レーザーフリーヒドロキシルラジカルタンパク質フットプリントによるタンパク質の高次構造解析

サマリー

このプロトコルは、インラインラジカル線測定とプラズマ光源を使用して、フラッシュ酸化タンパク質のフットプリントを実行する方法を提示する。この方法は、タンパク質研究の高速光化学酸化の再現性を簡素化し、改善するために、危険なUVレーザーを置き換えます。

要約

Hydroxylラジカルプロテインフットプリント(HRPF)は、タンパク質構造の変化、タンパク質とタンパク質の相互作用、またはタンパクリガンド相互作用に関する情報を提供する、新たな有望な高次構造解析技術です。HRPFは、ヒドロキシルラジカル^(▪OH)を利用して、タンパク質の溶媒アクセス可能な表面を不可逆的に標識します。HRPFを実行する本質的な複雑さ、コスト、および危険な性質は、バイオ医薬品における広範な採用を実質的に制限しています。これらの要因には、1)実質的な安全対策を必要とする複雑で危険で高価なレーザーの使用が含まれます。2)比較研究を制限する ^▪OHのバックグラウンド清掃によって引き起こされるHRPFの再現性。本書は、レーザーフリーHRPFシステムの動作プロトコルを提供します。このレーザーフリーHRPFシステムは、インラインラジカル線量測定を用いた高エネルギー、高圧プラズマ光源フラッシュ酸化技術を利用しています。プラズマ光源は、レーザーベースのHRPFシステムよりも安全で使いやすく、ヒドロキシルラジカルの生成効率が高く、インラインラジカル線量計は研究の再現性を高めます。レーザーフリーHRPFシステムを組み合わせることで、レーザーベースの技術の欠点と限界に対処し、克服します。

概要

タンパク質の立体構造および関連する高次構造(HOS)は、適切な生物学的機能および異常な挙動¹の主要な決定因子である。同じことが、その構造と機能活性が生産と環境の様々な側面に依存しているバイオ医薬品にも当てはまります。HOSのバイオ医薬品の変化は、望ましくない薬理学的および患者免疫学的応答^2、3に起因する有害薬物反応(ADR)に関連している。ADRの出現は、タンパク質HOSがバイオ医薬品の安全性と有効性において果たす重要な役割をバイオ医薬品業界に警告し、HOS分析⁴を新しく改良する必要性を確立しました。

ヒドロキシルラジカルプロテインフットプリント(HRPF)は、タンパク質HOSの変化を追跡する有望な技術です。HRPFは^、OH▪を伴うタンパク質の外装の不可逆的な標識を伴い、続いて質量分析(MS)分析を行い、タンパク質^5、6、7の溶媒アクセス可能表面を同定^する。HRPFは、タンパク質HOSとその機能^8、9<....

プロトコル

1. キャピラリーチューブの取り付け

1. シリカ切断石を使用して、250 μm 内径(ID)シリカ毛管を27インチに切断します。毛細管の端部がきれいな、まっすぐな切り傷を点検しなさい。
2. ポリイミドコーティングを焼き払って、長さ約15mmの2つの窓を作成します。「下端」から始めて、最初の光起点窓を「下端」から90mm離れ、「下端」から225mm離れた場所に向けて行います。
   注:コーティングが燃え尽きると、毛細管は非常に壊れやすいです。
3. ポート 5 でナットとフェルールを外し、フェルールの円錐の端のすぐ向こうにキャピラリーの「下端」を挿入します(図 1A)。
4. 光起こしモジュールで、光起細胞キャップをまっすぐ引き出して取り外し、キャピラリーを所定の位置に保持する磁気的に取り付けられた金属マスクを取り外します。
   注意:光起こセルキャップの内側は湾曲したミラーであり、ミラーに触れるものは何も許可しないでください。
5. ドーシメータモジュールで、左側のタブを押して、ドーシメーターセルを開き、右に開いて、その後、その細胞を振ります。キャピラリーを所定の位置に保持する磁気マウントクリップを取り外します。
6. 毛細管を、光起細胞の基部の溝付きチャネルに入れる。毛細血管ウィンドウを、光度セルウィンドウで中央に配置します。片方の手でキャピラリーを所定の位置に持ち、マグネットマ....

結果

リアルタイムのドサイメトリーと組み合わせた高圧血漿源により、高次タンパク質構造の変化をより正確に観察するために^、▪OH収量をより適切に制御できます。アデニンの添加は有効なリアルタイムラジカルのドシメータを可能にする。酸化の際、アデニンは265nmでUV吸光度を失う(図2A)。アデニン吸光度の変化は、HRPFに利用可能なラジカルの濃度に直接関係しており、バッファー、賦形剤、リガンドなどのラジカルスカベンジャーの存在下でラジカル濃度の変化を効果的に監視する手段を提供する(図2B)。

アポミオグロビン(aMb)は、4つの増加プラズマ電圧で100mM _H2O2および1mMアデニンの存在下で改変した(図3)。6個のペプチドを、アデニンUV265nm吸光度の変化に伴う酸化の直線的増加で検出した。アデニンUV吸光度は、OH濃度を^有効▪

ディスカッション

HRPF実験中にタンパク質の適切な標識を確実に行うためには、いくつかの重要なステップがあります。まず、適切な流量とソースフラッシュレートが、試料の各ボーラスが一度照射されるのを確実にするために選択される。これにより、タンパク質が新たに形成された ^▪OHの単一のボーラスにさらされることが保証されます。タンパク質が酸化されると、より高次のタンパク質構造を変化させることができます。ネイティブタンパク質構造がプローブされていることを確信するためには、各タンパク質分子を1回の瞬間に修飾する必要があります。ドシメトリーは、天然のタンパク質構造がプローブされているかどうかをテストするために使用することができます。ヒドロキシルラジカルの濃度が増加するにつれて、天然タンパク質構造がプローブされると、酸化の程度が直線的に増加する。しかし、ヒドロキシルラジカルの濃度が高い場合、標識中にタンパク質が部分的に展開し、酸化の程度が著しく増加し、天然のタンパク質構造を確実にプローブする有効な手段を提供する。

反応が適切に消光されるようにすることも重要です。これには、標識プロセス中にタンパク.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mLの円錐形の遠心分離機の管フィ	ッシャー科学	14-959-53A	はどのブランドでも十分である
50 µL SGEガスタイトシリンジ	フィッシャーサイエンティフィック	SG-00723
Acclaim PepMap 100 C18ナノコラム(0.75 mm X 150 mm、2 & micro;m)	Thermo Scientific
アセトニトリル、0.1% ギ酸 (v/v)、LC/MS グレード	Fisher Scientific	LS120-500
アポミオグロビン	Sigma-Aldrich
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
遠心分離機	Eppendorf	022625501
Delicate Task Wipers	Fisher Scientific	06-666A
過酸化水素	フィッシャーサイエンティフィック	H325-100	任意の30%過酸化水素で十分
メチオニンアミド	Chem-Impex	03109
微量遠心分離機	Thermo Scientific	75002436
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質量分析計	Thermo Scientific	Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質量分析計	その他の高分解能装置(Q exactive Orbitrap や Orbitrap Fusion など)は、
Pierce Trypsin Protease、MS	Grade Thermo Scientific	90058
Polymicro Cleaving Stone、1" x 1" x 1/32"	Molex	1068680064	任意のキャピラリーチューブカッターは、
0.1% ギ酸 (v/v)、LC/MS グレード	Fisher Scientific	LS118-500
水、LC/MS グレード	Fisher Scientific	W6-4
UPLC	Thermo Scientific

で使用できます。 を含む Water で十分です