このプロトコルは、培養細胞や単一マウス脳などの中小規模の源からのチューブリン精製を、重合および非重合サイクルを用いて記述する。精製されたチューブリンは、特定のアイソタイプで濃縮されるか、または特定の翻訳後修飾を有し、微小管のダイナミクスおよび相互作用を研究するためにインビトロ再構成アッセイで使用することができる。
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方法論記事
重合・脱重合サイクルによる限定的な供給源からの制御された翻訳後修飾と同一型を用いたチューブリンの精製
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
微小管細胞骨格の研究の重要な側面の1つは、インビトロ再構成実験における微小管挙動の研究である。これらは、ダイナミクスなどの微小管の本質的な特性と、微小管関連タンパク質(MAPs)との相互作用を分析することを可能にする。「チューブリンコード」は、微小管の特性および機能の調節因子として、異なるチューブのアイソタイプおよび様々な翻訳後修飾(PTM)を指し示す新しい概念である。チューブリンコードの分子機構を調べるには、特定のアイソタイプとPTMを用いた精製チューブリンを用いたインビトロ再構成実験を行うことが重要です。
現在までに、これはインビトロ実験で広く使用されている脳管状突管として技術的に困難であり、多くのPTMを抱え、定義されたアイソタイプ組成を有する。そこで、重合と非重合サイクルの古典的アプローチを用いて、異なる供給源から、異なるアイソタイプ組成および制御PTMを用いてチューブリンを精製するこのプロトコルを開発しました。アフィニティ精製に基づく既存の方法と比較して、このアプローチは、純粋で重合能力のある管状尿管を生成し、重合または脱重合に耐性のあるチューブリンが連続した精製工程中に廃棄されるようにする。
懸濁液または付着培養物として、そして単一マウスの脳から成長した細胞株からのチューブリンの精製について述べた。この方法は、まず、懸濁および付着性の両方の設定における細胞塊の生成、リシス工程、続いて重合脱重合サイクルによるチューブリン精製の連続段階について説明する。我々の方法は、チューブリンコードが微小管の固有特性および関連タンパク質との微小管相互作用に及ぼす影響に対処する実験に使用できるチューブリンを生み出す。
概要
微小管は、多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たします。彼らは細胞に形状を与え、染色体分離のための大動脈および有糸性紡錘を構築し、細胞内輸送のトラックとして機能する。これらの多様な機能を実行するために、微小管はさまざまな方法で自分自身を整理します。この分野で興味深い質問の1つは、構造的および進化的に保存された微小管が、この多くの組織や機能に適応することを可能にする分子メカニズムを理解することです。潜在的なメカニズムの1つは、「管状コード1、2、3」と呼ばれる概念によって定義される微小管の多様化である。この管状には、αおよびβ-チューブリン遺伝子産物(チューブリンアイソタイプ)を微小管およびチューブリンの翻訳後修飾(PTM)に差動する2つの主要成分が含まれる。
1970年代以降、インビトロ再構成実験は、進化する光顕微鏡技術と組み合わせることで、微小管の特性に関する重要な発見への道を開いてきた:動的不安定性4とトレッドミリング5、およびその他のメカニズムおよび機能6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。
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プロトコル
この研究のための動物のケアおよび使用は、欧州共同体(2010/63/UE)の勧告に従って行われた。実験的手続きは、国際ガイドラインに準拠したキュリーCEEAIC#118(国家当局が与えた承認番号04395.03)の倫理委員会によって明確に承認されました。
1. チューブリン精製用試薬の製造
注:尿細管の精製に使用されるすべてのバッファーは、カリウム塩とナトリウム塩30を含んではなりません。
- 完全な培地の1 Lを準備する:ダルベックの改変されたイーグル培地(DMEM)、10%のウシ胎児血清(FBS、100 mL)、200mM L-グルタミン(2Mストックの10 mL)、および1xペニシリンストレプトマイシン(10mLの100xストック)4 °Cで保管。
- 140gのKOHを水に溶解して10Mの水酸化カリウム(KOH)を調製し、最終体積を250mLに調整し、室温で保存します。
- 0.5 Mエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を調製し、pH8、36.5 gのEDTAを水中に溶解させて、KOH(それ以外の場合EDTAが溶解しない)を用いてpHを8.0に調整し、最終容積を250mLに調整し、フィルター滅菌し、室温で保存する。
- 5 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)EDTA を 5 mL の 0.5 M ....
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結果
この方法の主な目的は、精製された成分を使用して繰り返しインビトロ実験を行うのに十分な量の高品質でアセンブリに有能なチューブリンを製造することです。この管状から組み立てられた微小管は、動的または安定した微小管を用いた全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡技術に基づく再構成アッセイに用いることができ、微小管ダイナミクス、MAPsまたは分子モータとの相互作用、およびモータ25による力発生を試験する実験において。それらはまた、微小管MAP共ペレットアッセイおよび固体NMR分光法28に使用することができる。
精製プロセス全体を通して尿細管の濃縮および純度は、クーマッシー染色SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲル、好ましくは「TUB」SDS-PAGEゲルを用いて監視することができ、αおよびβチューブリンの分離を可能にする、古典的なゲル32の単一バンドとして共に移行する。異なるステップで採取されたライセート(最後の脱重合を除き、プロトコルを参照).......
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ディスカッション
ここで説明する方法は、細胞株および単一マウス脳から中量で高品質で組み立て能力の高いチューブリンを迅速に生成するプラットフォームを提供する。これは、長年の分野で使用される牛の脳からの尿細管浄化の金標準プロトコルに基づいています16,17.このアプローチの特に利点は、HeLa S3細胞の懸濁培養物の使用であり、一度確立されると、実践的な時間をほとんど必要とせずに大量の細胞を生み出す。これは、プロトコルは、任意の細胞生物学の研究室で比較的簡単に実行することができます, 他のチューブリン精製方法18,19,32,37特定の機器や専門知識を必要とし、したがって、タンパク質の浄化の強力な背景を持つ研究所によって主に使用されています.接着性細胞株から小量のチューブリンを製造する場合.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、ANR-10-IDEX-0001-0001-02、LabExセルンスケールANR-11-LBX-0038、コンバージェンス研究所Q-life Q-life QR-17-CONV-0005によって支えられました。CJはキュリー研究所によってサポートされています, フランス国立研究庁(ANR)は、ANR-12-BSV2-0007およびANR-17-CE13-0021、国立がん研究所(INCA)補助金2014-PL BIO-11-ICR-1を授与し、フォンダシオンはラ・レシェルシュ・メディカル(FRM)助成金DEQ20170366666666666666666666666年MMMはフォンダシオン・ヴァインクレ・アルツハイマー助成金FR-16055p、およびフランスのアルツハイマー付与AAP SM 2019 n°2023によって支えられている。JASは、マリー・スクウォトフスカ・キュリー交付金第675737の下で欧州連合のホライゾン2020研究・イノベーションプログラムによって支援され、FRM助成金FDT201904008210。SB は FRM グラント FDT201805005465 によってサポートされました。
私たちは、ジャンケ研究所、特にJ.スープロン、G.ラキシック(MICALIS、アグロパリテック)とA.ゴートロー(エコールポリテクニック)のすべてのメンバーに、プロトコルの確立中に助けてくれてありがとう。私たちは、マウスの繁殖とケアの助けのためにキュリー研究....
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 M MgCl2 | Sigma | #M1028 | |
| 1-L細胞培養容器 | Techne F7610 | スピナーカルチャーに使用されます。空のスピナーボトルをかき混ぜないでください。スピナーボトルが細胞培養インキュベーター内にある場合は、インキュベーターで培地の平衡化を促進するために、スピナーボトルの側弁を常にわずかに開いたままにしてください。の雰囲気。使用後は、ボトルの壁に残っているセルが乾燥しないように、スピナーボトルにすぐに水道水を入れてください。脱イオン水でボトルを洗い、アプリ200mlの脱イオン水とオートクレーブを加えます。無菌細胞培養フードの下で水を取り除き、ボトルをフードの下で数時間完全に乾かします。スピナーボトルの洗浄に洗剤を使用しないでください。 | |
| 1.5mlおよび2mlチューブ | |||
| 14ml丸底チューブ | |||
| 直径15cmの滅菌培養皿 | |||
| 15mlスクリューキャップチューブ | |||
| 2-メルカプトエタノール | シグマ | #M3148 | 2-メルカプトエタノールは有毒であり、ボンネットの下で使用する必要があります。 |
| 4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフッ化物 | シグマ | ||
| アミド40% | バイオ・ラッド | #161-0140 | |
| 5、10、20 mlシリンジ | |||
| 5 ml、10 ml、25 ml 滅菌ピペット | |||
| 50 ml スクリューキャップチューブ | |||
| 過硫酸アンモニウム (APS) | Sigma | #A3678 | |
| 抗α-チューブリン抗体、12G10 | J. Frankel と M. Nelson によって開発され、Developmental Studies Hybridoma Bank から入手され、NIC の後援の下で開発され、アイオワ | 希釈: 1/500 | |
| 抗グルタミル化チューブリン抗体、GT335 | アディポジェン | #AG-20B-0020 | 倍率:アプロチニン20,000分の1 |
| シグマ | |||
| 天びん(0.1 – 10 g) | |||
| ベックマン1-lポリプロピレンボトル | スピナー培養物の収集用 | ||
| ベックマン アバンティ J-26 XP 遠心分離機 | スピナー培養物の収集用 | ||
| 生物学的攪拌機 | テクネ MCS-104L | 細胞培養インキュベーター(スピナー培養用)に設置、Hela S3およびHEK 293細胞用に25 rpm | |
| Bis N,N'-Methylene-Bis-アクリルアミド | バイオ・ラッド | #161-0201 | |
| ブレンダー イカ ウルトラトラックス® | 脳組織の溶解には、5mmプローブを使用し、マシンを出力6または7に設定します。氷上で脳組織を2〜3回15秒間ブレンドします。 | ||
| ウシ血清アルブミン(BSA) | Sigma | ||
| ブロモフェノールブルー | シグマ | #1.08122 | |
| カルボキシペプチダーゼA(CPA) | Sigma | #C9268 | 濃度:1.7 U/µl |
| 細胞培養フード | |||
| 細胞培養インキュベーターは37°Cに設定。C、5%CO2 | |||
| ジメチルスルホキシド(DMSO) | シグマ | #D8418 | DMSOは、他の化合物の細胞透過性および皮膚透過性を高めることができます。接触を避け、皮膚と目の保護具を使用してください。 |
| DMEMミディアム | ライフテクノロジーズ | #41965062 | |
| DTT、DL-ジチオスレイトール | シグマ | ||
| EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
| EGTA | Sigma | ||
| エタノール絶対 | フィッシャーケミカル | #E/0650DF/15 | |
| ウシ胎児血清(FBS) | Sigma | ||
| #F7524 フランス製圧力セルプレス | サーモエレクトロンコーポレーション | #FA-078A | 、#FA-032セル、大量の細胞を溶解します。中程度の比率で設定し、ゲージ圧は1,000 psi(ディスラプションチャンバー内の3,000 psiに相当)です。 |
| グリセロール | VWRケミカルズ | #24388.295 | |
| グリシン | シグマ | #G8898 | |
| GTP | シグマ | ||
| ヒーティングブロック | スチュアート | ||
| Hela細胞 | ATCC®CCL-2&トレード; | ||
| Hela S3細胞 | ATCC | ATCC®CCL-2.2&トレード; | |
| 塩酸(HCl) | VWR | #20252.290 | |
| 倒立顕微鏡 | 細胞トランスフェクションを検証する場合は蛍光で | ||
| イソプロパノール | VWR | #20842.298 | |
| jetPEI | ポリプラス | #101 | |
| JLA-8.1000ローター | スピナーカルチャーKOH | ||
| シグマ | #P1767 | KOHは腐食性があり、火傷の原因となりますので、目や皮膚の保護具を使用してください。 | |
| L-グルタミン | ライフテクノロジーズ | #25030123 | |
| 50mlチューブ用実験室用遠心分離機 | Sigma | 4-16 K | |
| ロイペプチン | シグマ | #L2884 | |
| 液体窒素 | |||
| マイクロピペット p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips | |||
| Micropestles | Eppendorf | #0030 120.973 | |
| マウス脳組織 | この研究のための動物の世話と使用は、欧州共同体(2010/63/UE)の推奨事項に従って行われました。実験手順は、キュリー研究所の倫理委員会によって特に承認されました CEEA-IC #118 (認可番号04395.03 国家当局によって与えられた) 国際ガイドラインに準拠して | ||
| 針18G X 1 ½”(1.2 X 38 | テルモ | #18G | |
| ニードル20G×1 ½”(0.9 X 38ミリメートル | テルモ | #20G | |
| 針21G×4 ¾”(0.8×120ミリメートル | B.ブラウン | #466 5643 | |
| パラフィルム | |||
| PBS | ライフテクノロジーズ | #14190169 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | ライフテクノロジーズ | #15140130 | |
| pHメーター | |||
| ニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF) | Sigma | #P7626 | PMSF粉末は危険です。PMSF溶液を調製する際には、皮膚と目の保護具を使用してください。 |
| パイプ | シグマ | ||
| ピペットボーイ | |||
| ローターベ | ックマン70.1Ti;TLA-100.3;TLA 55 | ||
| SDS-PAGE電気泳動装置 | バイオ・ラッド | ||
| SDS、ドデシル硫酸ナトリウム | VWR | #442444H | レンメリ緩衝液の準備用 |
| SDS、ドデシル硫酸ナトリウム | シグマ | #L5750 | 「TUB」 SDS-PAGEゲル |
| ソニケーター | Branson | #101-148-070 | 接着培養物として増殖した細胞の溶解に使用。直径6.5mmのプローブを使用し、ソニケーターを「「出力制御」1、"デューティサイクル」10%と時間は使用する細胞の種類によって異なります。 |
| 1.5 mlチューブ用卓上遠心分離機 | Eppendorf | 5417R | |
| TEMED、N、N、N′、N′-テトラメチルエチレンジアミン | Sigma | #9281 | |
| トリコスタチンA(TSA) | Sigma | #T8552 | |
| トリトンX-100 | シグマ | ||
| トリズマベース(トリス) | シグマ | ||
| #T1503 トリプシン | ライフテクノロジーズ | #15090046 | |
| 超遠心ローター | TLA-55、TLA-100.3、70.1 Tiローターは | 4°Cに設定。Cまたは30°C;実験の必要性に基づくC | |
| 超遠心チューブ | ベックマン | #357448 | TLA-55ローターと併用する場合 |
| 超遠心チューブ | TLA-100.3ローター | Beckman | #349622 |
| ベックマン | #355631 | 70.1 Tiローターと併用 | |
| 超遠心分離機 | Beckman | Optima L80-XP(または同等品)およびOptima MAX-XP(または同等品) | を4°Cに設定。Cまたは30°C;実験の必要性に基づくC |
| ボルテックスミキサー | |||
| フローターまたはチューブホルダー | 30°Cに設定。C |
参考文献
- Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
- Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Janke, C., Magiera, M. M.
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再版と許可
