熱グリセロール(6mL)を組み合わせて重合ミックスを調製します。
      注:グリセロールは、プロトコル全体の重合ステップで混雑剤として使用され、したがって、他の成分の濃度の計算では考慮されません。
    2. ピペットは上下に混合し、気泡の形成を避け、適切な超遠心チューブに移します。
      注:ミックスをチューブに転送しながら、チューブの重量を(ペアで)調整します。これにより、実験者は、重合工程後の微小管の沈降に直接進むことができます。プロトコル全体のすべての重合ステップでこれを行います。
    3. パラフィルムでチューブを覆い、30°Cに設定されたウォーターバスに移し、20分間インキュベートします。
    4. チューブを150,000×g、30°Cで30分間遠心します。上清(SN2)を取り除き、重合した微小管(P2)のペレットを保持する。
      メモ:微小管ペレットは、スナップ冷凍することができ、1年まで-80°Cで保存することができます。
    5. SN2の1/200第 1量(18 mL SN2のための90 μL)を取り、2xレムリバッファーの同じ容積を加え、5分間沸騰し、さらに分析のために-20°Cで保存します。
  3. 第1の脱重合
    1. ペレットP2に氷冷BRB80を加えて微小管を脱重合し、5分間氷上に放置します:細胞からのチューブリンの場合は1/60th(200 μL)を加え、脳からチューブリンの場合はSN1の体積の1/20(600 μL)を加えます。
      注:脱重合工程中にペレットに添加される氷冷BRB80の体積は、常にSN1の体積に対して相対的です。
    2. 溶液が完全に均質になるまで、気泡を避けて、微小管ペレットを穏やかに再懸濁します。ピペット数サイクルにp1000チップを使用し、その後5分ごとにp200チップを20分間使用します(ピペット処理の5サイクル)。これは、チューブリン精製の成功のための重要なステップです。
    3. 溶液を適切な超遠心チューブに移し、150,000×g、4°Cで20分間スピンダウンします。SN3を新しい1.5 mL超遠心チューブに移します。この遠心分離工程(P3)の後に形成されたペレットには、沈殿タンパク質(微小管関連タンパク質またはLIP)および非脱重性微小管が含まれています。上清(SN3)は、可溶性成分を含んでいる:脱重合されたチューブ状素子およびMAPsは、脱重合された微小管から剥離している。
    4. SN3を1~4μLとし、9体積の2xレムリバッファーを加え、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
    5. B80(同じ容量のSN3)のペレットP3を再び中断し、1~4μLを取り、2x Laemmliバッファーを9巻追加し、5分間沸騰し、-20°Cで保管します。
  4. 第二重合(高モルリティバッファー内)
    1. 1体積のSN3(200 μL)、1体積の予熱1Mパイプ(200μL、最終濃度0.5M)、0.2M GTP(2μL、最終濃度1mM)、適当な体積のチューブ内に1ボリュームのプリ加熱グリセロール(200μL)を組み合わせて重合ミックスを調製します。
    2. ピペットは上下に混合し、気泡の形成を避け、超遠心チューブに移します。
    3. パラフィルムでチューブを覆い、30°Cに設定されたウォーターバスに移し、20分間インキュベートします。
    4. チューブを150,000×g、30°Cで30分間遠心分離します。上清(SN4)を取り除き、重合した微小管(P4)のペレットを保持する。ペレットP4は重合された微小管を含み、上清SN4には非重合チューブ、MAP、および他の可溶性タンパク質が含まれています。
      注:2回目の重合工程後の微小管ペレットは、スナップ凍結し、-80°Cで最大1年間保存することができます。
    5. 1~4 μLを取り、9体積の2xレムリバッファーを追加し、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
  5. 第2の脱重合
    1. ペレットP4に氷冷BRB80を加えて微小管を脱重合し、5分間氷上に放置します:細胞からのチューブリンの場合は1/100th(120 μL)を加え、脳からチューブリンの場合はSN1の体積の1/40(300 μL)を加えます。
    2. ピペットは、5分ごとにp200チップで上下に、20分間(ピペットの5サイクル)を行います。
    3. 溶液を1.5mL超遠心チューブに移し、150,000×g、4°Cで20分間スピンダウンします。SN5を新しい1.5 mL超遠心チューブに移します。この遠心分離工程(P5)の後に形成されたペレットは非脱重性微小管を含有する。上清(SN5)は、可溶性の尿細管を含有する。
    4. 1~4 μLを取り、9体積の2xレムリバッファーを追加し、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
    5. ペレットP5をBRB80(同じ容量のSN5)で再懸濁し、1~4μLを取り、9体積の2xレムリバッファーを追加し、5分間沸騰し、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
  6. 第三重合(低モルリティバッファー内)
    1. 重合ミックスを調製:SN5(120 μL)の1/200第 1体積(0.6μL、最終濃度は1mM)、適当な体積のチューブ内のプリ加熱グリセロール(60μL)の0.5体積。
    2. ピペットは上下に混合し、気泡の形成を避け、適切な超遠心チューブに移します。
    3. パラフィルムでチューブを覆い、30°Cに設定されたウォーターバスに移し、20分間インキュベートします。
    4. チューブを150,000×g、30°Cで30分間遠心分離します。ペレット(P6)は、重合微小管を含有し、上清SN6は、非重合チューブリンの少量を含む。
      メモ:微小管ペレットは、スナップ冷凍することができ、1年まで-80°Cで保存することができます。
    5. 1~4 μLを取り、9体積の2xレムリバッファーを追加し、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
  7. 第3の脱重合
    1. ペレットP6に氷冷BRB80を加えて微小管を脱重合し、5分間氷上に放置します:細胞からのチューブリンの場合は1/100th(120 μL)を加え、脳からチューブリンの場合はSN1の体積の1/40(300 μL)を加えます。
    2. ピペットは、5分ごとにp200チップで上下に、20分間(ピペットの5サイクル)を行います。
    3. 溶液を適切な超遠心チューブに移し、150,000×g、4°Cで20分間スピンダウンします。SN7を新しい1.5 mL超遠心チューブに移します。ペレット(P7)は、非非重合性微小管を少量含む。上清(SN7)は、排他的に脱重合された微小管(可溶性チューブリン)を含む。
    4. 1~4 μLを取り、9体積の2xレムリバッファーを追加し、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
    5. ペレットP7をBRB80(同じSN7の体積)で再懸濁し、1~4μLを取り、9体積の2xレムリバッファーを加え、5分間沸騰させ、-20°Cで保存してさらなる分析を行います。
    6. チューブリンの量を定量化 ( 代表的な結果を参照)、アリコート SN7 を少量にし、スナップ凍結し、-80 °Cで保管します。

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結果

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この方法の主な目的は、精製された成分を使用して繰り返しインビトロ実験を行うのに十分な量の高品質でアセンブリに有能なチューブリンを製造することです。この管状から組み立てられた微小管は、動的または安定した微小管を用いた全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡技術に基づく再構成アッセイに用いることができ、微小管ダイナミクス、MAPsまたは分子モータとの相互作用、およびモータ25による力発生を試験する実験において。それらはまた、微小管MAP共ペレットアッセイおよび固体NMR分光法28に使用することができる。

精製プロセス全体を通して尿細管の濃縮および純度は、クーマッシー染色SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲル、好ましくは「TUB」SDS-PAGEゲルを用いて監視することができ、αおよびβチューブリンの分離を可能にする、古典的なゲル32の単一バンドとして共に移行する。異なるステップで採取されたライセート(最後の脱重合を除き、プロトコルを参照)...

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ディスカッション

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ここで説明する方法は、細胞株および単一マウス脳から中量で高品質で組み立て能力の高いチューブリンを迅速に生成するプラットフォームを提供する。これは、長年の分野で使用される牛の脳からの尿細管浄化の金標準プロトコルに基づいています16,17.このアプローチの特に利点は、HeLa S3細胞の懸濁培養物の使用であり、一度確立されると、実践的な時間をほとんど必要とせずに大量の細胞を生み出す。これは、プロトコルは、任意の細胞生物学の研究室で比較的簡単に実行することができます, 他のチューブリン精製方法18,19,32,37特定の機器や専門知識を必要とし、したがって、タンパク質の浄化の強力な背景を持つ研究所によって主に使用されています.接着性細胞株から小量のチューブリンを製造する場合...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、ANR-10-IDEX-0001-0001-02、LabExセルンスケールANR-11-LBX-0038、コンバージェンス研究所Q-life Q-life QR-17-CONV-0005によって支えられました。CJはキュリー研究所によってサポートされています, フランス国立研究庁(ANR)は、ANR-12-BSV2-0007およびANR-17-CE13-0021、国立がん研究所(INCA)補助金2014-PL BIO-11-ICR-1を授与し、フォンダシオンはラ・レシェルシュ・メディカル(FRM)助成金DEQ20170366666666666666666666666年MMMはフォンダシオン・ヴァインクレ・アルツハイマー助成金FR-16055p、およびフランスのアルツハイマー付与AAP SM 2019 n°2023によって支えられている。JASは、マリー・スクウォトフスカ・キュリー交付金第675737の下で欧州連合のホライゾン2020研究・イノベーションプログラムによって支援され、FRM助成金FDT201904008210。SB は FRM グラント FDT201805005465 によってサポートされました。

私たちは、ジャンケ研究所、特にJ.スープロン、G.ラキシック(MICALIS、アグロパリテック)とA.ゴートロー(エコールポリテクニック)のすべてのメンバーに、プロトコルの確立中に助けてくれてありがとう。私たちは、マウスの繁殖とケアの助けのためにキュリー研究所の動物施設に感謝したいと思います。

J.フランケルとM.ネルソンによって開発された抗体12G10は、NICHDの後援の下で開発された発達研究ハイブリドーマ銀行から取得され、アイオワ大学によって維持されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 M MgCl2 Sigma#M1028
1-L細胞培養容器Techne F7610 スピナーカルチャーに使用されます。空のスピナーボトルをかき混ぜないでください。スピナーボトルが細胞培養インキュベーター内にある場合は、インキュベーターで培地の平衡化を促進するために、スピナーボトルの側弁を常にわずかに開いたままにしてください。の雰囲気。使用後は、ボトルの壁に残っているセルが乾燥しないように、スピナーボトルにすぐに水道水を入れてください。脱イオン水でボトルを洗い、アプリ200mlの脱イオン水とオートクレーブを加えます。無菌細胞培養フードの下で水を取り除き、ボトルをフードの下で数時間完全に乾かします。スピナーボトルの洗浄に洗剤を使用しないでください。
1.5mlおよび2mlチューブ
14ml丸底チューブ
直径15cmの滅菌培養皿
15mlスクリューキャップチューブ
2-メルカプトエタノール シグマ #M31482-メルカプトエタノールは有毒であり、ボンネットの下で使用する必要があります。
4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフッ化物 シグマ 
アミド40% バイオ・ラッド #161-0140
5、10、20 mlシリンジ
5 ml、10 ml、25 ml 滅菌ピペット
50 ml スクリューキャップチューブ
過硫酸アンモニウム (APS)Sigma#A3678
抗α-チューブリン抗体、12G10 J. Frankel と M. Nelson によって開発され、Developmental Studies Hybridoma Bank から入手され、NIC の後援の下で開発され、アイオワ希釈: 1/500
抗グルタミル化チューブリン抗体、GT335 アディポジェン #AG-20B-0020倍率:アプロチニン20,000分の1
 シグマ 
天びん(0.1 – 10 g)
ベックマン1-lポリプロピレンボトル スピナー培養物の収集用
ベックマン アバンティ J-26 XP 遠心分離機スピナー培養物の収集用
生物学的攪拌機 テクネ MCS-104L 細胞培養インキュベーター(スピナー培養用)に設置、Hela S3およびHEK 293細胞用に25 rpm
Bis N,N'-Methylene-Bis-アクリルアミド バイオ・ラッド #161-0201
ブレンダー イカ ウルトラトラックス® 脳組織の溶解には、5mmプローブを使用し、マシンを出力6または7に設定します。氷上で脳組織を2〜3回15秒間ブレンドします。
ウシ血清アルブミン(BSA)Sigma 
ブロモフェノールブルー シグマ #1.08122
カルボキシペプチダーゼA(CPA)Sigma#C9268濃度:1.7 U/µl
細胞培養フード
細胞培養インキュベーターは37°Cに設定。C、5%CO2
ジメチルスルホキシド(DMSO) シグマ #D8418DMSOは、他の化合物の細胞透過性および皮膚透過性を高めることができます。接触を避け、皮膚と目の保護具を使用してください。
DMEMミディアム ライフテクノロジーズ #41965062
DTT、DL-ジチオスレイトール シグマ 
EDTAEuromedex#EU0007-C
EGTASigma 
エタノール絶対 フィッシャーケミカル #E/0650DF/15
ウシ胎児血清(FBS)Sigma 
#F7524 フランス製圧力セルプレス サーモエレクトロンコーポレーション #FA-078A、#FA-032セル、大量の細胞を溶解します。中程度の比率で設定し、ゲージ圧は1,000 psi(ディスラプションチャンバー内の3,000 psiに相当)です。
グリセロール VWRケミカルズ #24388.295
グリシンシグマ#G8898
GTP シグマ 
ヒーティングブロック スチュアート 
Hela細胞 ATCC®CCL-2&トレード;
Hela S3細胞 ATCCATCC®CCL-2.2&トレード;
塩酸(HCl)VWR#20252.290
倒立顕微鏡 細胞トランスフェクションを検証する場合は蛍光で
イソプロパノール VWR #20842.298
jetPEIポリプラス #101
JLA-8.1000ローター スピナーカルチャーKOH
 シグマ #P1767KOHは腐食性があり、火傷の原因となりますので、目や皮膚の保護具を使用してください。
L-グルタミン ライフテクノロジーズ #25030123
50mlチューブ用実験室用遠心分離機Sigma4-16 K 
ロイペプチン シグマ#L2884
液体窒素 
マイクロピペット p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
MicropestlesEppendorf#0030 120.973
マウス脳組織 この研究のための動物の世話と使用は、欧州共同体(2010/63/UE)の推奨事項に従って行われました。実験手順は、キュリー研究所の倫理委員会によって特に承認されました CEEA-IC #118 (認可番号04395.03 国家当局によって与えられた) 国際ガイドラインに準拠して
針18G X 1 ½”(1.2 X 38テルモ#18G
ニードル20G×1 ½”(0.9 X 38ミリメートルテルモ#20G
針21G×4 ¾”(0.8×120ミリメートルB.ブラウン#466 5643
パラフィルム
PBS ライフテクノロジーズ #14190169
ペニシリン-ストレプトマイシン ライフテクノロジーズ #15140130
pHメーター
ニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF)Sigma #P7626PMSF粉末は危険です。PMSF溶液を調製する際には、皮膚と目の保護具を使用してください。
パイプ シグマ 
ピペットボーイ
ローターベックマン70.1Ti;TLA-100.3;TLA 55
SDS-PAGE電気泳動装置 バイオ・ラッド 
SDS、ドデシル硫酸ナトリウム VWR #442444Hレンメリ緩衝液の準備用 
SDS、ドデシル硫酸ナトリウム シグマ #L5750「TUB」 SDS-PAGEゲル
ソニケーター Branson#101-148-070接着培養物として増殖した細胞の溶解に使用。直径6.5mmのプローブを使用し、ソニケーターを「「出力制御」1、"デューティサイクル」10%と時間は使用する細胞の種類によって異なります。
1.5 mlチューブ用卓上遠心分離機Eppendorf5417R 
TEMED、N、N、N′、N′-テトラメチルエチレンジアミン Sigma#9281
トリコスタチンA(TSA)Sigma#T8552
トリトンX-100 シグマ 
トリズマベース(トリス)シグマ 
#T1503 トリプシン ライフテクノロジーズ#15090046
超遠心ローター TLA-55、TLA-100.3、70.1 Tiローターは4°Cに設定。Cまたは30°C;実験の必要性に基づくC 
超遠心チューブ ベックマン#357448 TLA-55ローターと併用する場合
超遠心チューブ TLA-100.3ローターBeckman#349622
 ベックマン#355631 70.1 Tiローターと併用
超遠心分離機BeckmanOptima L80-XP(または同等品)およびOptima MAX-XP(または同等品)を4°Cに設定。Cまたは30°C;実験の必要性に基づくC 
ボルテックスミキサー
フローターまたはチューブホルダー30°Cに設定。C 
#A8456 アクリル大学によって維持されています 希釈#A1153で#A7906#D9779#E3889#G8877#SBH130Dの収集に。。ミリメートルフェ#P6757#1658001FC#T9284超遠心チューブで使用するためのを装備したウォーターバス

参考文献

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