PCR変異生成、クローニング、発現、高速タンパク質精製プロトコルおよびトリプトファン合成酵素の野生型および変異型の結晶化

サマリー

本稿では 、サルモネラ・チフィムリウム・ トリプトファン合成酵素の発現と精製のための一連の連続的な方法を提示し、このプロトコルは、1日でタンパク質複合体を精製するための急速なシステムをコンプする。対象となる方法は、部位特異的変異誘発、 大腸菌におけるタンパク質発現、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および結晶化である。

要約

サルモネラチフィムリウム由来のトリプトファン合成酵素(TS)バイ酵素複合体(α 2 β 2 TS)を用いた構造研究が行われ、その触媒機構、アロステリック挙動、およびPLP依存酵素における生成物への酵素的形変換の詳細を理解することが行われている。本研究では、単離されたαおよび単離されたβサブユニットを生成する新規発現系により、2日以内に分離されたサブユニットから2 β st TS_複合体をα大量に精製した。精製は、アフィニティー・クロマトグラフィーにより行い、続いて親和性タグの切断、硫酸アンモニウム沈殿、およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行った。β部位の酵素における重要な残基の役割をよりよく理解するために、部位特異的突然変異誘発は、以前の構造研究で行われた。野生型および変異型_{α 2st}TS_{複合体βを}精製する別のプロトコルが作成されました。硫酸アンモニウム分画とSECを用いたシンプルで高速かつ効率的なプロトコルにより、1日で2stTS複合体_{α 2 β}精製が可能になりました。この研究で説明した両方の精製プロトコルは、PEG 8000およびシュペルミンを使用して同じ複合体を精製する前のプロトコルと比較して、精製プロトコルに沿って_{α 2 β 2}StTS複合体を結晶化する場合にかなりの利点を有する。野生型および変異型の結晶化は、わずかに異なる条件下で生じ、PEG 8000およびスペルミンを用いた一部の変異体の精製を損なう。X線結晶学研究に適した結晶を調製するために、結晶化、結晶質、および凍結保護を最適化するためにいくつかの努力がなされた。ここで提示される方法は、一般に、2st TS複合体のトリプトファン合成酵素サブユニットおよび野生型および変異型α 2 β 2の精製に適用されるべきである。

概要

トリプトファン合成酵素(TS)バイ酵素複合体(α 2 β 2)は、アクロステリック酵素であり、細菌、植物、および真菌^1、2、3におけるアミノ酸L-トリプトファンの生合成における最後の2つのステップを触媒する。サルモネラ菌腸管腸炎セロバル腸管(St)は、ヒトおよび他の動物において重篤な胃腸感染症を引き起こす。ヒトおよび高等動物はTS(EC 4.2.1.20)を有しないため、S.チフィムリウムα 2 β 2 TS複合体(α 2 β 2StTS)の阻害は、クリプトスポリジウム症および結核^4、生殖器および眼感染症⁵の治療のための潜在的な薬物標的として探求^{されてきた。} αサブユニットは、インドール-3-グリセロールリン酸(IGP)からグリセアルデヒド-3-リン酸(GAP)およびインドールへのアルドー分解切断を触媒し、インドールトタクマー中間体の形成を経て、その後、炭素結合切断を経てGAPとインドール^3,6を生成する。β触媒部位には、シッフ塩基を介してβ-Lys87に結合したピリドキサール5′リン酸(PLP)補因子分子が含まれており、これは酵素βサブユニット^3,7での反応の過程で電子シンクとして機能する。β部位は、L-トリプトファンおよびPLP依存反応中の水分子を与えるためにインドールによるL-セリン側鎖ヒドロキシルの置換を触媒する。セントTSは、多酵素複合体^2,3内における基質チャネリングおよびアロステリック通信の調査のための長年のモデルとして機能する。TSのαとβサブユニット間の双方向のアロステリック通信は、触媒ステップを同期させ、L-トリプトファン合成中のインドール放出を防止するために必要である^3。この取り組みを拡張するために、StTS βサブユニットの触媒部位における酵素構造、メカニズムおよび機能の関係をさらに探求するために、単一点突然変異(β-Gln114Ala、β-Lys167Thr、およびβ-Ser377Ala)によっていくつかの変異体を調製しました。

α₂β₂StTS の触媒機構に関する詳細な研究は、エディス W. マイルズの研究グループによって開始されました。天然大腸菌_{α 2 β 2}TS複合体を用いた初期の研究は、単離されたαサブユニット^8、9、単離βサブユニット^10、11、およびα 2 β 2TS複合体の分離サブユニット¹²からの再構成の精製および特徴付けに焦点を当てている。精製は硫酸アンモニウム沈殿、サンプル透析、DEAE-セファデックスクロマトグラフィー、透析、およびDEAE-セファデックスカラム¹²上の第2のクロマトグラフィーラウンドによって行った。別のプロトコルでは、同じ複合体の精製は、明確化された細胞リセートをDEAE-Sephadexカラムにロードし、続いてセファローズ4Bカラムにクロマトグラフィーステップを行い、硫酸アンモニウム沈殿および透析¹³を行うことで改善された。両方の精製プロトコルは4〜5日間続きます。エシェリヒア・コリ_{α 2 β 2}TS錯体が結晶化したが、当時のX線回折には結晶が適していなかった。

新規研究では、S.チフィムリウム_{α 2 β 2TS}複合体の組換えおよび野生型形態を精製し^、14,15を結晶化した。組換えα 2 β 2St TS複合体は、pEBA-10発現ベクターを担持した大腸菌株CB149において過剰発現した。初期結晶化およびX線回折データの収集_と分析2stTS複合体β α 2の収集と分析は^、14を報告した。しかし、2 β 2StTS結晶αのような長くて細い針は構造研究を損なった。より良いX線回折データを収集する試みにおいて、α 2 β St TS複合体¹⁵の野生型および変異型を精製する別の精製プロトコルが記載された。精製は、スペルミンおよびPEG8,000を用いた初期沈殿を用いて精製した細胞リセートに行い、遠心分離により大きなかさばる沈殿物を除去した。高量の_{α 2 β 2St}TS複合体を含む上清画分を、黄色の結晶が析出するまで4°Cで16〜48時間保存した。結晶を洗浄し、異なるバッファーに対して広範囲に透析した。タンパク質複合体は、硫酸アンモニウムを含む緩衝液中で再結晶化し^、15.15を透析した。タンパク質の結晶化は、溶液中のタンパク質および沈殿物濃度に依存するが、α 2 β 2StTS複合体の他の変異型の精製を、溶液中で監視、予測、再生することは困難である。このプロトコルには、クロマトグラフィー法を使用しないという利点があります。しかしながら、欠点は、結晶化、透析、再結晶化に必要な長い精製時間であり、典型的には5〜7日を要する。X線データ収集に適した結晶を得るために、600以上の結晶化条件を、タンパク質濃度、温度、沈殿物(PEG4,000、6,000、および8,000)の組み合わせおよび変動を用いて評価^した。結晶はより良い結晶形態を持ち、12%PEG 8,000および2 mMのスペルミンを含む条件でより速く成長した。結晶化は4、30、または42°Cではなく25°Cでより好ましく、3日以内に最大寸法¹⁵に成長した。当時の_{α 2 β 2}StTS結晶構造(1996-1999)16、17、18、19、20、21、その他多くの構造がこれまでに発表されています。

ここで、主な目的は、トリプトファン合成酵素を精製し、タンパク質の結晶化を最適化するための代替プロトコルを提示することです。本研究は、野生型単離αサブユニット(α St TS)、単離βサブユニット(β St TS)、2 β 2stTS複合体 αを単離されたサブユニットから再構成し、α 2 β 2St TS複合体の野生型および変異型を精製するための有意な改善を示す。 精製時間が大幅に短縮され、結晶化と凍結保護が最適化されるため、過去のプロトコルに対する利点はかなり高いものです。本研究で設計されたα 2 β 2St TS複合体の変異型は、野生型形態に使用される同じ条件付近で結晶化している。しかし、微細結晶化最適化は、原子分解に近いところで構造決定に十分な品質の大きな単結晶を得る必要があった。現在までに、タンパク質データバンク(PDB)に堆積した134のトリプトファン合成酵素結晶構造があり、細菌、古細菌および真核生物に関してそれぞれ101、31、2の結晶構造を考慮しています。うまく、73の構造はS.エンテラバーチフィムリウムに属し、α 2 β 2StTS複合体の5つの結晶構造は1.50オングストロームよりも高い解像度制限を有する。当然のことながら、4アウト5は、私たちの研究グループ(PDB ID:5CGQは1.18 Å、4HT3は1.30 Å、4HPJは1.45 Å、6DZ4は1.45 Å解像度で)で作成されました。2stTS複合体α 2 βの変異型の洗練された結晶構造は、L-トリプトファン合成に関与する必須アミノ酸残基が果たすメカニズムおよび役割に関する新たな洞察を提供することが期待される。

プロトコル

1. αおよびβサブユニットと再結合された_{α 2β}StTS 複合体を浄化するための高速プロトコル

1. pETSUMO発現ベクターにサブクローニングするDNA
   1. pEBA-10発現ベクター²²にクローン化されたサルモネラ・腸膜腸筋腸球菌からトリプトファンシンターゼのα−およびβ-サブユニットをコードする翻訳結合遺伝子(trpAおよびtrpB)を得る。pEBA-10 ベクターを DNA テンプレートとして使用します。
      注:または、以下に記載されているプライマーは、 サルモネラ腸内腸 球性皮内 腸球体 ゲノムから両方の遺伝子を増幅するために使用することができます。分子生物学のステップはすべて、「分子クローニング:実験室マニュアル^23」に記載されているように従った。
   2. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、セントTS-FW-BamおよびαセントTS-Rev-Eco αプライマーを使用してα-subunit(α St TS)の全長ポリヌクレオチド配列を個別に増幅し、β-subunit(βStTS)の全長配列をセントTS-FW-BamとβセントTS-Rev-Hind β βします。約55°Cの溶融温度と2分のポリメラーゼ延長時間を使用してください。
      1. 高忠実度のDNAポリメラーゼ(例えば、Phusion)とメーカーのプロトコルを使用してDNA配列を増幅します。50 μL PCR 反応に加えてヌクレアーゼを含まない水 34 μL、5x 反応バッファー 10 μL、1μL の 10 mM フォワードプライマー、1 μL の 10 μM 逆プライマー、1 μL のテンプレート DNA (200 ng)、1.5 μL の DMSO、0.5 μL のポリメシアプライヤを加えます。
      2. PCR プログラムでは、ホット スタート(98 °C で 180 秒)、30 回の増幅サイクル(98 °Cで 30 秒、55 °Cで 30 秒、72 °Cで 120 秒)、および最終延長 (72 °C で 300 秒) を使用します。
         注:斜体のシーケンスは、それぞれ 、BamHI、 エコRI、 バムHIと ヒンドIII制限サイトに対応しています。PCR断片の末語に近い酵素切断効率は、余分な塩基(小文字配列)を添加することによって増強された。
         αセントTS-FW-バム:5'cgcGGATCCATGGAACTACGAAA-3′
         αセントTS-レヴエコ:5'ccgGAATTCTTATGCGCGGGGGGC-3′
         βセントTS-FW-Bam:5'cgcGGATCCATGACAACTCTCAAC-3′
         βセントTS-レヴ・ヒンド:5'-cccAAGCTTTCAGATTCCCCTC-3′
   3. PCR産物を1x TAEバッファー(40mMトリス、20mM酢酸、1 mM EDTA)の6V/cmでPCR産物をロードし、目的のDNAバンドを抽出し、メーカーの指示に従ってシリカビーズキットを使用してPCR断片を精製します。
      1. 適切な制限酵素と37°Cで2時間メーカーが推奨する条件で、各DNA断片の少なくとも200 ngを消化します。
      2. 50 μL制限消化反応を設定するには、ヌクレアーゼを含まない水を34 μL、DNA 10 μL(200 ng)、10x反応バッファーの5 μL、0.5 μLの制限酵素1、および0.5 μLの制限酵素2を加える。
      3. 6 V/cmで1x TAE上の0.8%アガロースゲルに消化産物をロードし、ゲル抽出物、およびゲルは、市販のキットを使用して消化断片を精製します。
   4. サブクローンは、各断片を個々に 大腸菌 発現修飾ベクターpET SUMOに、あらかじめ適切な酵素で消化し、ゲルを精製した。
      注: このベクトルは、商用 pET SUMO の修正版です。このベクターは制限酵素クローニング用に最適化されています。pET SUMOクローニングサイトにpET 28bベクター(バムHI、エコRI、サックI、サルI、ヒンドIII、NotI、およびXhoI)のマルチクローニングサイト(MCS)を挿入しました。このベクターには、スモールユビキチン様修飾タンパク質(SUMO)および複数のクローニング部位を有するフレーム内のN末端6x-ヒスチジンタグが含まれています。
   5. リゲート100ngの改変pET SUMOと50ngのPCRフラグメントをT4 DNAリガーゼで25°Cで2時間用いた。
   6. 構築されたプラスミドを大腸菌株DH10B α細胞の有能な細胞に変換する。35 μg/mLカナマイシンを含む LB寒天プレート上のプレートセル。プレートを37°Cで一晩反転してインキュベートする。
   7. 各変換から単一のコロニーを選択し、超純粋なプラスミドDNAを調製し、DNAシーケンシングを行い、α StTSまたはβ StTSがN末端His6-SUMOタグでフレームにクローン化されたことを確認します。
      注:細胞培養のグリセロールストック(菌性グリセロールの16%最終濃度で細胞懸濁液を回す)を準備し、-80°Cで長期間保存してください。
   8. 発現プラスミドをスモ-α StTSまたはSUMO-β St TSを、T7プロモーターベースのシステムを用いて大腸菌発現株ロゼッタ(DE3)pLysSの有能な細胞に個別に変換する。 35 μg/mL カナマイシンとクロラムフェニコールを含む寒天プレートに組換え細胞をプレートします。プレートを37°Cで一晩反転してインキュベートする。
   9. コロニー形成に成功した後、1つのコロニー(衛星コロニーなし)を選び、両方の抗生物質で5mLのLB培地に分散させます。培養細胞は37°Cで200rpmで一晩揺動する。
      注:細胞培養のグリセロールストックを準備し、-80°Cで長期保存するか、組み換えタンパク質発現のためにすぐに使用してください。
2. STTSおよび SUMO β st TS サブユニットαSUMO- st TS サブユニットの式
   1. 新鮮な大腸菌株ロゼッタ(DE3)は、スモー-α StTSまたはSUMO-β St TSを含むpLysS細胞は、凍結グリセロールストックの一部を35μg/mLカナマイシンおよびクロラムフェニコールを含むLBの50mL培養物に構築または掻き取る。37°Cで200rpmで揺れ、一晩細胞を成長させます。
   2. 翌朝、2%グリセロールプラスカナマイシンおよびクロラムフェニコール(2.8 Lフェルンバッハフラスコ)を含むLBの新鮮で無菌2x 1000 mLで一晩細胞培養の5mLを接種する。37°Cで200rpmで揺れ、細胞培養を成長させます。
      注:LBブロスでのSUMO-α StTSまたはSUMO-β St TSの発現は、1リットル当たり125〜150mgのタグ付きタンパク質を生み出します。特定の要求を満たすために、プロトコルを上下にスケーリングすることを検討してください。
   3. OD₆₀₀ が0.4mMの最終濃度でイソプロピルβ-D-1チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加し、200rpmで振盪して一晩30°Cでインキュベートを行い、0.6-0.8に達すると組換えタンパク質発現を誘導します。
   4. 4°Cで4000xgで20分間遠心分離して細胞を収穫する。上清を取り除き、冷たいリシスバッファー1(50 mM Tris-Cl、pH 8.0、500 mM NaCl、5%グリセロール、10 mM 2-メルカプトエタノール、および40 mMイミダゾールCl)を含む細胞ペレットを60mLの最終容積まで再懸濁させます。
      注:細胞は、-80°Cで長期保存することも、タンパク質精製のためにすぐに使用することもできます。細胞を保存するには、細胞懸濁液を2 x 50 mLの使い捨て遠心円錐管に分割し、タンパク質精製段階まで細胞ペレットを-80°Cに保ちます。
3. の精製 α- トリプトファンシンターゼのβサブユニット
   注:特に明記されていない限り、すべての手順は4°Cで行う必要があります。精製時間を短縮するために、Ni-NTAアガロース・アフィニティーカラムとサイズ排除カラムをタンパク質精製前または組換えタンパク質発現中にバッファー内で平衡化します。
   1. 1/2"ホーンプローブ(または同様の機器)を備えたデジタルソニファーを使用して超音波処理によって細胞ペレットを破壊する。10 sパルスと20の休息を使用するか、完全な細胞破壊まで、氷水浴の80%振幅デューティサイクルで20サイクルを実行します。
   2. 細胞のリセートを30,000 x g で30分間遠心分離する。吸気上清は、ペレットがチューブから外れないことを保証する。氷上の0.45 μmフィルターユニットで上澄みをフィルターし、15 mL Ni-NTAアガロースニッケル帯電アフィニティーカラムを通して、リシスバッファー1で事前平衡化して流します。
      注:各Ni-NTAアガロースカラムは、SUMO-α StTSまたはSUMO-β StTS組換えタンパク質のいずれかを精製するために使用されます。精製は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムに結合した2x 5 mL Ni-NiTAカラムで行うことができます。一度に1つのタンパク質を精製します。
   3. 100 mLのリシスバッファー 1 に Ni-NTA アガロースカラムを洗浄します。
   4. バッファーE1(25 mM Tris-Clバッファー、pH 7.8、200 mM NaCl、5%グリセロール、および400 mMイミダゾール-Cl)を用いた80 mLのワンステップ溶出を進める。
      注:SUMOプロテアーゼは最大300 mMイミダゾールを許容し、遠心フィルターデバイスの膜は最大100 mMイミダゾールを許容します。大量のイミダゾールを除去し、タンパク質サンプルを希釈し、タンパク質濃度で時間を無駄にする代わりに精製時間を短縮するために、硫酸アンモニウム沈殿を行うことをお勧めします。
   5. 上清分率の初期体積を評価します。25°Cで60%の飽和(39.48 g / 100 mL)に達するまで、一度に少量の硫酸アンモニウムをゆっくりと添加する。30分間溶液を軽くかき混ぜ、泡を避けます。遠心分離機 10,000 x g で 15 分間
   6. 吸気し、上清分を慎重に捨てる。ペレット分率をサンプルバッファーの 20 mL (20 mM トリス Cl、 pH 8.0、300 mM NaCl および 5% グリセロール) で再懸濁します。
   7. SUMO-プロテアーゼによるHIS-SUMOタグ切断の場合、 サッカロミセス・セレビシアeからUbl特異的プロテアーゼ1の組換えフラグメントを1:1000比で添加し、4°Cで2時間インキュベートする。
   8. 消化産物を25°Cで2000xgで遠心分離し、アフィニティークロマトグラフィーカラムを介してサンプルをロードする前にタンパク質凝集体を除去します。
   9. 15 mL Ni-NTA アガロースカラム上に20 mL再懸濁サンプルを渡すHis6-SUMOタグの痕跡を除去し、以前にリシスバッファー1で平衡化した。
   10. タグなしのα StTS またはstTS β含むパススルー サンプルを収集します。
   11. Ni-NTAカラムをバッファ1の20 mLで洗浄し、タグなし のα StTSまたはβ StTSの残り物を収集します。
   12. 4°Cで3,000 x g で回転することにより、15 mL 10 kDa カットオフ遠心フィルターユニットで各サブユニットを別々に濃縮します。 濃縮タンパク質を新たに2.0mLチューブとマイクロ遠心分離機(10,000 x g、10分、4°C)に移し、凝集体を除去します。タンパク質濃度²⁴を決定し、20〜25 mg^mL-1で1mLアリコートを調製し、液体窒素中でラベル、フラッシュフリーズ、-80°Cで保存します。
       注:予精製タンパク質サンプルは、-80 °Cで長期保存することも、サイズ排除クロマトグラフィーカラム(SEC)上でタンパク質精製のためにすぐに使用することもできます。
   13. タンパク質アリコート(20mg)とマイクロ遠心分離機を10,000 x g で10分間服用し、SEC以前の凝集体を除去します。
   14. サイズ除外クロマトグラフィーカラムにサンプルをロードする(例えば、 HiPrep 16/60 セファクリルS-200 HR)は、速タンパク質液体クロマトグラフィーに0.5 mL min-1の流量で結合し、以前はSEC緩衝液(10 mM Tris-Cl、pH 7.8、100 mM NaCl、5%グリセロール、0.1 mMピリドキシスリン酸) で平衡化した。
       注:セントTSまたはβ StTSサブユニットの分離αを高く精製し、SECラウンドの数を減らすには、1.5 mL minの流量でサイズ除外クロマトグラフィーカラムに20〜25 mg mL^-1の5 mLサンプルをロードします。
   15. ピーク画分におけるα StTSまたはβ StTSの品質を評価するには、それぞれ12%または15%のドデシル硫酸ゲル電気泳動(SDS-PAGE)を用いて、クーマシーブリリアントブルーステイン²⁵で染色した。
   16. 新鮮な15 mL 10 kDaカットオフ遠心フィルター単位でタンパク質を濃縮し、タンパク質濃度²⁴を決定し、20〜25 mg mL^-1で0.5 mLアリコートを調製し、ラベル、液体窒素中のフラッシュフリーズ、-80 °Cで保存します。
4. αサブユニットとβサブユニットからの_{α 2 β 2}StTS複合体の精製
   注:サイズ排除クロマトグラフィーカラム(セファデックスS-200 HRまたはスーパーデックス200 pg)をSECバッファ(10 mM Tris-Cl、pH 7.8、100 mM NaCl、5%グリセロール、0.1 mMピリドキサールリン酸)で平衡化します。
   1. αサブユニットとβサブユニットから野生型α 2 β 2StTS複合体を精製するために、α StTSおよびβ StTSサブユニットのサンプルを4°Cで融解する。
   2. アリコート(1.2 α St TS:1.0 β St TSモル比)を組み合わせ、4°Cで1時間インキュベートします。
      注: αStTS の超過分は、β StTS のほとんどが α_{2 β2}StTS 複合体に組み込まれるようにする必要があります。
   3. ミクロ遠心分離(10,000 x g、10分、4°C)でタンパク質凝集体を除去します。
   4. 明確化した上清をサイズ除外列にロードします。
   5. ピーク画分におけるα StTSまたはβ StTSの品質を評価するには、それぞれ12%または15%のドデシル硫酸ゲル電気泳動(SDS-PAGE)を用いて、クーマシーブリリアントブルーステイン²⁵で染色した。
   6. タンパク質濃度²⁴を決定し、15〜20 mg mL^-1で250〜1000 μLアリコートを調製し、液体窒素中のフラッシュフリーズ、-80°Cで保存します。

2. α 2 β St TS複合体の野生型または変異型の精製

1. StTSの変異体を調製するための部位特異的変異β
   1. 構築pEBA-10発現ベクター²² をポリメラーゼ連鎖反応の2段階の間のDNA鋳型として使用して 、β-chainTSポリヌクレオチド配列に特異的なポイント変異を導入する。
      注:このプロトコルは、サルモネラチフィムリウムトリプトファンシンターゼからαまたはβサブユニットに単一点突然変異を導入するために使用することができます。追加のために、望ましい変異を含む新しいオリゴヌクレオチドプライマーは、適宜設計されなければならない。本研究では、Q114A β変異、Β K167T、β S377Aが挙げられている。
   2. ヌクレオチドプライマーTS-FW-NcoI/Q114A-Rev、TS-FW-NcoI/K167T-Rev、およびTS-FW-NcoI/S377A-Revのペアを使用してPCR反応を行い、それぞれA1、B1、C1のフラグメントを生成します。
      注:オリゴヌクレオチドTS-NcoI-FWおよびTS-SacI-Revは、それぞれ、pEBA-10ベクターでクローン化されたαβ StTSポリヌクレオチド配列の上流および下流のアニールを行う。
      1. 高忠実度のDNAポリメラーゼ(例えば、Phusion)とメーカーのプロトコルを使用してDNA配列を増幅します。50 μL PCR 反応の場合、ヌクレアーゼを含まない水 34 μL、5x 反応バッファー 10 μL、10 mM dNTPs 1 μL、1μL の 10 μM フォワードプライマー、1 μL の 10 μM 逆プライマー、1 μLのテンプレート DNA (200 ng)、1.5 μL の DMSO、0.5 μL のポリマーを加えます。
      2. PCR プログラムでは、ホット スタート(98°Cで 180 秒)、30 回の増幅サイクル(98 °Cで 30 秒、55 °Cで 30 秒、72°Cで 120 秒)、最終延長(72°Cで 300 秒)を使用します。
         注:分子生物学のすべてのステップは、分子クローニング:実験室マニュアル²³に記載されているように従いました。小文字のシーケンスは制限部位に対応しますが、太字と斜体のシーケンスは突然変異に対応します。
         TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
         Q114A-Rev: 5'-C アガ GGC GAC GCC GTGGC GC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
         K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT タグ CGT AGC GGA GCC-3'
         S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GcG GCC AGC ギャグ ATT GAC CAC CAG-3'
   3. ヌクレオチドプライマーTS-Rev-SacI/Q114A-FF、TS-Rev-SacI/K167T-FF、およびTS-Rev-SacI/S377A-FFのペアを使用してPCR反応を行い、それぞれA2、B2、およびC2の断片を生成します。
      TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GT GCAC GC GTC GCC TCT G-3'
      K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT CT C CGC GGA GAT AAA G-3'
   4. ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、部分断片を個別に増幅する。55°Cの溶融温度と2分のポリメラーゼ延長時間を使用してください。
   5. PCR反応の第2ラウンドを実行するには、上記のPCR産物を6V/cmの1x TAEに0.8%アガロースゲルにロードし、ゲル抽出物とゲルが目的の断片を精製します。
      1. フラグメントA1/A2、B1/B2、C1/C2を等モル量で別々に混合し、96°Cで10分間熱変性し、25°Cでアニールします。 メーカーのプロトコルに従って、高忠実度ポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドで組換えストランドを拡張します。
   6. 全長変異型DNA断片の高いコピー数を生成するには、オリゴプライマーTS-FW-NcoIおよびTS-Rev-SacIを追加して、2回目のPCRを行う。
   7. PCR産物を6V/cmで1x TAEバッファーに0.8%アガロースに負荷し、目的のDNAバンドをゲル抽出し、PCR断片をゲル化し、製造業者が推奨する適切な緩衝液および条件に従って37°Cで2時間適切な制限消化を進める。
      1. 適切な制限酵素と37°Cで2時間メーカーが推奨する条件で、各DNA断片の少なくとも200 ngを消化します。 50 μL制限消化反応を設定するには、ヌクレアーゼを含まない水を34 μL、DNA 10 μL(200 ng)、10x反応バッファーの5 μL、0.5 μLの制限酵素1、および0.5 μLの制限酵素2を加える。6 V/cmで1x TAEバッファーに0.8%アガロースに消化産物をロードし、消化PCRフラグメントを精製します。
   8. PEBA-10のダイジェスト 200 ng 制限酵素 NcoI と SacI メーカーの勧告に従って.消化産物を0.8%アガロースゲルに6V/cmの1x TAEバッファーにロードし、バンドの特派員をベクターに切り出し、消化されたベクターをゲル化します。
   9. LIgate 100 ngのPCRフラグメントを有するベクターのLIGATEは、以前に消化および精製し、25°Cで2時間T4 DNAリガーゼを用いた。 構築されたプラスミドを有能な細胞に変換します. 50 μg/mL アンピシリンを含む LB寒天プレート上のプレートセル。プレートを37°Cで一晩反転してインキュベートする。
   10. 各細胞変換から単一コロニー(任意の衛星コロニーなし)を選び、アンピシリンを含むLB培地の5mLに分散させます。37°Cで200rpmで揺れ、一晩細胞を成長させます。 各設計された構造から10μgの超純粋プラスミドDNAを調製します。細胞培養物のグリセロールストック(菌性グリセロールの最終濃度16%で細胞懸濁液を回す)を調製し、-80°Cで長期保存する。
   11. DNAシーケンシングを行い、トリプトファン合成酵素のαおよびβサブユニットをコードする全長配列を確認します。個々の個々の突然変異を確認し、望ましくないランダム突然変異を含む任意のプラスミドコンストラクトを廃棄する。本研究で用いたオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りである。
       TS-1F: 5'-アガカアクトクトクトカアク-3'
       TS-1R: 5'-GAAATGCCAACATTAC-3'
       TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
       TS-3F: 5'-ガッツGCAACAGC-3'
       TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
       TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCATCATTG-3'
       注:オリゴヌクレオチドプライマーTS-1F、TS-1R、TS-2F、およびTS-3Fアニールは、βサブユニットのポリヌクレオチド配列上に(GenBankの受付コード:CP051286.1)。αサブユニットのポリヌクレオチド配列上のプライマーTS-4FおよびTS-5Fアニール(GenBank加盟コード:CP053865.1)。
   12. 各プラスミドコンストラクト(pEBA-10-β Q114A、pEBA-10-β K167T、およびpEBA-10-β S377A)の200ngを使用して、大腸菌発現株CB149の有能な細胞を変換し、trpオーペロン²⁶を欠く。コロニー形成に成功した後、1つのコロニーを選び、50 μg/mLアンピシリンを含むLB培地の5 mLで細胞を成長させます。細菌インキュベーター中の培養は一晩で37°Cで行う。細胞培養のグリセロールストックを調製し、-80°Cで長期保存するか、組み換えタンパク質発現にすぐに使用する。
       注:サルモネラチフィムリウムトリプトファンシンターゼからαまたはβサブユニットの単一点突然変異は、大腸菌株CB149におけるL-トリプトファンの酵素機能または低合成を損なう可能性がある。SDS-PAGEゲルで_2stTS複合体が検出された発現量またはα 2 β 2st TS複合体が検出されない場合は、大腸菌株BL21(DE)pLys-Sまたはロゼッタ(DE3)pLys-Sのいずれかを使用することを検討してください。
2. 大腸菌におけるα 2 β 2St TS複合体の野生型と変異型の発現
   1. 50 μg/mL アンピシリンを含む LB 培地の新鮮で無菌 50 mL に望ましい構造を収容する 大腸菌 発現株を成長させます。37°Cで200rpmで揺れ、一晩細胞を成長させます。
   2. 2%グリセロールプラスアンピシリン(2.8 L フェルンバッハフラスコ)を含む LB の新鮮で無菌 2x 1000 mL に一晩細胞培養の 5 mL を加えます。37°Cで200rpmで揺れ、細胞培養を成長させます。
   3. 最終濃度0.4mMでIPTGを添加し、200rpmで振盪して一晩30°Cでインキュベートを行い_、OD600 が0.6-0.8に達すると組換えタンパク質発現を誘導します。
   4. 4°Cで4000xgで20分間遠心分離機で細胞を収穫する。上清を取り除き、冷たいリシスバッファー2(50 mMトリスCl、pH 7.80、100 mM NaCl、5 mMジチオトライトール、1 mM EDTA、および1 mM PMSF)を含む細胞ペレットを50 mLバッファーの最終体積に再懸濁します。
      注:細胞は、-80°Cで長期保存することも、タンパク質精製のためにすぐに使用することもできます。細胞を保存するには、細胞懸濁液を2 x 50 mLの使い捨て遠心円錐管に分割し、タンパク質精製段階まで細胞ペレットを-80°Cに保ちます。LBブロス中の2 β stTS複合体α変異体および野生型の発現は、1リットル当たり125〜150mgのタンパク質を生み出す。特定の要求を満たすために、プロトコルを上下にスケーリングすることを検討してください。
3. 2 stTS複合体の_{α 2 β野生}型または変異型の精製
   注:次のプロトコルは、組換えαの非タグ付き組換え野生型または変異型を浄化することを目的としています。₂β₂Stスキルセットや努力に応じて、1日以内にTSコンプレックス。精製時間を短縮するために、バッファー前のタンパク質精製/発現においてサイズ排除カラムを平衡化する。野生型または変異型αの精製₂β₂StTS複合体は、硫酸アンモニウム分画及びサイズ排除クロマトグラフィーを含む2段階精製によって行われる。このプロトコルは、LB培地の1 Lから純粋な複合体の60-100 mgを生成します。
   1. 1/2"ホーンプローブ(または同様の機器)を備えたデジタルソニファーを使用して超音波処理によって細胞ペレットを破壊する。10 sパルスと20の休息を使用するか、完全な細胞破壊まで、氷水浴の80%振幅デューティサイクルで20サイクルを実行します。
   2. 25°Cで30分間30,000xgで細胞リセートを遠心分離する。 吸気上清は、ペレットがチューブから外れないことを保証する。室温で0.45 μmフィルターで明確化した上清分をフィルター処理します。
   3. 明確化された上清分分率の初期体積を評価します。一度に少量の硫酸アンモニウムをゆっくりと添加し、20%の飽和に達するまで(11.51g/100mL)。硫酸アンモニウム分画を25°Cで行う。 10分間溶液を軽くかき混ぜ、泡を避けます。
   4. 遠心分離機 30,000 x g で 10 分 25 °C. 20%の上清分をきれいなフラスコに移します。サンプルバッファー20mL(50mMトリスCl、pH 7.80、100mM NaCl、1 mM EDTA、および2 mMジチオトレイトールを含む)の20%ペレット分率を穏やかに再懸濁し、サンプルを調製してSDS-PAGEゲルを実行します。20%ペレット分率を捨てます。
   5. 20%上清分の初期体積を評価します。硫酸アンモニウムを30%飽和(5.94g/100mL)に加え、溶液をかき混ぜ、気泡を避け、遠心分離機を以前のように。30%の上清分をきれいなフラスコに移します。20 mLのサンプルバッファー2に30%ペレット分率を緩やかに再懸濁し、サンプルを調製してSDS-PAGEゲルを実行する。30%ペレット分率を捨てます。
   6. 30%上清分の初期体積を評価します。40%の飽和度(6.14g/100mL)に達した硫酸アンモニウムを加え、溶液をかき混ぜ、気泡を避け、遠心分離機を以前のように。40%の上清分をきれいなフラスコに移します。サンプルバッファー2の10mLで40%ペレット分を緩やかに再懸濁し、サンプルを調製してSDS-PAGEゲルを実行する。40%の上清分を捨てます。
      注:12%SDS-PAGE gel25で30%と40%の上清およびペレット分画のサンプルを使用してαβStTS複合体の品質を評価します。任意の他の変異型αβStTS複合体が40%上清分画分であることを確認した場合、硫酸アンモニウム(13.0 g/100 mL)の60%の飽和度で進める。予精製α 2 β 2 StTS複合体の予精製タンパク質アリコートは、-80°Cで長期保存することも、サイズ排除クロマトグラフィーカラム(SEC)上でタンパク質精製のために直ちに使用することもできます。
   7. タンパク質サンプルを10,000 x g、20分でマイクロ遠心分離し、 4°Cをロードし、高速タンパク質液体クロマトグラフィーに取り付けられたHiPrep 16/60 S-200 HRカラムに上清分率をロードし、流速0.5 mL min-1で、以前はSECバッファ(10 mM Tris-Cl、pH 7.8、100 mM NaCl、5%グリセロール)で平衡化 0.1 mMピリドキサールリン酸)。
      注:大量の複雑さを浄化するには、1.5 mL分の流量でHiLoad 26/600 Superdex 200 pg列に20-25 mg mL^-1の5mLサンプルをロードします。
   8. 硫酸アンモニウム分画に沿って採取した試料を、12%SDS-PAGEゲルに対してSECカラムから採取した、クマシーブリリアントブルーステイン²⁵で染色した。
   9. 野生型または変異型α 2 β 2StTS複合体を15 mL 100 kDaカットオフ遠心フィルターユニットで4°Cで3,000 x gで回転させて濃縮します。 濃縮タンパク質を新たに2.0mLチューブとマイクロ遠心分離機(10,000 x g、10分、4°C)に移し、凝集体を除去します。
   10. タンパク質濃度²⁴を決定し、20〜25 mg mL^-1で0.5 mLアリコートを調製し、液体窒素中でラベル、フラッシュフリーズ、および-80°Cで保存します。

3._{α 2β}StTS複合体の野生型と変異型の結晶化を最適化

注_{:α 2 β 2}StTS複合体の初期結晶化条件は、12%PEG 8,000および2 mMスペルミン²²を含む条件で以前に報告されました。

1. 結晶化アッセイの前にストックソリューションを準備し、より良い結晶化再現性を達成します。TSを用いて構造研究を行うために、二酵素複合体の金属配位部位で^Na+ または^Cs+ イオンを用いてタンパク質を結晶化する。
   1. 200 mM のスペルミンの 5 mL ストック溶液を水中に用意し、500 μL のアリコートを-20 °Cに保ちます。
   2. 水で30%(w/v)PEG 8000の50 mLストック溶液を調製し、25 mLの使い捨て遠心分離機円錐形フラスコスコラスコ25 m20 °Cに25 mLアリコートを保管します。
   3. 25 mL ストック溶液を水に入れ、25 °Cに保ちます。
   4. 水で1 M NaClの25 mLストック溶液を調製し、25°Cに保ちます。
   5. 1 M ビシンの 3x 50 mL ストック溶液を調製し、CsOH または NaOH で titrate して、pH 7.6、7.8、および 8.0 でバッファー溶液を得ます。25 mL のアリコートを 4 °Cに保ちます。
2. 氷浴上の_{α 2 β 2}StTS複合体(20〜25mg mL-1)のサンプルを解凍する。
3. マイクロ遠心分離機試料を10,000 x g で25°Cで10分間10分間、タンパク質凝集体を除去した。
4. クリアした上清分をクリーンマイクロ遠心チューブに移します。
5. 推定タンパク質濃度²⁴ および希薄タンパク質アリコート(150-200 μL)で15mg^mL-1 で50mMビシンCsOHまたは-NaOH、50 mM CsClまたはNaClを含むpH 7.8。タンパク質サンプルを25°Cに保ちます。
6. 500 μL リザーバーソリューションを、無菌 1.5 mL ラベル付きマイクロ遠心チューブ内の 3x 24 ウェルの座っているドロッププレート用に準備します。リザーバー溶液には、50 mM ビシン CsOH または -NaOH、50 mM CsCl または NaCl、および PEG 8000 が含まれています。プレート列のPEG 8000(6-11%)の濃度とプレート列のスペルミン(2〜8 mM)の濃度を変化させます。各セットのバッファー pH (pH 7.6、7.8、8.0) を変更します。
7. チューブと渦を少なくとも10秒激しくキャップします。気泡を取り除くために25°Cで10分間10,000 x g の遠心管。 ラベル付けされた各リザーバに500 μLの緩衝液を分配する。
8. P-10マイクロピペットを使用し、各座っているドロップウェルあたり15 mg mL^-1 でタンパク質溶液の5 μLを分配します。気泡を避けてください。各対応リザーバ溶液の5μLをタンパク質ドロップに加えます。混合中の気泡を避け、混合物を均質化するために上下にピペットしないでください。
9. 透明な粘着テープでプレートをテープに貼り、25°Cで保存します。 結晶は2〜5日で現れ、2週間以内に完全な寸法に成長します。

4. X線回折データ収集と_{α 2 β 2}StTS複合構造ソリューション

注:X線回折データ収集の前に、各結晶に対して凍結保護剤溶液を事前に準備してください。特定のリザーバ溶液を使用して、溶液中のdiメチルスルホキシド(10、20、および30%v/v)および特異的リガンド(複数可)を含む3つのアリコートを調製する。ジメチルスルホキシドは、グリセロール、エチレングリコール、およびPEG200-300よりも優れた凍結保護剤であることが判明した。

1. 立体顕微鏡下でクライオループを使用して大きな単結晶を収穫する。
2. 沈殿液を含む各凍結保護剤溶液のピペット2 μLに加えて、より高濃度のdイメチルスルホキシドおよびリガンド(複数可)を 新しいカバースライドに加えた。
3. 順次に、各滴に cリスタルを浸し、結晶を凍結保護液中で30秒間平衡させます。
4. -173 °C (100 K) の気体窒素流を使用して凍結保護された結晶をフラッシュ冷却するか、液体窒素に浸してパックに長期保存します。
   注:泡デュワーに液体窒素を充填し、クリスタルパックを事前に冷却し、極低温貯蔵デュワーに結晶を保存し、乾燥荷主を使用してシンクロトロンにクリスタルを出荷します。
5. -173 °CでX線回折データの収集を進めます。 0.5~4.0秒の露光時間と0.5°振動を使用してX線回折データを記録します。180-360°回転する。
6. iMosflm²⁷でX線回折画像を処理し、適切な空間群に反射ファイルを生成する。一般に_{、2 β 2st}TS結晶α、宇宙群C121(C2)に属する。
7. CCP4 パッケージ²⁹に実装された Scala²⁸を使用して、反射の複数の観測値をまとめてスケールします。
8. MolRep³⁰と適切な検索モデルを用いた分子置換により、2 β St TS複合体の高解像度_{α 2}の構造を解く。構造解が成功した後に、クート³¹のモデルと電子密度マップを検査する。
   注:タンパク質データバンクには、異なるリガンド(複数可)を有する多くのTS結晶構造が堆積しています。より良い分子置換ステップと新しい結晶構造に適合する時間の短縮のために、目的のリガンド(複数可)を含む最良の検索モデルを使用してください。CCP4^29、30、またはフェニックス³¹で結晶構造の改良を進めます。
9. クート³²を使用してモデルを手動で調整し、Refmac^{29、33または}phenix.refine^31、34で自動的に絞り込みます。クート³²でモデル構築の反復ラウンドを実行し、自動絞り込みを実行して、最終的なモデルを構築し、改良します。
10. タンパク質データバンクのウェブサイトで座標と構造因子の堆積を進めます。

結果

トリプトファン合成酵素のαとβサブユニットの精製
α-subunit(αSt TS)およびサルモネラ・チフィムリウム・トリプトファンシンターゼのβサブユニット(β StTS)を、改変pET SUMOベクター中でサブクローニングした。 図1Aは、His6-SUMO-α St TS(lane αON)およびHis6-SUMO-β St TS(レーンβON)融合タンパク質に対応する2つの強いバンドの代表的なSDS-PAGE結果を示す。本研究で説明した精製プロトコルにより、2日以内に両方のサブユニットを個別に精製することができた。最初の日は、Ni-NTAアフィニティクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、続いてHis-SUMOタグ切断、His-SUMOタグの痕跡の除去、...

ディスカッション

2 β 2 β_の変異型α、α 2 β 2βK167T、α 2 β 2βS377A StTS複合体の構造機能相関研究に成功しました。 当初、我々は、精製中にPEG8000とスペルミンで_{α 2 β 2}StTS複合体結晶化を必要とする以前の精製プロトコル²²を用いて変異体を精製しようと試みた。結晶化速度は、変異体の形態および溶液中の複合体の濃度に依存するが、結晶が大きな溶液体積に現れる時期を予測することは困難である。結晶化は、長い期間(48-96時間)後、または結晶化開始¹⁵後にPEG 8000の余分な量を添加する必要があるいずれかの達成することができる。

残念ながら、本研究で提示された2stTS複合体β α 2の変異形態は、プロトコルの初期ステップ中に結晶化に失敗し...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mL 10 kDaフィルター	MilliporeSigma	UFC901024	遠心フィルターユニット
15 mL 100 kDaフィルター	MilliporeSigma	UFC910024	遠心フィルターユニット
2 mL 極低温バイアル	コーニング	CLS430489	極低温バイアル
2 mL 微量遠心チューブ	Fisher Scientific	05-408-141	微量遠心チューブ
24ウェルCryschem プレート	ハンプトンリサーチ	HR3-158	24ウェルシッティングドロッププレート
2-メルカプトエタノール	フィッシャーサイエンティフィック	O3446I-100	ケミカル
50 mL 遠心分離機コニカルチューブ	サーモサイエンティフィック	12-565-270	遠心分離コニカルチューブ
AB15 ACCUMET ベーシック	フィッシャーサイエンティフィック	13-636-AB15	pHメーター
アガロース	フィッシャーサイエンティフィック	BP1356-100	アガロースゲル
硫酸アンモニウム	フィッシャー・サイエンティフィック	A702-500	ケミカル
・アンピシリン	フィッシャー・サイエンティフィック	BP1760-5	抗生物質
バクテリア・インキュベーター	フィッシャー・サイエンティフィ	S35836	インキュベーター。
BamHI	ニューイングランド Biolabs	R0136S	制限酵素
ビシン	フィッシャーサイエンティフィック	BP2646100	ケミカル
ブランソン 450 デジタルソニファイア	ブレイソン	B450	細胞破壊器
塩化セシウム	フィッシャーサイエンティフィ	BP210-100	ケミカル
水酸化セシウム	アクロス オーガニック AC213601000		ケミカル
クロラムフェニコール	フィッシャーサイエンティフィ	BP904-100	抗生物質
ジメチルスルホキシド	フィッシャーサイエンティフィック	D1391	化学
ジチオスレイトール	フィッシャーサイエンティフィック	BP172-5	化学
DNA ポリメラーゼ	サーモサイエンティフィック	F530S	HF ポリメラーゼ
dNTP セット	Invitrogen	10-297-018	dNTPs セット
EcoRI	New England Biolabs	R0101S	制限酵素
エチレンジアミン四酢酸	フィッシャーサイエンティフィック	S311-100	ケミカル
エクセラ E25R オービタルシェーカー	エッペンドルフ ニューブランズウィック	M1353-0004	オービタルインキュベーター
GE AKTA Prime Plus	GE ヘルスケア	8149-30-0004	FPLC
ゲル抽出キット	Invitrogen	K210012	DNA精製キット
Glycerol	Fisher Scientific	G33-500	Chemical
HindIII	New England Biolabs	R0104S	Restriction enzyme
His-Trap columns	GE Healthcare	GE17-5255-01	5 mL Histrap column
imidazole	Fisher Fisher Scientific	O3196-500	Chemical
IPTG	Thermo Fisherサイエンティフィック	R0392	デューサー
マイシン	フィッシャーサイエンティフィ	BP906-5
ケルビネーターシリーズ-100	ビネーター	製造中止	低冷凍LB
ブロス	フィッシャーサイエンティフィック	BP1426-500	ブロス
リアベルタニ寒天	ッシャーサイエンティフィ	BP1425-2	固体ブロス
NaCl	ッシャーScientific	S271-500	Chemical
NcoI	New England Biolabs	R0193S	制限酵素
Ni-NTA アフィニティービーズ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R90115	Ni-NTA アガロースビーズ
PEG 8000	フィッシャーサイエンティフィック	BP233-100	ケミカル
フェニルメチルスルホニルフッ化物	フィッシャーサイエンティフィック	44-865-0	ケミカル
ピリドキサールリン酸	アクロス有機AC228170010		化学
S-200 HR	サイティバ	45-000-196	サイズ排除列
SacI	ニューイングランドバイオラボ	R0156S	制限酵素
酸化ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	S318-100化学	薬
Sorvall RC-5B遠心分離機	Sorvall	8327-30-1004	床cetrifuge
Spermine	Acros Organics	AC132750010	Chemical
Superdex 200 prep grade	Cytiva	45-002-491	サイズ排除カラム
T4 DNAリガーゼ	ニューイングランドバイオラボ	M0202S	DNAリエーゼ
トリス	フィッシャーサイエンティフィック	BP152-500	ケミカル
Ubl特異的プロテアーゼ 1	サーモサイエンティフィック	12588018	SUMOプロテアーゼ