ヒト脳組織からのタンパク質の多発反応モニタリングを用いた定量的プロテオミクスワークフロー

サマリー

このプロトコルは、臨床サンプルからのタンパク質の多重反応モニタリング(MRM)のための三重四重極質量分析計の使用を導入することを目的としています。我々は、サンプル調製から臨床サンプルのデータ分析に始まる体系的なワークフローを提供し、必要な予防措置をすべて講じています。

要約

過去10年間の人間の脳組織のプロテオミクス分析は、脳の理解を大きく高めています。しかし、脳関連疾患は世界中の死亡の主要な貢献者であり続け、病態生物学をさらに深く理解する必要性が必要です。西洋ブロッティングや免疫体化学などの従来の抗体ベースの技術は、労働集約的で質的または半定量的であることに加えて、低スループットであることに苦しんでいます。従来の質量分析ベースの散弾銃アプローチでさえ、特定の仮説を裏付ける決定的な証拠を提供することができません。標的プロテオミクスアプローチは、主に仮説駆動であり、長く使用されてきた従来の散弾銃プロテオミクスアプローチとは異なります。多発反応監視は、タンデム四重極質量分析計または三重四重極質量分析計と呼ばれる特殊な質量分析計の使用を必要とするそのような標的型アプローチの1つである。今回の研究では、人間の脳組織を用いたタンデム四重極質量分析ベースのプロテオミクスワークフローを成功させ、より広範な研究コミュニティにこのワークフローを導入することを目的として、主要なステップを体系的に強調しました。

概要

過去10年間、質量分析(MS)の急速な発展とクロマトグラフィー技術の理解の向上が、MSベースのプロテオミクスの進歩に大いに役立っています。西洋ブロッティングや免疫組織化学などの分子生物学ベースの技術は、再現性の問題、ターンアラウンドタイムの遅さ、観察者間変動性、タンパク質を正確に定量化できないことに長い間苦しんできました。このことから、高スループットプロテオミクスアプローチの優れた感度は、細胞内のタンパク質の役割をよりよく理解するための代替的で信頼性の高いツールを分子生物学者に提供し続けています。しかし、ショットガンプロテオミクスのアプローチ(データ依存型取得またはDDA)は、多くの場合、機器の感度と分解能に大きく依存しているだけでなく、複雑な組織の低い豊富なタンパク質を検出することができません。ここ数年、世界中のラボは、これらの高度に複雑なデータセットを処理できるコンピューティングパワーと信頼性の高いソフトウェアを必要とするデータ・インディペンデント・アクイジション(DIA)のような技術を開発してきました。しかし、これらのテクニックはまだ進行中の作業であり、あまりユーザーフレンドリーではありません。標的MSベースのプロテオミクスアプローチは、MSアプローチの高スループット性とELISAのような分子生物学アプローチの感度との間で完璧なバランスを提供します。標的質量分析ベースのプロテオミクス実験では、発見ベースの散弾銃プロテオミクス実験または利用可能な文献^1、2から仮説駆動のタンパク質またはペプチドを検出することに焦点を当てています。多発反応モニタリング(MRM)は、複雑なサンプルからのタンパク質/ペプチドの正確な検出と定量を行うタンデム四重極質量分析計を使用する、このような標的MSアプローチの1つです。この技術は、低解像度の機器を使用する必要があるにもかかわらず、より高い感度と特異性を提供します。

四重極は4つの平行棒から成り、各棒は斜め反対側の棒に接続される。RF電圧とDC電圧を交互に適用することにより、四重極ロッド間に変動分野が生まれます。四重極内のイオンの軌道は、反対側のロッド間に同じ電圧が存在することによって影響されます。RFを直流電圧に印加することにより、イオンの軌跡を安定化させることができる。それは選択的に特定のイオンを通過させることができる質量フィルターとして使用することを可能にする四重極のこの特性である。必要に応じて、四重極は静的モードまたはスキャンモードで動作させることができます。スタティックモードでは、指定されたm/zを持つイオンのみが通過できるため、そのモードは非常に選択的で、対象のイオンに固有のモードになります。一方、スキャンモードでは、m/z範囲全体のイオンが通過します。したがって、タンデム四重極質量分析計は4つの可能な方法で動作することができます:i)第2のスキャンモードで動作している間、静的モードで動作する最初の四重極。ii)第2の静的モードで動作している間、スキャンモードで動作する最初の四重極。iii)スキャンモードで動作する両方の四極子。とiv)両方の四極子が静的モード³で動作します。典型的なMRM実験では、両方の四重極が静的モードで動作し、断片化後に特定の前駆体および生成された製品を監視することができます。これは、技術が非常に敏感かつ選択的になり、正確な定量化を可能にする。

分子生物学者にとって、人間の脳組織とその細胞は宝庫です。人体の常に興味深い器官のこれらの顕著な単位は、その機能に分子および細胞の洞察を提供することができます。脳組織のプロテオミクスの調査は、健康な脳の全身機能を理解するのに役立つだけでなく、いくつかの疾患によって引き起こされたときに調節が不整合になる細胞経路を理解するのに役立つ^{だけでなく、 4.}しかし、そのすべての異質性を持つ脳組織は、分析する非常に複雑な器官であり、分子レベルでの変化をよりよく理解するための協調的なアプローチを必要とします。以下の研究は、脳組織からタンパク質を抽出することから始まる全てのワークフローを説明し、MRMアッセイの方法を作成し、最適化し、標的の検証に向けて説明する(図1)。ここでは、より広範な研究コミュニティに技術とその課題を導入することを目的として、ヒト脳組織を用いたMRMベースの実験の成功に関わる主要なステップを体系的に強調しました。

プロトコル

この研究は、ヒト参加者からの脳組織サンプルを含み、TMHとIITB IECによってレビューされ、承認された- (IITB-IEC/2018/019)。参加者は、この研究に参加するための情報と書面による同意を提供しました。

1 脳組織からのタンパク質抽出

1. 約50mgの脳組織の重量を量り、マイクロピペットを使用して300μLの1xリン酸緩衝液生理塩(PBS)で組織を洗浄する。
   注:このステップは、組織の外表面上の血液を除去するために実行され、必要に応じて繰り返す必要があります。下流のタンパク質推定と処理を妨げるので、組織からできるだけ多くの血液を除去することをお勧めします。
2. PBSでの化流に続いて、組織を含むチューブに300μLの溶精バッファー(バッファA)を加える。バッファAは8 M尿素、50 mMトリスpH 8.0、75 mM NaCl、1 mM MgCl₂ およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(製造業者の指示に従って)を含む。
   注:タンパク質の収量は、サンプルが保存される条件、出発物質の量、および処理中のサンプルの取り扱いの効率に至るまで、いくつかの要因によって異なります。50 mg 未満の組織の量を処理する場合、バッファー A の量を比例的に減らします。
3. 氷浴にチューブを保ちながら、プローブ超音波処理器を使用して組織をライゼします。超音波処理のために次のパラメータを使用してください:40%の振幅、2:30分のサイクルのオンとオフ5秒。
4. ビーズビーターを使用して組織を均質化し、組織を完全に分解します。
   注:このステップは、90秒間中速で実行し、その後氷上で3〜5分間インキュベーションを行う必要があります。
5. チューブの内容物を6,000xgで4°Cで15分間遠心分離します。 上清を新鮮なチューブに移し、均質に混ぜます。
   注:サンプルのアリコートを作成し、さらに使用するまで-80°Cで保存してください。

2 タンパク質定量と品質チェック

1. BSAの既知の濃度で作られた標準的なグラフを使用して消化前のサンプルを定量化します。
   注:タンパク質推定に使用されているアッセイが、タンパク質のライセートを作るのに使用されるバッファーと互換性があることを確認してください。SDS-PAGEゲルを動かしてタンパク質のライセートの品質を確認します。

3 タンパク質消化

1. マイクロ遠心分離管に50μgのタンパク質を取り、最終的な濃度が20mMになるようにトリス2カルボキセチルホスフィン(TCEP)を添加してタンパク質を減少させます。37°Cで1時間インキュベートする。
2. インキュベーション後、その最終濃度が40mMになるようにチューブにヨウドアセトアセトアミド(IAA)を添加して還元タンパク質をアルキル化する。30分間暗い中でチューブをインキュベートします。
   注:チューブに追加する直前にIAAを準備してください。
3. チューブ内の尿素の最終濃度が1M未満になるように還元およびアルキル化タンパク質を含むチューブにバッファーBを加える。
   メモ:バッファBは25 mMトリ(pH 8.0)と1 mM CaCl₂ で構成され、サンプルを希釈するために使用されます。希釈時に、トリプシンを添加した後の最適なタンパク質消化のために、チューブの内容物が8のpHを有することを確認してください。
4. タンパク質比に1:30酵素にトリプシンを加え、一定の揺れで37°Cで一晩チューブをインキュベートします。
5. 消化後、消化された製品を真空濃縮器に濃縮します。このステップでは、ペプチドを再構成して脱塩するか、将来の使用のために-80°Cで保存することができます。

4 脱塩・ペプチド定量

注:LC-MS/MSのサンプルをロードする前に脱塩またはペプチドのクリーンアップが不可欠です。このプロセスは、市販のC18ステージチップまたはカラムを用いて行うことができる。

1. 20 μLのアセトニトリル(ACN)を0.1%のギ酸(FA)で活性化します。1,000 x gで内容を1分間遠心し、流れを捨てます。
   注意:遠心分離の条件は、手順の最後まで同じです。
2. ステップ 4.1 のように、100% ACN を 0.1% FA に 20 μL 加え、内容物を遠心分離します。
   注: アクティベーションの手順は、数回繰り返すことができます。
3. 活性化後、ステップ4.1で行ったステージ先端および遠心分離機を通して再構成されたペプチドサンプルの20μLを渡す。
   注: この手順では、フローを破棄しないでください。
4. ステップ 4.3 を少なくとも 5 回の流れで繰り返し、ステージチップへの最大ペプチド結合を確実にします。
5. ステージチップを通して0.1%FAの20 μLを渡し、流れを通して廃棄します。
   注: この手順を 2 回繰り返して、結果を改善します。
6. ACNの増加濃度、すなわち、40%、60%および80%をそれぞれ通過させることによって、新鮮なマイクロフュージチューブ中に結合したペプチドを溶出させる。
7. 真空濃縮器でペプチドを乾燥させ、ペプチド定量を進めます。
8. 乾燥したペプチドを0.1%FAで再構成し、スコープ法⁵を用いて定量化する。

5 確定目標の遷移リストの準備

注: 移行とは、MRM 実験における前駆体(Q1)から製品(Q3)の m/z 値のペアを指します。ペプチドは、同じ Q1 値を持つが、異なる Q3 値を持つ 1 つから多くの遷移を持つことができます。三四重極質量分析計は、ペプチドとその製品を検出するための遷移の情報を必要とします。したがって、対象となる実験を開始する前に、遷移リストを準備する必要があります。これは、SRMAtlas⁶ (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) のオンラインリポジトリまたは Skyline⁷ (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view) と呼ばれるオープンソースソフトウェアを使用して行うことができます。

1. UniProt(https://www.uniprot.org/)から最近のヒトプロテオームFASTAファイルをダウンロードし、スカイラインに挿入してバックグラウンドプロテオームファイルを作成します。ペプチド設定では、 バックグラウンドプロテオーム ドロップダウンに移動し、人間のプロテオームのFASTAシーケンスファイルで[追加]フィードをクリックします。次の手順に進む前に、このデータベースが選択され、切断の許容値が 0 に設定されていることを確認します。
2. 今、ペプチド設定のフィルタタブの下で、8から25アミノ酸に受け入れられたペプチドの長さを区切ります。
3. [ 遷移設定]の [ フィルタ ] タブで [前駆体料金] を 2,3 に設定し、[ イオン料金] を 1 に設定し、[ イオンタイプ] を y に設定します。製品イオンは、ユーザーの選択に応じて選択することができます。特殊イオン の場合は N 端子を 選択し、その他のパラメータはすべてデフォルトのままにします。
   注: ペプチドと遷移の設定は、実験によって異なる場合があります。
4. [ 編集] をクリックして [挿入] に移動し、目的のペプチドまたはタンパク質を 挿入します。タンパク質を挿入し、その加盟IDをコピーし、特定のペプチドを挿入するには、ペプチド配列をコピーします。このソフトウェアは、受話IDをバックグラウンドプロテオームにマッピングし、移行リストはペプチドと遷移設定に基づいて作成されます。
5. 遷移リストをエクスポートします。 [計測器タイプ]のドロップダウンで、適切な計測器が選択されていることを確認します。最適化実験では、Skylineでファイルごとに必要なトランジション数を設定することで、トランジションリストを小さな数値に分割することができます。これにより、1 回の実行で、インストゥルメントが過剰に多くの遷移をスクリーニングすることがなくなります。遷移の数は、単一のメソッドを取得するためにさらに最適化する必要があります - これは、メソッドの絞り込みセクションの下で今後言及します。

6 LC パラメータ

1. 0.1%FA(ソルベントA)を含む水性溶媒と80%ACN(ソルベントB)を含む有機溶媒を含む二分溶媒系を使用してください。
2. カラム温度を45°Cに設定します。
3. LC勾配を450 μL/minの流量で10分に設定します( 表S1に示すように)。

7 MS パラメータ

注:説明アッセイはTSQアルティストリプル四重極質量分析計のために開発され、最適化されています。

1. Q1 および Q3 の解像度、時間とサイクル時間の順に実行するパラメーターを最適化する - 一度に 1 つのパラメーター。Q1 と Q3 の解像度は 0.7 で最も効果的です。サイクルタイムまたはドウェル時間は、遷移の数と監視されているペプチドの平均ピーク幅に応じて微調整する必要があります。
2. 表 S2 および表 S3の MS パラメータを使用します。 メソッドの合計所要時間は 10 分です。
   注: 特に指定がない限り、パラメータはメソッド絞り込みの間および後のすべての実行で同じままです。新しい実験では、サンプルの種類やサンプル処理手順に応じて、特定のパラメータを変更する必要がある場合があります。

8 実行シーケンスと計測器の QC

1. 水の混合物を調製:メタノール:イソプロパノール:アセトニトリル1:1:1:1比で。この混合物をブランクとして使用します。
2. 一貫して機器の性能を監視するために使用することができる任意の標準的なサンプルのためのペプチドを準備します。これはQC標準として使用されます。最適化されたBSAダイジェストからペプチドを検出し、数日間にわたって良好で一貫した応答を与える(図2)。
3. サンプルを実行するには、シーケンスは、QC標準および臨床サンプルの後に、ブランクのカップルで開始する必要があります。2 つの連続したサンプルの間に必ず 1 つのブランクがあることを確認してください。
4. 比較を容易にするために、各サンプルの量と量が毎回均等に注入されるようにしてください。

9 メソッドの絞り込み

1. スカイラインを使用して、プールされたサンプルから得られた予備データを分析します。最適な結果を選択するには、最適なピーク、トランジション、およびピークシェイプや強度などのパラメータを探します。ファイルを新しいスカイライン プロジェクトとして保存します。
2. 最適な一致ピークを見つけるためにライブラリを使用し、その結果、可能な限り最良の遷移リストをお勧めします。ライブラリは、文献または社内の実験から利用できる MS/MS ピークのセットです。
3. 新しく保存した Skyline プロジェクトから新しい遷移リストをエクスポートし、この遷移リストを使用して新しい方法を作成します。作成した新しい方法からデータを取得し、スカイラインを使用してトランジションを調整するプロセスを繰り返します。
4. スカイラインを用いたデータ分析の後にペプチドと遷移のリストが完成したら、サイクルタイムとドウェルタイムの異なる順列を試して方法を微調整します。
   注:重い標識された合成ペプチドとインデックス保持時間(iRT)ペプチドを使用すると、方法の洗練が容易^{になります 8,9}.したがって、これらのペプチドを用いて方法の微調整を行う方がよい。
5. 絞り込み実験の保持時間情報を使用して、スケジュールされた最終メソッドを作成します (取得期間が定義されています)。
6. 個々の被験者のサンプルを準備します。これらのサンプルのデータは、最終的なスケジュールされた方法を使用して取得されます。
7. データが取得されると、Skylineに生ファイルをインポートすることで、さらにダウンストリーム分析とグループ別比較を実行できます。

結果

脳に異常を持つ患者の各群から10サンプル、5サンプルから3つのタンパク質の相対定量を行った。これらのタンパク質には、脳細胞において多様な役割を果たすことが知られているアポリポプロテインA-I(APOA-I)、ビメンチン(VIM)およびニコチンアミドホスホリン酸化転移酵素(NAMPT)が含まれていた。データの実行後の分析は、Skyline-daily(Ver 20.2.1.286)を使用して実行されました。3つのタンパク質に対応する10個のペプチドを合計で監視した。これらには、APOA-I用の3つのペプチド、VIM用の4つのペプチド、NAMPT用の3つのペプチドが含まれていました。これらの10ペプチドからの遷移の総数は57に及んだ。サンプルは、それらが属する状態に応じて、2つのグループのいずれかにグループ化されました。スカイラインのグループ比較機能を用いて、これらのペプチドのピーク満量を比較し、相対定量値を計算した(図3)。

ディスカッション

免疫体化学や西洋ブロッティングなどの技術は、長年にわたりタンパク質標的の検証のための金の基準と考えられていました。これらの方法は、プロトコルのわずかな変更と技術への依存がほとんどない今日でも使用を見つけ、非常に面倒で退屈です。さらに、バッチ間で常に同じ特異性を示すものではなく、多くの専門知識を必要とする高価な抗体の使用も含まれます。さらに、質量分析のような高スループット技術を使用して同定されたタンパク質のごく一部しか、適合性の抗体が利用可能であり、さらに全体の手順を複雑にします。したがって、ターゲットプロテオームアッセイは、ターゲット¹⁰を検証するための新しいアプローチとして徐々に取り上げられています。ターゲット発見の大部分がハイスループットオミクスプラットフォームで起こっているので、検証されたターゲットのパネルは、臨床スクリーニングアプリケーション^11、12、13についても検討されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
<強>試薬
アセトニトリル(MSグレード)	フィッシャーサイエンティフィック	A/0620/21
ウシ血清アルブミン	HiMedia	TC194-25G
塩化カルシウム	ッシャーサイエンフィック	BP510-500
ギ酸(MSグレード)	フィッシャーサイエンティフィ	147930250
ヨードアセトアミド	Sigma	1149-25G
イソプロパノール (MS グレード)	Fisher Scientific	Q13827
塩化マグネシウム	Fischer Scienific	BP214-500
メタノール (MS グレード)	Fisher Scientific	A456-4
MS グレード水	Pierce	51140
リン酸緩衝液生理食塩水	HiMedia	TL1006-500ML
プロテアーゼ阻害剤カクテル	ロシュ ダイアグノスティック	11873580001
塩化ナトリウム	メルク	DF6D661300
TCEP	シグマ	646547
トリス ベース	メルク	648310
トリプシン (MS グレード)	ピアス	90058
尿素	メルク	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18カラム	Thermo	25002-102130
マイクロピペット	ギルソン	F167380
ステージチップ	MilliPore	ZTC18M008
ジルコニア/シリカビーズ	BioSpec 製品	11079110z
Equipment
ビーズビーター(ホモジナイザー)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
マイクロプレートリーダー(分光光度計)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking	Drybath Thermo	88880028
TSQ Altis 質量分析計	Thermo	TSQ02-10002
uHPLC - Vanquish	Thermo	VQF01-20001
真空濃縮器	Thermo	Savant ISS 110