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方法論記事

開放血管窓と生体内蛍光顕微鏡を用いたマウス蝸牛の心房血流測定

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DOI：

10.3791/61857

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2021年9月21日

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1Oregon Hearing Research Center, Department of Otolaryngology/Head & Neck Surgery, Oregon Health & Science University

この記事について

サマリー

蛍光トレーサーを使用した開放血管窓アプローチは、人工内耳血流(CoBF)測定に十分な分解能を提供します。この方法は、正常および病理学的条件下でのマウスにおけるCoBFの構造的および機能的変化の研究を容易にする。

要約

音の伝達は代謝的に要求が厳しく、側壁の微小血管系の正常な機能は、内視鏡電位、イオン輸送、および体液バランスを維持するために重要です。さまざまな形態の聴覚障害が、蝸牛の異常な微小循環を伴うことが報告されています。人工内耳血流(CoBF)の病理が聴覚機能にどのように影響するかの調査は、実行可能な尋問方法がなく、内耳へのアクセスが困難であるため、困難です。外側蝸牛壁の開いた血管窓は、蛍光生体内顕微鏡と組み合わせて、in vivoでのCoBF変化の研究に使用されてきましたが、主にモルモットで、 ごく最近マウスで使用されてきました。この論文と関連するビデオでは、マウス蝸牛の血流を視覚化するための開放血管窓法について説明しています。詳細には、1)マウス由来の蛍光標識血球懸濁液の調製;2)麻酔マウスにおける生体内顕微鏡観察のための開放血管窓の構築、および3)画像のオフライン記録を使用した血流速度と体積の測定。この方法は、マウスのオープンウィンドウアプローチを使用して、正常および病理学的条件下での蝸牛微小循環の構造的および機能的変化を調べる方法を示すためにビデオ形式で提示されます。

概要

外側蝸牛壁(らせん靭帯と脈条血管の毛細血管の大部分を含む)における微小循環の正常な機能は、聴覚機能を維持するために非常に重要です1。異常なCoBFは、騒音性難聴、耳水腫、老人性難聴など、多くの内耳障害の病態生理に関与しています2,3,4,5,6,7,8,9。生体内CoBFの可視化により、聴覚機能と蝸牛血管病理との関連をよりよく理解できるようになります。

側頭骨内の蝸牛の複雑さと位置により、CoBFを直接可視化および測定することはできませんが、レーザードップラー流量測定(LDF)10、11、12、磁気共鳴画像法(MRI)13、蛍光生体内顕微鏡(FIVM)14、蛍光マイクロ内視鏡検査(FME)15、内視鏡レーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)16など、CoBFの評価のためのさまざまな方法が開発されています。、および標識マーカーおよび放射性タグ付きミクロスフェアの血流への注入に基づくアプローチ(光学的微小血管造影、OMAG)17,18,19,20。しかし、これらの方法はいずれも、FIVMを除いて、in vivoでのCoBFの変化の絶対的なリアルタイム追跡を可能にしていません。FIVMは、外側蝸牛壁の血管窓と組み合わせて、様々な実験室14、21、22によって異なる実験条件下でモルモットにおいて使用および検証されてきたアプローチである14、21、22。

フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストランを造影剤とし、蛍光色素(DiO(3,3'-ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩、緑)またはDil(1,1-ジオクタデシル-3,3,3,3-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩、赤)を使用して、マウスの蝸牛微小循環の構造的および機能的変化を研究するためのFIVM法を確立することに成功しました。本研究では、正常および病理学的条件(ノイズ曝露後など)でのマウスにおけるCoBFの変化を画像化および定量化するためのこの方法のプロトコルが記載されている。この技術は、特に容易に入手可能なトランスジェニックマウスモデルと組み合わせて適用された場合、血管線条の聴覚機能障害および病理に関連するCoBFの根底にあるメカニズムを調査するために必要なツールを研究者に提供します。

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プロトコル

注:これは非生存手術です。動物の使用を含むすべての手順は、オレゴン健康科学大学の施設動物管理および使用委員会によってレビューおよび承認されました(IACUC承認番号:TR01_IP00000968)。

1.蛍光標識血球の調製

  1. ドナーマウス(~6週齢の雄C57BL/6Jマウス)にケタミン/キシラジン麻酔液(5 mL/kg、 材料表参照)の腹腔内注射を麻酔します。
    注:この麻酔プロトコルは非常に信頼性が高く、全身血圧を維持します。
  2. マウスを仰向けに置き、皮膚を開き、ピンセットと解剖ハサミを使用して胸腔を露出させます。横隔膜を切り開き、クランプハサミを使用して胸骨の付け根をつかみ、胸郭を切り裂き、持ち上げて心臓を露出させます。ヘパリン(15IU/mL血液)中の血液1mLを心臓穿刺により採取し、3,000× g で4°Cで3分間遠心分離する。 採血後の頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。
  3. 血漿を除去し、血球ペレットを1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、3000 × g で4°Cで3分間遠心分離します。
  4. 1 mLの20 mM DiOまたはDilをPBSで標識し、暗所で室温で30分間インキュベートします23,24。
  5. 標識した血液細胞を1 mLのPBSで遠心分離および洗浄し、3000 × g で3回遠心分離して4°Cで3分間遠心分離し、細胞ペレットを30%ヘマトクリット値に~0.9 mLのPBS(最終容量~1.3 mL)で再懸濁してから注射します。

2.開いた窓を作る手術 25

  1. 滅菌手術器具とイメージングプラットフォームを準備し、ドレープの下に加熱パッドを置きます(図1A)。ステップ1.1の説明に従ってマウス(生後~6週齢の雄C57BL/6Jマウス)を麻酔し、足の反射と全身筋緊張を監視して麻酔の深さを確認します。動物を温かい加熱パッドの上に置き、直腸温度を37°Cに維持します。
  2. 血圧と心拍を監視するために、動物の尾をCODATMモニターシステムに配置します( 資料の表を参照)。麻酔状態での動物の収縮期血圧、拡張期血圧、および平均血圧(MBP)を記録します。
    注:麻酔状態と麻酔なしの状態の動物MBPに違いは見られません(107 ± 11 mmHg対97 ± 7 mmHg)。動物の心拍数は麻酔下で安定していますが、麻酔をかけていない状態よりも低くなります(まだ正常範囲内±±)。拘束された動物では、わずかに増加した心拍が予想されるはずです26。
  3. 実体顕微鏡下で横方向と腹側のアプローチで左鼓膜を開き( 材料の表を参照)、鼓膜と小骨をそのまま残します21。
    1. 動物の首の正中線に沿って切開を行い、頭を固定し、動きを最小限に抑えるように配置します(図1B)。顎下腺と顎二腹筋の後腹を切除し、焼灼します。
      注:手術中の痛みを軽減するために、ブプレノルフィンを0.05 mg / kgで皮下注射します。
    2. 胸鎖乳突筋と顔面神経が胸骨に向かって前方に伸びていることを特定することにより、骨ブラを見つけて露出させます。
    3. 30 Gの針で骨煩頭を開き、手術用ピンセットで周囲の骨を慎重に取り除き、蝸牛と漆骨動脈をはっきりと表示します。
      注:気管切開術は、気道を塞がないようにするために行われ、動物が手術中に呼吸器系の問題を抱えている場合にのみ行う必要があります。一般に、麻酔下の動物のほとんどは滑らかな呼吸をしています。ただし、動物が手術中に気管切開を受けた場合、記録された血流を比較に使用しないでください。
  4. 小さなナイフの刃(カスタムミルの#16メス)を使用して、マウスの蝸牛の頂点と中央のターンで、頂点から約1.25 mmの外側壁の骨を、薄いスポットが割れるまでこすり落とします。小さなワイヤーフックで骨片を取り外します(図1E)。
  5. 通常の生理学的状態を維持し、容器画像を記録するための光学ビューを提供するために、容器窓をカットカバースリップで覆います。
    注意: すべての手順は注意して実行する必要があります。体温の監視に加えて、血圧や心拍などの動物のバイタルサインも手術中ずっと監視する必要があります。

3. FIVM下でのCoBFのイメージング

  1. 右伏在静脈に沿って~1cmの切開を行い、血管を露出させます(図1F)。
  2. 100 μLのFITCデキストラン溶液(2000 kDa、40 mg/mL溶液PBS)と100 μLの血球懸濁液(30%ヘマトクリット)を伏在静脈を通して動物に連続的に注入し(図1G)、血管の可視化と血流速度の追跡を可能にします。
  3. 注射の5分後にビデオモニターで直接血流をリアルタイムで観察します。長作動距離(W.D.)対物レンズ(W.D.30.5 mm、10倍、開口数0.26)と、多波長励起フィルターと互換性のある発光フィルターを含むランプハウジングを備えた蛍光顕微鏡を使用して血管を画像化します(材料表)。高解像度デジタル白黒電荷結合素子カメラ(表)を使用して2フレーム/秒)でビデオを録画します。ビデオごとに350枚以上の画像を取得して、流速の解析を確実に成功させます。
    注:らせん靭帯と脈理血管の両方の血管は、光学焦点を調整することで画像化できます(補足ビデオ1)。

4.ビデオ分析

  1. 適切なソフトウェア(材料表)を使用して容器の直径を測定し、取得した画像で容器を横切る2つの固定点間の距離を決定します。
  2. 画像位置27間の空間距離における標識された血球の動きをトレースすることによって、キャプチャされたビデオフレームから血流速度を計算する。
    1. ソフトウェアで血流のビデオを開き(このプロトコルではフィジー[ImageJ]が使用されました)、画像のスケールを設定します。
    2. トラッキング機能を使用して、選択したDiO染色血球を追跡します。セルが移動した距離とビデオ内の画像フレーム間の時間間隔を使用して、流速を自動計算します。
  3. 次の式に従って体積流量(F)を計算します:F = V × A。A:容器の断面積)。

5.騒音暴露

  1. 動物を金網のケージに入れます。音暴露ブースで120dBの音圧レベルで3時間、翌日さらに3時間、広帯域ノイズにさらします。
    注:この実験室で日常的に使用されているこの騒音暴露レジームは、人工内耳感度の永久的な喪失を引き起こします28。

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結果

側壁の蝸牛毛細血管の外科的曝露後(図1)、FITCデキストラン標識血管内のディル標識血球の生体内高解像度蛍光顕微鏡観察は、開いた血管窓を通して実行可能でした。図2Aは、マウス蝸牛頂部・中回側壁の毛細血管を示すFIVM下で撮影した代表的な画像である。これらの血管の発光は、血漿と混合されたFITCデキストランの蛍光によって可視化されます。血管網に分布する個別に標識された血球も、この画像ではっきりと見えます。2つの異なるネットワーク-らせん靭帯の毛細血管と脈条血管の毛細血管-は場所によって区別されます(直立顕微鏡では、脈理血管はらせん靭帯の下を光学的に走り、より多くの毛細血管ループとより小さな血管が含まれています25)。どちらも、光学焦点の調整により血流を評価することができます。図2B、Cに示すように、らせん靭帯の血管密...

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ディスカッション

この論文は、マウスモデルの蝸牛側壁(および脈理血管)の毛細血管を、FIVMシステム下での開放血管窓調製物における蛍光色素標識でどのように視覚化できるかを示しています。マウスモデルは、ヒトの健康および疾患を調査するための哺乳類モデルとして広く使用され、好ましい。ここで説明するプロトコルは、FIVMシステム下の開いた血管窓を使用して、マウス側壁(特に脈条体)におけるCoBFを画像化および調査するための実行可能なアプローチであり、この方法は、蛍光標識された血球をトレーサーとして使用して血流速度および体積を決定するのに十分な分解能を提供する(図 3 および 図4に示すように)).このアプローチは、血管透過性の評価や周皮細胞収縮性の検査、循環骨髄細胞移動の追跡など、いくつかの異なるアプリケーションに使用できます25。外傷、感染、騒音、異物、耳毒性薬物、または側壁に影響を及ぼす他の薬剤に応答するCoBFの急性変化も、リアルタイムでモニターすることができる

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

本研究は、NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi)、NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi)、NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi)、およびオレゴン健康科学大学(OHSU)の医学研究財団(X.Shi)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.9% 塩化ナトリウムHospiraNDC 0409-1966-020.6 mL (1 mL 用)
1,1′-ジオクタデシル-3,3,3&�prime;,3′-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩Sigma Aldrich46849520 µM
3,3′-ジオクタデシロキサカルボシアニン過塩素酸塩Dio (3,3′-ジオクタデシロキサカルボシアニン過塩素酸塩Sigma AldrichD429220 µM
CODAモニターシステムケントサイエンティフィックCODAモニター、血圧と心拍のモニタリング用
カバースリップフィッシャーサイエンティフィック12-542A
DC温度コントローラーFHC40-90-8D
フィジー/ImageJNIH血管径の測定
FITC-デキストラン(2000 kDa)シグマ アルドリッチFD2000s40 mg/mL
ヘパリンナトリウム注射、USP MDVMylanNDC 67457-374-125000 USP units/mL
Katathesia (100 mg/mL)Henry ScheinNDC 11695-0702-10.2 mL (for 1 mL)
顕微鏡対物Mitutoyo378-823-5モデル:M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER カメラ浜松モデル:C4742-80-12AG
PBSGibco2085387
ザゼイン(100 mg/mL、5倍希釈して使用ロイドLPFL048210.2 mL(1 mL用)
ズーム実体顕微鏡オリンパスモデル:SZ61、蛍光顕微鏡
レンズ )

参考文献

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