骨髄移植(BMT)の3つの方法について、全体照射によるBMT、シールド照射を伴うBMT、マウスモデルにおけるクローナル造頭法の研究のための予備調整なし(養子BMT)を用いたBMT法について述べた。
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この記事について
サマリー
要約
クローン造血は、造血幹細胞および前駆細胞(HSPCs)における体細胞突然変異の蓄積に起因する一般的な年齢関連状態である。細胞の適合性を与えるドライバー遺伝子の突然変異は、体細胞突然変異を抱える子孫白血球をますます生じさせるHSPCクローンの拡大につながる可能性がある。クローン造形は心臓病、脳卒中、死亡率に関連しているため、これらのプロセスをモデル化する実験システムの開発は、この新しい危険因子のメカニズムを理解する鍵です。全身照射(TBI)などのマウスにおける骨髄性調節を伴う骨髄移植手順は、心血管疾患における免疫細胞の役割を研究するために一般的に採用されている。しかし、骨髄ニッチおよび心臓や脳などの関心のある他の部位への同時損傷は、これらの手順では避けられない。このように、私たちの研究室は、TBIによって引き起こされる可能性のある副作用を最小限に抑えるか回避するための2つの代替方法を開発しました:1)照射シールドによる骨髄移植と2)非条件付きマウスへの養子BMT。シールドされた器官では、局所的な環境が保存され、常駐免疫細胞の機能が妨げられていない間、クローン造造りの分析を可能にする。対照的に、非コンディショネートマウスへの導入BMTは、臓器の局所環境と造血ニッチの両方が保存されるという付加的な利点を有する。ここでは、3つの異なる造血細胞再構成アプローチを比較し、心血管疾患におけるクローン造血の研究におけるそれらの強みと限界について議論する。
概要
クローン造血(CH)は、高齢の個体で頻繁に観察される状態であり、遺伝子変異を運ぶ造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)クローンの拡大の結果として生じる。50歳までに、ほとんどの個体が各HSPC2で平均5つのエキソン突然変異を獲得することが示唆されているが、これらの突然変異のほとんどは、その個体にほとんどまたは全く触知の結果をもたらすであろう。しかし、偶然にも、これらの突然変異の1つがHSPCに対して競争上の優位性を与える(例えば、HSPCの増殖、自己再生、生存、またはこれらの組み合わせ)が与える場合、これは他のHSPCsに対する変異クローンの優先的な拡大につながる可能性があります。その結果、突然変異したHSPCが成熟した血液細胞を生み出し、末梢血内の突然変異細胞の明確な集団に至るにつれて、突然変異は造血系を通じてますます広がる。数十の異なる候補ドライバ遺伝子の変異が造血系内のクローンイベントと関連している一方、これらの中で、DNAメチルトランスヴァリン酵素3α(DNMT3A)および111個の転座2(TET2)の変異が最も一般的である3。いくつかの疫学的研究では、これらの遺伝子変異を運ぶ個人は、心血管疾患(CVD)、脳卒中、および全因果死亡率のリスクが有意に高いことを発見しました3,
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プロトコル
動物の被験者を含むすべての手順は、バージニア大学の制度的動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 事前調整の前に
- レシピエントマウスを抗生物質補充水(5 mMスルファメトキサゾール、0.86 mMトリメトプリム)~24時間前に照射する。これは、感染を予防するために必要であり、免疫系は照射後に抑制され、照射後2週間維持される。この時点で、栄養/水和ゲルでマウスを補い、摂食を促し、照射後の体重減少や脱水を防ぎます。
図1:さまざまなプリコンディショニングの設定を示す画像。(A)ガンマ線を用いたパイケージ全身照射設定(セシウム-137):放射線ビームは、照射器の背面からy軸方向(水平放射線)から来る。(B)X線を用いたマウスケージ全身照射設定:マウスケージは反射チャンバに配置される。放射ビームは、コーン(垂直放射)の形をした照射器の上部から来ます。放射線源からケージ....
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結果
ドナー細胞の生着に対する3つのBMT/プレコンディショニング方法の効果を比較するために、末梢血および心臓組織におけるドナー細胞の分画を、1ヶ月後のBMT後のフローサイトメトリーによって分析した。特定の白血球マーカーについて分離細胞を染色し、白血球の異なるサブセットを同定した。これらの実験では、野生型(WT)C57BL/6(CD45.2)ドナー骨髄細胞をWT B6に送達した。SJL-PtprcaPrpcb/BoyJ (CD45.1) レシピエントマウスは、ドナー細胞とレシピエントの細胞を区別する。使用されたフローサイトメトリーの測定法は、前に、補足図1のWang et al.9で説明した。
全体照射(TBI)処置群は、4時間間隔で分離された2つの5.5 Gy画分において11Gyの総致死量量に続いて5 x106骨髄細胞を受けた。レシピ.......
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ディスカッション
クローン造造の研究では、総ボディ照射を伴うBMT、部分シールドによる照射を伴うBMT、およびプレコンディショニングを伴わないあまり一般的に使用されないBMT法(養子BMT)の3つの方法について説明した。これらの方法は、クローン造造が心血管疾患に及ぼす影響を評価するために使用されてきた。研究者は、研究の特定の目的に合わせてこれらの方法を変更することができます。
クローン造造機モデル
クローン造血は、突然変異造血細胞が野生型細胞と競合し、時間の経過とともにクローン性優位を得る現象です。この競争のモデルを作成するために、マウスは、遺伝的に異なる細胞の混合物からなる骨髄を投与することができる。一般的に、この混合物は、蛍光タグまたは異なる汎白血球マーカー(すなわち、CD45.1およびCD45.2)で標識された変異型および野生型細胞を含むであろう。例えば、Tet2-mediaedCHを模倣するモデルを作成する場合、CD45.1 Tet2++ドナーから生まれた細胞の90%とCD45.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、K.ウォルシュ(HL131006、HL138014、HL132564)、S.サノ(HL152174)、M.A.エバンス(20POST35210098)への米国心臓協会助成金、および小川への日本心臓財団への米国国立衛生研究所の助成金によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.5ml微量遠心分離機 | フィッシャーサイエンティフィック | 05-408-121 | 一般供給 |
| 1.5ml微量遠心分離機 | フィッシャーサイエンティフィック | 05-408-129 | 一般供給 |
| 1/2 cc LO-DOSE インスリン注射器 | エクセリント | 26028 | 一般供給 |
| 無水エタノール (200 prfof) | フィッシャーケミカル | 200559 | 一般供給 |
| BD 1mL ツベルクリンシリンジ 25G 5/8 インチ ニードル | ベクトン ディキンソン | 309626 | 一般供給 |
| BD プレシジョングライド ニードル 18G (1.22mm X 25mm) | ベクトン ディキンソン | 395195 | 一般供給 |
| セシウム-137 照射器 | J. L. シェパード | Mark IV | 機器 |
| DietGel 76A | クリア H2O | 70-01-5022 | 一般供給 |
| ファルコン 100 mm TC 処理細胞培養ディッシュ | ライフサイエンス | 353003 | 一般供給 |
| ファルコン 50 mL 円錐形遠心チューブ | フィッシャー サイエンティフィ | 352098 | 一般供給 |
| フィッシャーブランド 滅菌細胞ストレーナー、70 μメートル | フィッシャーサイエンティフィ | 22363548 | 一般供給 |
| Graefe鉗子 | ファインサイエンスツール | 11051-10 | 一般供給 |
| 硬化ファインはさみ | ファインサイエンスツール | 14090-09 | 一般供給 |
| Isothesia(イソフルラン)溶液 | ヘンリーシャイン | 29404 | 溶液 |
| ケタミン | Zoetis | 043-304 | 注射 |
| Kimwipes デリケート タスク ワイパー | Kimtech Science | KCC34155 | General Supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| RadDisk –げっ歯類照射器ディスク | Braintree Scientific | IRD-P M | 一般供給 |
| RPMI 中 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | 中 |
| スルファメトキサゾールとトリメトプリム | TEVA | 0703-9526-01 | 注射 |
| キシラジン | Akorn | 139-236 | 注射 |
| X 線照射器 | 放射線源 | RS-2000 | 機器 |
参考文献
- Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
- Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia.....
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再版と許可
