ハイコンテントイメージング解析を用いた心臓リプログラミングの評価

Summary

ハイコンテントイメージング解析を使用して、in vitroで直接再プログラムされた誘導心筋細胞様細胞(iCM)を定量するプロトコルを提示します。この方法により、心臓のリプログラミングの効率を自動的に定量化し、iCMを直接可視化することができます。

Abstract

このプロトコルの目標は、リプログラミング技術によってin vitroで直接再プログラムされる誘導心筋細胞様細胞(iCM)を定量化する方法を説明することです。心臓のリプログラミングは、新しい心筋細胞を生成するための戦略を提供します。コア心原性転写因子を線維芽細胞に導入することにより。線維芽細胞は、多能性幹細胞の状態を遷移することなくiCMに変換することができます。しかし、線維芽細胞からiCMへの変換率は依然として低いままです。したがって、心臓のリプログラミング効率を高めるための多くの追加のアプローチがあります。これらの研究のほとんどは、フローサイトメトリーを使用して心臓のリプログラミング効率を評価すると同時に、免疫細胞化学を実行してiCMを視覚化しました。したがって、iCMのリプログラミングの成功を実証するには、少なくとも2つの別々のリプログラミング実験セットが必要です。対照的に、自動化されたハイコンテントイメージング解析では、比較的少数の細胞でiCMリプログラミングの定量化と適格性評価の両方を行うことができます。この手法では、1回のリプログラミング実験でiCMの量と質を直接評価することが可能です。このアプローチにより、リプログラミング効率を高めるための遺伝的要因や薬理学的要因のスクリーニングなど、大規模なリプログラミング実験を必要とする将来の心臓リプログラミング研究を促進することができます。さらに、ハイコンテントイメージング解析プロトコルの適用は、心臓のリプログラミングに限定されません。これは、他の細胞系譜のリプログラミングや、免疫染色細胞の定量化と可視化の両方を必要とする免疫染色実験にも適用できます。

Introduction

心臓リプログラミングは、幹細胞を介したアプローチに代わるアプローチとして開発され、新しい心筋細胞を作製しています。幹細胞の状態に移行しないことを考えると、幹細胞を介したアプローチにおけるいくつかの遺伝的制限を回避する可能性が高くなります。少なくとも3つまたは4つの心原性転写因子がウイルス感染すると、線維芽細胞遺伝子プログラムを排除し、線維芽細胞の心原性転写ネットワークを再構築することにより、線維芽細胞を心臓の運命に変換できることが示されています1,2,3,4,5,6,7,8,9,10^、11、

Protocol

すべての動物処置は、ヴァンダービルト大学医療センターの施設内動物管理および使用委員会の承認を得て行われました。

1. レトロウイルスの作製とin vitro心臓リプログラミング

1. Platinum E細胞をDMEMで培養し、10% FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1 μg/mLピューロマイシン、および10 μg/mLブラストシジンを添加して、Platinum E細胞の密度が70%〜80%に達するまで培養します。
2. 1日目に、最初のトランスフェクションの前日に、~0.55 x 10⁶ 細胞(ファーストウェル)と~0.18 x 10⁶ セル(セカンドウェル)を12ウェルプレートの2つの別々のウェルに播種し、10% FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した1mLのDMEMを添加します。
   注:実験に必要なウイルス培地の量に応じて、異なるサイズの培養皿を使用することができます。実験の他の尺度については、 表1 を参照してください。
3. 2日目に、前の研究⁹ または空のベクターに記載されているMef2c、Gata4、Tbx5、およびHand2をコードするクワッドシストロニックM-G-T-Hレトロウイルスコンストラ....

Results

リプログラミング実験に続いて、上記のようにハイコンテントイメージング分析を使用してiCMを定量しました。ハイコンテントイメージング解析に使用した36のイメージング部位の合成画像を 図1に示します。これらの実験では、iCMはダブルポジティブ細胞(α-アクチニン⁺Titin-eGFP⁺)と定義されています。ハイコンテントイメージング解析では、M-G-T-H形質導入後に~26%の細胞が両方の心臓マーカーを示し、空のベクター形質導入コントロール細胞の~1%がダブルポジティブ細胞を示すことが示されています。個々のiCMは、ハイコンテントイメージングシステムによって撮影された10倍の画像で視覚化されました(図2)。

Discussion

これまでのリプログラミング研究では、フローサイトメトリーを用いてリプログラミング効率を評価し、免疫細胞化学を用いて2つの別々の実験でiCMの構造品質を実証しました。フローサイトメトリー解析では、はるかに多くの開始細胞が必要になるため、実験の規模が大きくなります。これに対し、ハイコンテントイメージング解析では、比較的少数の細胞を用いた1回の実験で、iCMリプログラミングの質と量の両方を評価できます。したがって、この新しい方法は、将来のリプログラミング研究のための効率的な新しい技術プラットフォームを提供することができます。特に、この新しい方法は、新しい遺伝的または薬理学的因子をスクリーニングするためのリプログラミング実験に役立ちます。多数の因子を試験するために、分析の形式を384ウェル形式に縮小できます。

形質導入効率は、リプログラミング効率と直接相関しています。これまでの研究では、高いリプログラミング効率を達成するためには、すべてのリプログラミング因子を線維芽細胞に確実に発現させることが重要であることが示されました<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
抗チキン Alexa 488	サーモフィッシャー	A11039
抗GFP抗体	Invitrogen	A10262
抗マウス Alexa 555	サーモフィッシャー	A21422
抗アルファ;-アクチニン抗体	Sigma	A7811
DAPI溶液	ベクターラボ	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
Insulin-Transferrin-SeleniumG supplement	Invitrogen	41400-045
Medium 199	Invitrogen	11150059
MEM vitamin solution	Invitrogen	11120-052
MetaXpressソフトウェア	Molecular device
Micro XL自動細胞イメージングシステム	分子デバイス
最小限の必須アミノ酸溶液	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
PESフィルター (0.45 µm)	Thomas scientific	1159T84
Platninum E細胞	Cell Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
Universal blocking buffer	BiogeneX	HK083-50K