クローン造造を研究するマウスにおける骨髄移植手順

サマリー

骨髄移植(BMT)の3つの方法について、全体照射によるBMT、シールド照射を伴うBMT、マウスモデルにおけるクローナル造頭法の研究のための予備調整なし(養子BMT)を用いたBMT法について述べた。

要約

クローン造血は、造血幹細胞および前駆細胞(HSPCs)における体細胞突然変異の蓄積に起因する一般的な年齢関連状態である。細胞の適合性を与えるドライバー遺伝子の突然変異は、体細胞突然変異を抱える子孫白血球をますます生じさせるHSPCクローンの拡大につながる可能性がある。クローン造形は心臓病、脳卒中、死亡率に関連しているため、これらのプロセスをモデル化する実験システムの開発は、この新しい危険因子のメカニズムを理解する鍵です。全身照射(TBI)などのマウスにおける骨髄性調節を伴う骨髄移植手順は、心血管疾患における免疫細胞の役割を研究するために一般的に採用されている。しかし、骨髄ニッチおよび心臓や脳などの関心のある他の部位への同時損傷は、これらの手順では避けられない。このように、私たちの研究室は、TBIによって引き起こされる可能性のある副作用を最小限に抑えるか回避するための2つの代替方法を開発しました:1)照射シールドによる骨髄移植と2)非条件付きマウスへの養子BMT。シールドされた器官では、局所的な環境が保存され、常駐免疫細胞の機能が妨げられていない間、クローン造造りの分析を可能にする。対照的に、非コンディショネートマウスへの導入BMTは、臓器の局所環境と造血ニッチの両方が保存されるという付加的な利点を有する。ここでは、3つの異なる造血細胞再構成アプローチを比較し、心血管疾患におけるクローン造血の研究におけるそれらの強みと限界について議論する。

概要

クローン造血(CH)は、高齢の個体で頻繁に観察される状態であり、^{遺伝子変異を}運ぶ造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)クローンの拡大の結果として生じる。50歳までに、ほとんどの個体が各^HSPC2で平均5つのエキソン突然変異を獲得することが示唆されているが、これらの突然変異のほとんどは、その個体にほとんどまたは全く触知の結果をもたらすであろう。しかし、偶然にも、これらの突然変異の1つがHSPCに対して競争上の優位性を与える(例えば、HSPCの増殖、自己再生、生存、またはこれらの組み合わせ)が与える場合、これは他のHSPCsに対する変異クローンの優先的な拡大につながる可能性があります。その結果、突然変異したHSPCが成熟した血液細胞を生み出し、末梢血内の突然変異細胞の明確な集団に至るにつれて、突然変異は造血系を通じてますます広がる。数十の異なる候補ドライバ遺伝子の変異が造血系内のクローンイベントと関連している一方、これらの中で、DNAメチルトランスヴァリン酵素3α(DNMT3A)および111個の転座2(TET2)の変異が最も一般的である^3。いくつかの疫学的研究では、これらの遺伝子変異を運ぶ個人は、心血管疾患(CVD)、脳卒中、および全因果死亡率^のリスクが有意に高いことを発見しました^3,4,5,6,7.これらの研究は、CHとCVDと脳卒中の発生率の増加との間に関連が存在することを特定したが、この関係が因果関係であるか、老化プロセスと共通のエピレプションであるかは分からない。この関連を理解するためには、CHの人間の状態を正しく再現する適切な動物モデルが必要です。

ゼブラフィッシュ、マウス、および非ヒト霊長類^{8、9、10、11、12、13、14}を使用して、我々のグループと他の人によっていくつかのCH動物モデルが確立されています。これらのモデルは、しばしば、Cre-lox組換えまたはCRISPRシステムを用いて、遺伝子組換え細胞の移植による造血再構成法を使用する。このアプローチにより、造血細胞における特定の遺伝子変異の分析が、疾患の発症にどのように寄与するかを評価することができます。さらに、これらのモデルは、多くの場合、正常または野生型細胞から変異細胞の効果を区別するために、コンジェニックまたはレポーター細胞を採用しています。多くの場合、ドナー造血幹細胞を正常に生着させるためには、事前調整レジメンが必要です。

現在、骨髄をレシピエントマウスに移植することは、1)骨髄性調節と2)非条件付き移植の2つの主要なカテゴリーに分けることができる。骨髄性調節は、2つの方法、すなわち、全身照射(TBI)または化学療法¹⁵のいずれかによって達成することができる。TBIは、レシピエントにガンマまたはX線照射の致死量を照射することによって行われ、急速に分裂した細胞内でDNA切断またはクロスリンクを生成し、それらを取り返しのつかない¹⁶にレンダリングする。ブスルファンとシクロホスファミドは、造血ニッチを破壊し、同様に急速に分裂する細胞にDNA損傷を引き起こす2つの一般的に使用される化学療法薬である。骨髄性プレコンディショニングの結果は、レシピ細胞のアポトーシスであり、レシピエントの造血系を破壊する。この戦略は、ドナーHSPの生着を成功させるだけでなく、レシピエントの免疫系を抑制することによって移植片拒絶反応を防ぐこともできる。しかし、骨髄性プレコンディショニングは、組織および器官およびそれらの常駐免疫細胞への損傷ならびに天然骨髄ニッチ¹⁷の破壊などの重篤な副作用を有する。したがって、これらの望ましくない副作用を克服する代替方法が提案されているが、特に目的の器官への損傷に関してである。これらの方法は、受容マウスのシールド照射及び非^{条件マウス9、17}への養子BMTを含む。リードバリアの配置による胸郭、腹腔、頭部または他の領域を照射から遮蔽し、照射の有害な影響から保護された目的の組織を維持し、その常駐免疫細胞集団を維持する。一方、非コンディションマウスにHSPCの採用BMCは、天然造血ニッチを維持するため、追加の利点を有する。本稿では、マウスにおけるいくつかの移植レジメン、特にTBIマウスへのHSPCの送達、部分的に照射から遮蔽されたマウス、および非調整マウスへのHSPC生着のプロトコルおよび結果について述べる。全体的な目標は、研究者が各方法の異なる生理学的影響だけでなく、CHと心血管疾患の設定における実験的成果にどのような影響を与えるかを理解するのを助けるものです。

プロトコル

動物の被験者を含むすべての手順は、バージニア大学の制度的動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 事前調整の前に

1. レシピエントマウスを抗生物質補充水(5 mMスルファメトキサゾール、0.86 mMトリメトプリム)~24時間前に照射する。これは、感染を予防するために必要であり、免疫系は照射後に抑制され、照射後2週間維持される。この時点で、栄養/水和ゲルでマウスを補い、摂食を促し、照射後の体重減少や脱水を防ぎます。

図1:さまざまなプリコンディショニングの設定を示す画像。(A)ガンマ線を用いたパイケージ全身照射設定(セシウム-137):放射線ビームは、照射器の背面からy軸方向(水平放射線)から来る。(B)X線を用いたマウスケージ全身照射設定:マウスケージは反射チャンバに配置される。放射ビームは、コーン(垂直放射)の形をした照射器の上部から来ます。放射線源からケージまでの距離は530mm(C)X線照射器の調節可能なトレイ:このセットアップはX線を用いた部分的にシールドされた照射に使用される。放射ビームは、コーン(垂直放射)の形をした照射器の上部から来ます。放射源からトレイまでの距離は373mmで、半径は250mm(D)胸郭シールド:麻酔をかけられたマウスはトレイに置かれる。マウスは、腕と脚を完全に伸ばした後、互いに逆に座り込む。リードシールドの下端は、キシヒステルナム骨と胸腺と上端に揃えられます。(E)腹部シールド: 麻酔付きマウスは、リードシールドの下端がアヌスに合わせ、上端が横隔膜の下に揃えて胸郭シールドセットアップのように配置されます。(F)ガンマ線を用いたヘッドシールド照射設定(セシウム-137):麻酔マウスの前足をテーピングダウンし、マウスを円錐型の拘束剤に配置する。黒いリードシールド(マーク)は、マウスの頭と耳を覆います。放射ビームは、照射器の背面からY軸(水平放射)の方向に向かって照射されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. レシピエントマウスのプレコンディショニング(オプション)

1. 全身照射
   1. 受け取ったマウスを均一にスライスしたパイケージに置くか、計算された半径内の反射チャンバーにマウスケージを置き、同じ照射線量を受け取ります。ただし、均一な照射を確実にするために、パイケージあたり最大8匹のマウスとマウスケージあたり5匹のマウスが推奨されます(図1A,B)。
   2. 完全な骨髄切れを達成するために、レシピエントマウスは4-24時間間隔で分離された2つの5.5 Gy画分で11 Gyの総放射線量を受け取ることを確認します。
      注:分数間の4時間間隔を実装することで最適な生着を得ることができますが、これは24時間間隔に拡張することができ、これは労働および/または照射器が利用できない場合に役立ちます。
2. 部分的にシールドされた照射
   1. ケタミン(80〜100mg/kg)およびキシラジン(5〜10mg/kg)の腹腔内注射によってレシピエントマウスを麻酔する。マウスの動きの拘束は、シールドプロセス中に均一な照射と標的臓器の効果的な保護を確保するために重要です。
   2. 胸部および腹部遮蔽の場合、X線照射器の放射線ビームをマウスに垂直に向ける(図1C)。
      1. 麻酔をしたマウスを平らなプレートに配置し、上から放射線源を中心に配置します。腕と脚を完全に伸ばした後、互いに反転したマウスを、両端を上に置きます(図1D,E)。
         注:X線照射器施設は、この実験のために、一度に2匹のマウスを均一な照射を可能にする有効半径内に配置することを可能にする。有効半径は放射線源とトレイの距離に基づいて計算されますが、同時に照射できる動物の数は特定の照射器によって異なります。
      2. マウスの足をテープでプレートに固定し、照射手順中にマウスが固定化されるようにします。保護が必要な領域をカバーするように、鉛シールドを配置します。
      3. 胸部シールドの場合、マウスのキシスターナム骨から胸腺までの長さを測定し、照射源から十分な保護を提供する厚さを計算して、リードシールドを準備します。下端がキシヒステルナム骨に合うようにリードシールドを配置します。リードバリアの上端は胸腺の近くに収まります(図1D)。
      4. 腹部のシールドのために、マウスのアヌスから横隔膜までの長さを測定し、照射源から十分な保護を提供する厚さを計算することによって、リードシールドを準備します。リードシールドを配置して、下端がアヌスと揃うようにします。リードシールドの上端はダイヤフラムの下に収まります(図1E)。
         注: コホート間で一貫性のあるリードシールドをローカライズすると、マウスのサイズに関してある程度の変動が減少する可能性があります。
   3. ヘッドシールドの場合は、セシウムの放射ビームをマウスに水平に向けます。
      1. 麻酔付きマウスの前足を腹部に慎重にテープで貼ります。これにより、腕は完全な照射を受け、シールドで覆われないようにします。
      2. ヘッドシールドの場合は、リードシールドの内側に収まる円錐型の拘束器にマウスを置きます。マウスが円錐型の拘束器の内側に入ったら、リードシールド内のスロットに拘束器を差し込みます(図1F)。リードシールドは、マウスの頭部と耳(約3.2cm)を完全に覆い、残りのマウスの体を照射のために露出させる必要があります。シールド内部の拘束剤の位置は、シールドの内側または外側にさらにスライドさせることによって、異なるサイズの動物に合うように調整することができます。
      3. 照射器の内側にマウスを置き、照射源に垂直に置く。
   4. マウスを4~24時間間隔で分離した2つの5.5 Gy分光(合計11 Gyの線量)に曝露する。
   5. 各照射分数の後、加熱されたマットの上または赤いヒートランプの下に麻酔をしたマウスでケージを置き、低体温症を防ぎ、麻酔からの回復を助けます。
      注:ランプを使用する場合は、熱を逃れることができないため、麻酔マウスを過熱しないように注意してください。前述のように、動物の位置決めと鉛シールドの厚さは、照射器の特定の特徴(ビームの放射タイプ/方向など)に基づいて研究によって異なる場合があります。研究者はそれに応じて実験を調整する必要があります。

3. 骨の分離

注:理想的には、ドナーマウスとレシピエントマウスは、年齢が8〜12週以内に似ているはずです。少なくとも3匹のマウスをドナーとして使用する(単一ドナーではなく)不均一性を最小限に抑えることが好ましい(同じ遺伝子型のマウスを用いた場合でも)。1匹のマウスの6つの骨(2つの大腿骨、2つの脛骨、2つの上腕骨)から約4000万個の未分離骨髄細胞を得ることができる。500万個の骨髄細胞を各レシピエントマウスに移植することは、通常、生着を保証する。

1. 麻酔をせずに子宮頸部脱臼(細胞の化学的汚染を避ける好ましい方法)によってドナーマウスを安楽死させ、各マウスを吸収パッドに置く。
2. 70%エタノールスプレーを使用して皮膚を消毒する。
3. 小さな横方向を肋骨ケージの下の皮膚に切り取り、切開の両側で皮膚をしっかりと保持し、頭と足に向かって反対方向に引き裂きます。すべての手足から皮膚を剥がします。
4. 肩と肘の関節を切り取り、キンワイプの助けを借りて取り付けられた筋肉と結合組織を取り除き、上腕取りを得る。
5. 大腿骨と股関節の間の股関節を慎重に外します。大腿骨の頭に沿ってカットし、脚を取り外すために鈍いはさみを使用してください。膝関節を切って大腿骨と脛骨を分離し、キムワイプの助けを借りて取り付けられた筋肉と結合組織を慎重に取り除き、大腿骨と脛骨を収穫する。
   注:このステップ中に骨の骨の状態をそのまま維持するために特別な注意を払ってください。無菌性の損失による骨折を捨てます。股関節の骨や脊椎の骨は、大腿骨、脛骨、上腕骨に加えて収集することができます。脊椎骨を収集するには、モルタルと害虫を使用して骨を粉々に粉砕し、骨髄細胞を収穫することができます。
6. 同じ遺伝子型のマウスから単離された骨を、20 mL氷冷滅菌PBSを含む50mLの円錐状チューブに入れ、さらに使用するまで氷の上に保管します。一致した遺伝子型を持つチューブに骨を正しく配置するために特別な注意を払ってください。
7. 各マウスの間に各ドナー動物の変更手袋について上記の手順を繰り返します。また、各マウスの間に70%エタノールを使用して、清潔なはさみや他の器具。

4. 骨髄細胞の分離

メモ:バイオセーフティクラスIIキャビネットで次の手順を実行します。

1. チューブセットの準備:18G針を使用して無菌0.5 mLマイクロ遠心分離管の底に小さな穴を開け、底部に100 μLの氷冷滅菌PBSを含む無菌1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。
   注:6つの骨だけが0.5 mLマイクロ遠心分離管に収まるので、すべてのボーンを同時に処理するのに十分なチューブセットを準備することをお勧めします。
2. PBSを吸引し、単離した骨を無菌100mm細胞培養皿に移す。細かい鉗子を使用して各骨を保持し、慎重にオートクレーブで滅菌された小さなはさみを使用して各端から骨端を切断します。準備したチューブ セットに切断したボーンを配置します。
3. 4°Cで 35s の10,000 x gでチューブを遠心分離します。
4. 遠心分離後、骨から骨髄が正常に除去されたことを確認します。骨は、1.5 mLマイクロ遠心チューブの下部に比較的大きな赤いペレットで白と半透明に表示される必要があります。0.5 mLマイクロ遠心チューブを廃棄します。
   注: 目視検査で 1.5 mL チューブの下部にある骨髄の検出に失敗した場合は、ボーンを再度切断し、ステップ 4.3 を繰り返します。
5. 骨髄を氷冷PBSの1mLで再懸濁し、同じ遺伝子型から一致した50 mL円錐形チューブに細胞懸濁液を移す。
6. 細胞を18Gの針に10mLの注射器で10回通して解約する。
7. 70 μmのセルストレーナーを通して単一細胞の懸濁液をフィルターします。10 mLの最終体積に追加の氷冷PBSを追加し、ピペットエイドの穏やかな使用を通じて細胞を再中断します。
8. 遠心分離機 310 x g で 4 °C で 10 分間
9. 上清を吸引し、細胞ペレットを10 mLの無血清RPMI培地で再懸濁する。セルカウント用にこの材料の30 μLをスペアします。
10. 細胞カウンターで細胞濃度を決定し、移植に必要な細胞懸濁液の量を計算する。100%BMTの例では、各レシピエントマウスに5 x 10^6骨髄 細胞が必要です。
    注:競合するBMTの場合は、ドナー細胞(例えば、CD45.2⁺⁾および競合細胞(例えば、CD45.1+)の混合物を含む合計5 x 10^6骨髄細胞を調製する。余分な骨髄細胞を準備することは強くお勧めします.例えば、実験群ごとに10匹のレシピエントマウスがある場合、我々は通常、12匹のレシピエントマウスに十分な細胞を準備する。
11. 計算されたセル懸濁液の体積を新しい50 mL円錐形チューブに移します。遠心分離機 310 x g で 4 °C で 10 分間
12. 上清を吸引し、計算された無血清RPMI培地量を用いて細胞を再懸濁し、適切な細胞密度および体積を達成する。通常、200 μL は、レトロ軌道射出に最適なボリュームです。

5. 照射マウスへの骨髄細胞の移植

1. 5%のイオブルランでレシピエントマウスを麻酔する。
2. マウスは麻酔を受けているが、インスリン注射器を用いた28~30G針を用いて、200μLの骨髄細胞をレトロ軌道静脈にゆっくりと注入する。
   1. あるいは、尾静脈静脈注射および大腿骨内髄内注射によりドナー細胞の送達を行い、最大体積はそれぞれ0.2mL及び25μLである。
3. 細胞が注入されたら、痛みを和らげるために、プロパラカイン含有点眼薬を目の表面に滴下します。その後、動物は意識を取り戻すことができます。

6. 無条件マウスへの骨髄細胞移植

1. 5%イオブルランを吸入することにより、レシピエントマウスを麻酔する。
2. 5 x 10⁶ の未分離骨髄細胞を、28~30 G のインスリン注射器を用いて、いずれかの遺伝子型からレトロ軌道上に非照射されたレシピエント マウスに注入します。
3. 3日間連続してステップ6.1と6.2を繰り返し、レシピエントマウスを合計1.5 x 10^7骨髄 細胞で移植する。
   注:事前調整手順のない養子のBMTは3日間連続して骨髄移植を必要とするため、注射ごとに目を交互に試みる必要があります。
4. 注射後、プロパラカイン含有点眼薬の滴を罹患した眼に投与する。

結果

ドナー細胞の生着に対する3つのBMT/プレコンディショニング方法の効果を比較するために、末梢血および心臓組織におけるドナー細胞の分画を、1ヶ月後のBMT後のフローサイトメトリーによって分析した。特定の白血球マーカーについて分離細胞を染色し、白血球の異なるサブセットを同定した。これらの実験では、野生型(WT)C57BL/6(CD45.2)ドナー骨髄細胞をWT B6に送達した。SJL-Ptprc^aPrpc^b/BoyJ (CD45.1) レシピエントマウスは、ドナー細胞とレシピエントの細胞を区別する。使用されたフローサイトメトリーの測定法は、前に、補足図1のWang et al.⁹で説明した。

全体照射(TBI)処置群は、4時間間隔で分離された2つの5.5 Gy画分において11Gyの総致死量量に続いて5 x¹⁰⁶骨髄細胞を受けた。レシピ...

ディスカッション

クローン造造の研究では、総ボディ照射を伴うBMT、部分シールドによる照射を伴うBMT、およびプレコンディショニングを伴わないあまり一般的に使用されないBMT法(養子BMT)の3つの方法について説明した。これらの方法は、クローン造造が心血管疾患に及ぼす影響を評価するために使用されてきた。研究者は、研究の特定の目的に合わせてこれらの方法を変更することができます。

クローン造造機モデル
クローン造血は、突然変異造血細胞が野生型細胞と競合し、時間の経過とともにクローン性優位を得る現象です。この競争のモデルを作成するために、マウスは、遺伝的に異なる細胞の混合物からなる骨髄を投与することができる。一般的に、この混合物は、蛍光タグまたは異なる汎白血球マーカー(すなわち、CD45.1およびCD45.2)で標識された変異型および野生型細胞を含むであろう。例えば、Tet2-mediaedCHを模倣するモデルを作成する場合、CD45.1 Tet2⁺⁺ドナーから生まれた細胞の90%とCD45...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5ml微量遠心分離機	フィッシャーサイエンティフィック	05-408-121	一般供給
1.5ml微量遠心分離機	フィッシャーサイエンティフィック	05-408-129	一般供給
1/2 cc LO-DOSE インスリン注射器	エクセリント	26028	一般供給
無水エタノール (200 prfof)	フィッシャーケミカル	200559	一般供給
BD 1mL ツベルクリンシリンジ 25G 5/8 インチ ニードル	ベクトン ディキンソン	309626	一般供給
BD プレシジョングライド ニードル 18G (1.22mm X 25mm)	ベクトン ディキンソン	395195	一般供給
セシウム-137 照射器	J. L. シェパード	Mark IV	機器
DietGel 76A	クリア H2O	70-01-5022	一般供給
ファルコン 100 mm TC 処理細胞培養ディッシュ	ライフサイエンス	353003	一般供給
ファルコン 50 mL 円錐形遠心チューブ	フィッシャー サイエンティフィ	352098	一般供給
フィッシャーブランド 滅菌細胞ストレーナー、70 μメートル	フィッシャーサイエンティフィ	22363548	一般供給
Graefe鉗子	ファインサイエンスツール	11051-10	一般供給
硬化ファインはさみ	ファインサイエンスツール	14090-09	一般供給
Isothesia(イソフルラン)溶液	ヘンリーシャイン	29404	溶液
ケタミン	Zoetis	043-304	注射
Kimwipes デリケート タスク ワイパー	Kimtech Science	KCC34155	General Supply
PBS pH7.4 (1X)	Gibco	10010023	Solution
RadDisk –げっ歯類照射器ディスク	Braintree Scientific	IRD-P M	一般供給
RPMI 中 1640 (1X)	Gibco	11875-093	中
スルファメトキサゾールとトリメトプリム	TEVA	0703-9526-01	注射
キシラジン	Akorn	139-236	注射
X 線照射器	放射線源	RS-2000	機器