ファクトブラトサーモビア家電におけるゲノム編集のための卵マイクロインジェクションと効率的な交配

Summary

我々は、卵の飼育、マイクロインジェクション、およびゲノム編集後に変異株を生成し維持するために、ファイヤーブラット サーモビア家電 の効率的な交配のための詳細なプロトコルを提供する。

Abstract

ファブレット サーモビア家畜は 、地球上で成功した進化放射線につながった昆虫の発達メカニズムを研究するのに適した代謝された翼のない種です。ゲノム編集などの遺伝的ツールの応用は、Evo-Devoアプローチにおける進化的移行を担う遺伝的変化を理解する鍵です。この記事では 、T.家産の変異株を生成し、維持するための現在のプロトコルについて説明します。我々は、報告された湿式注入法の代替として、注入された胚において安定的に高い生存率を得ることを可能にする乾燥注入方法を報告する。また、成人との交尾を行い、その後の世代を高効率で取得するための最適化された環境設定を報告します。我々の方法は、非伝統的なモデル生物にゲノム編集方法をうまく適用するために、種固有の生物学を考慮に入れる重要性を強調している。これらのゲノム編集プロトコルは 、T.家畜 を実験室モデルとして実施し、この種における有用な遺伝ツールの開発と応用をさらに加速させるのに役立つと予測しています。

Introduction

熱藻家畜は、最も基礎的な昆虫の注文の1つに属しています, Zygentoma, 先祖の代謝と翼のないライフサイクルを保持します.このような基底系統的位置と先祖の特徴は、この種を地球上の昆虫の成功の基礎となるメカニズムを研究するための魅力的なモデルとして設定し、記述された動物種の70%以上をカバーする^1。T. 家産は、比較的短いライフサイクル(胚から生殖成人までの2.5~3.0ヶ月)などの実験室モデルとして適した特徴があるため、主に昆虫生理学の祖先特性を研究するために主に使用されてきました。図 1A)そして簡単な繁殖。過去30年間で、ボディプラン、神経分化、概日リズム^2、3、4などの様々な形質の祖先の特徴を調査するために、その使用が拡大されました。

T.家産における高度な遺伝ツールの適用は、広い研究分野におけるこのような貢献をさらに加速させる可能性がある。胚、ニンフ、および成人におけるRNA干渉(RNAi)媒介遺伝子ノックダウンがT.家畜^4、5、6で報告されている。全身RNAiの効率は依然として種に依存性が高く、例えば、コレオプテラでは一般的に高いが、鱗翅目の順序^は7.T.ドメダナのRNAiノックダウンの効率と持続時間はまだ評価されていません。RNAiに加えて、我々は以前にT.家産8で成功したCRISPR /Cas9媒介遺伝子ノックアウトを報告^{しました。}CRISPR/Casシステムは、特に標的遺伝子ノックアウトの昆虫のゲノム編集に広く応用されています。その使用は、CRISPR/Casシステムの成分を核⁹に送達するためのプロトコルの確立後に、遺伝子レポーターアッセイ、細胞系譜追跡、およびノッキングイン外因性構造による転写活性の操作などの他の用途に拡大することができる。公表されたゲノムアセンブリ¹⁰と組み合わせることで、T.家畜におけるCRISPR/Casベースのゲノム編集の広い使用とさらなる発展は、昆虫の顕著な適応成功の背後にある進化メカニズムに焦点を当てた研究を容易にするだろう。ここでは、胚微小注入とCRISPR/Cas9を用いて変異株を生成する成人T.家産を交配するための詳細なプロトコルについて説明する。この新しい方法を考えると、我々はこれらの技術の成功した応用のための非伝統的なモデル種の独特な生物学を考慮することの重要性を議論する。

Protocol

1. 実験室コロニーのメンテナンス

1. 野生型および変異体集団の維持のために、通常の人工魚の食糧を備えた大きいプラスチック容器(460 mm x 360 mm x 170 mm)、上部に換気穴があるプラスチックコップの水、昆虫を隠す折り紙、そして卵を産む層状綿を使用する(図2A)。すべての T.家産 培養物を37°Cインキュベーター内に保管し、各容器内の相対湿度(RH)を60~80%に設定します。
   注 :T.家電は 大気¹¹から水蒸気を吸収するので、直接給水は必要ありません。適切なRHは、上部に換気穴を含むプラスチックカップまたは各容器内の蓋なしのカップからの水蒸気の存在のために維持される。培養物を含むインキュベーター全体の中で加湿する必要はありません。このプロトコルで説明されている条件下での各開発段階の概算の持続時間を 図 1に示します。発達速度は、温度やRH¹²を変更することによって調整することができます。
2. 定期的に食べ物を追加します。水が乾く前に水を加えます。
3. 成人が汚れた環境や人口密度の高い環境で卵を産むのをやめていることを考えると、少なくとも3ヶ月ごとに新しいクリーンコンテナに集団を移す( 議論を参照)。

2. 卵の採取とマイクロインジェクション

1. ガイドRNA(gRNA)を設計する
   1. 必要な各標的に対してgRNA配列を設計し、ゲノムアセンブリに対してgRNA配列をBLASTして、可能なオフターゲット認識部位をチェックする。
   2. メーカーの指示に従ってgRNAを合成し、精製^{する 8}.
      注:例として、ATP結合カセットトランスポーター 白色 遺伝子を標的とする場合、20bp標的配列を設計し、2つの合成DNAオリゴヌクレオチド5'-TAATACGACTATATATAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGGAC-3'および5'TTCTAGCTCTAAAACATCGCGCGCGCGCGGTACAACACTTA-3'を命じた。DNAテンプレートは、これら2つのオリゴヌクレオチドをアニールしてPCR増幅し、次いでgRNAをT7 RNAポリメラーゼで鋳型からインビトロに転写して調製した。
2. 卵のコレクションのコロニーを準備します
   1. 約20人の男性と20人の女性の成人を中型容器(200mm x 150mm x 90 mm)に、食料、給水、折り紙、および産卵用の小さな層状コットンを入れ替える(図2B)。
   2. ゲノム編集に使用する短期間で多数の段階的胚を得るために、いくつかのコロニーを設定する。
      注:約20〜40個の卵は、37°Cで8時間後にコロニーから採取される予定です。 通常、新しい環境への適応のために、転勤の成人が卵を産み始めるのに数日かかります。
3. 注射の日に、容器の中の綿を新しいものに交換してください。
4. 76 mm x 5 mm 両面テープを通常の 76 mm x 26 mm ガラス スライドに貼ります。
5. 8時間後、鉗子を使用して層を分離することによって、層状綿から卵を収集します。
6. 濡れたペンキのブラシを使って両面テープに卵を合わせ、卵の間に2mmの距離を保ちます。卵の縦軸が注入側に向かるように、すべての卵の向きを設定する必要があります(図3A)。注入の間にしっかり保持するためのペイントブラシで卵をそっと押し下げます。
   注:このプロトコルでは、真菌は濡れた暖かい状態で損傷した注入された卵で速く成長します。卵の間の距離を保ち、クロス汚染や真菌の膨張を防ぐことが重要です。
7. gRNAとCas9タンパク質を、それぞれ100 ng/μLと500 ng/μLの最終濃度に混合します。蒸留水を希釈に使用してください。リボヌクレオタンパク質複合体形成を促進するために室温で10分間ミックスをインキュベートし、氷の上にミックスを保ちます。
   注:1%の最終濃度でニュートラルレッドを注入溶液に加える可能性があり、注入された量を監視することができます。
8. マイクロローダーを使用してガラス注入キャピラリーにgRNA/Cas9溶液の2μLをロードします。注入前に溶液に気泡がないことを確認してください。必要に応じて、針をタップして気泡を取り除きます。
   注: この実験では、既製の針を使用して細かい針先を得ます(図3B)。代わりに、似たような形の自家製針を使用することができます。
9. 以前にgRNA/Cas9溶液を搭載したガラス注入毛細管をマニピュレータを装備したホルダーに固定し、ホルダーを電子マイクロインジェクターに接続します。
10. 針先の形状を、詰まりを防ぎ、一連の注射を通してより優れた耐久性を得るために鉗子でわずかに壊すことによって、針先の形状を最適化します(適切な針の例を 図3Cに示します)。
    メモ:詰まった針を変更することをお勧めします。鉗子で再び壊れた場合、同じ針を注入し続けることは可能ですが、より広い先端はより多くの卵の損傷をもたらし、生存率を低下させる。 T.家畜卵 は柔らかく壊れやすいので、注射後の生存率が高いために細かい針先を保つことが重要です。
11. 卵の縦軸の中点に針を挿入し、わずかな量の溶液を注入します(注射量の参照については 図3D–H を参照)。注射時に、針先の形状に応じて電子マイクロインジェクターの構成を調整します。
    注:注射中に一定の圧力を加えることをお勧めします、そうでなければ粘着性の卵の内容物は、ガラス針に簡単に流れ込み、それを詰まらせることができます。溶液は、注入される液体の量に応じて、短い圧力パルスまたは一定の圧力で注入することができる。針の先端が広い開口部を持つ場合、あまりにも多くの溶液が卵に注入され、致死性を引き起こすことに注意してください(図3F-H)。その場合、一定の圧力で液体の流れを一定に保ち、針を卵に挿入してすぐに引き出します。それがあまりにも多くのオーバーフローを引き起こすか、卵が破裂した場合は、針を変更します。
12. 注入した卵の数に適したサイズの容器に入れておきます (<20 卵: 小皿; >20卵: 中型容器) 60%-80% RHと37 °C.

3. 交配

1. 注入された卵を定期的にチェックし、損傷した卵を鉗子で捨てて真菌の増殖を避ける(図3I,J)。卵の上にあまりにも多くの真菌が成長している場合は、70%のEtOHで卵の表面をきれいにします。
2. 孵化前(産卵後37°Cで約10日間)、注入した卵を入れたガラススライドをタルカムパウダーに浸し、両面テープの表面をコーティングします。これは、孵化したニンフの積み重ねを避けるでしょう。粉末コーティングされたガラススライドを、昆虫を隠すために食べ物、水、折り畳まれた紙を入れた中型容器に移します。
3. ニンフが孵化した後、ガラスのスライドを取り外します。成人になるまで定期的に食料を供給する。
   注:孵化後、成人に達するまでに約2.0~2.5ヶ月かかります(図1A)。成人期は、女性の発達したオビポジターに基づいて判断される(図1B)。
4. 個人を交尾するには、必要な数の野生型の女性成人を実験室のコロニーから中型容器に移し、37°Cで少なくとも14日間インキュベートして処女であることを確認します。
   注:成人T.家畜は「生殖と脱皮サイクル」と呼ばれる脱皮と交配の繰り返しサイクルを持っているので、実験室のコロニーから処女の女性を収集する必要^{はありません。}
5. 注射卵と野生型の大人から発達したオスまたはメスのG0成人を、食べ物、折り紙、G1卵を産む綿の小片を入れた小さなプラスチック皿(Ø 100 mm x 40 mm)に移します(図2C';交配皿)。交配皿を60%~80%RHの大きな容器に入れておいてください(図2C)。
   注:1対1のペアリングで高い成功率が達成されているが、成功率が高いが、成功率が高いが、複数の野生型の大人を皿に含めることができる。

4. ジェノタイピング

1. 各gRNAにPCRプライマーペアを設計して、gRNAの標的部位を含む100~200bpの産物を増幅します。その特異性を確認するためにゲノムアセンブリに対して各プライマー配列をBLASTする(図4Aにおける白色遺伝子の標的化の例を示す)。
2. G0成人の生殖系列変換を確認してください。
   1. 卵が産まれた5日後、各G0成人ペアから0.2mLチューブに個々のG1卵を採取する(1株当たり1個の卵、収集したサンプルを-20°Cで長期保存する)。卵を収集するために綿の層を分離します。
      注:生殖系列伝達の成功を評価するために、各交配ペアから少なくとも12 G1ニンフを遺伝子型化することをお勧めします( 代表結果を参照)。
   2. 各チューブに0.25 mg/mLプロテイナーゼK溶液(トリスEDTAバッファーに溶解)を15μL加え、サンプルを爪楊枝で短時間均質化し、55°Cで3〜16時間インキュベートします。
   3. 95°Cで10分間サンプルを配置することにより、プロテアーゼKを不活性化します。
   4. 各チューブに90μLの蒸留水を加え、よく混ぜます。ステップ4.1で設計されたプライマーを含む10 μL PCR反応ミックスで2μLの上清を使用してください。
      注: 粗テンプレート用に最適化された DNA ポリメラーゼを使用すると、十分な PCR 増幅が得られるようにすることをお勧めします。
   5. PCR産物を解析するには、マイクロチップ電気泳動システムを用いてヘテロデュプレックスモビリティアッセイ(HMA)を^{実行する(}図3B;Ohdeら、2018を参照)。
      注:突然変異は、2つの代替方法で評価することができます:(1)標準ゲルポリマーを有するHMA(例えば8%ポリアクリルアミド^14;(2)T7エンドヌクレアーゼを用いたPCR産物の消化、続いてアガロースゲル電気泳動^15.
   6. 生殖細胞系列に変異を含むG0成人から生じるG1ニンフのみを保管し、他の人を捨てる。
3. G1ニンフ/大人の個別ジェノタイピング
   1. G1ニンフを吸引器またはペイントブラシで24ウェルプレートに分離します。24ウェルプレートを大きな容器(例えば、このプロトコルで使用される中型コンテナ)に、上記のように給水で配置し、RHを60%~80%に保つ(図1D)。人工的な通常の魚の食糧の供給を維持する(図1D')。
      注:このステップはニンガルステージと成人段階のどの時点でも実行できますが、成人期に達した後、ペアリングの直前に実行することをお勧めします(>注射後2.5ヶ月; 図 1B)大きな容器にファブラットを維持する方が簡単だからです。個々の飼育は、次の手順で各G1ニンフの遺伝子型を追跡するために必要とされる。同じG0成体からのG1ニンフは異なる突然変異を有することができる。
   2. 鉗子を使用してニンフ/成体からcerciとコーダルフィラメントをつまんで引っ張り、50 μL EtOHを含む0.2 mLチューブに集めます(収集したサンプルを-20°Cで長期保存してください)。
      注:ティッシュサンプルは静電気によるこれらの小さいサンプルの損失を防ぐのでEtOHで集められる。昆虫の動きを止める必要がある場合は、組織サンプルを採取する際に氷上でニンフ/成体を麻酔します。 T.家畜は 氷の上で長期間冷却した後に生き残ることができないので、1分以上麻酔せず、すぐに室温に戻してください。セルシと尾状フィラメントのアブレーションは、死亡率の増加を引き起こさない。
   3. サンプルチューブを熱ブロックに開けて70°Cで15分間開き、EtOHを蒸発させておきます。
   4. ジェノタイピングの場合は、ステップ 4.2.2 ~ 4.2.5 を繰り返します。
   5. 変異バンドパターンが観察されたPCR産物を、標準のサンガーシーケンシングサービスに提出します。
   6. G1ニンフ/成人に所望の変異を保持し、他の変異を破棄します(代表的なシーケンス結果については 図4C を参照)。
4. 交配皿に所望の突然変異を含む成人を渡り、次の世代を得てホモ接合突然変異株を確立する。

Results

私たちの手では、十分な先端を持っている場合、約100個の卵が単一の注射毛細管で十分に注入することができます(図3C)。産卵後の最初の8時間以内に胚中にgRNA/Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を注射すると、gRNA標的部位にインデルが生じる。これは、注入された生成のいくつかの細胞(G0)におけるビアレスリック突然変異を引き起こし、したがって変異モザイクの型は、通常G0で得られる。例えば、このプロトコルを用いて白色遺伝子を標的とするgRNAを注入した場合、G0ニンフの32.6%がそれらの化合物眼および後方領域における色素沈着の部分的な損失を示す(図5)8。

現在記載のドライ注射法を用いて、80~120個の卵子を注入すると、注入された胚の生存率は40%~60%と高い。これは、卵をアガロースプレートに注入して維持する以前の湿式注入法とは対照的であり、時には生存率が10%未満になる。

Discussion

CRISPR/Cas9を用いた所望の T.家畜 変異体の生成に成功するためには、注射のために十分な数の段階的胚を収集することが最初に重要である。十分な数の T.家畜 卵の一定のコレクションの場合、重要なのは、すべての成体モルト¹³の後に繰り返される一連の複雑な交配行動の正常な完了を助けるので、より低い人口密度を有する容器の適切なサイズを選択することです。男性 のT.家畜成人 は、精子を介して女性に間接的に精子を移す。Sweetman(1938)は、男性成人が交配行動の開始から精子¹²の配置まで20〜35分かかると報告した。他の個体による交配ペア間の相互作用の妨害は、密な環境でより頻繁に起こり得る受精の成功を妨げる可能性が高い。

卵は、私たちのプロトコルで十分な卵を収集するために容器の中に綿を交換した後8時間で収集されますが、注入された材料が核の大部分に送達される機会が多い場合、卵子を収集し、より短い時間(例えば、産卵後4時間)に注入す...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24ウェルプレート	Corning	83-3738
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 & micro;g	Integrated DNA Technologies	1081060
24ウェルプレートの静電気除去用	電防止クリーナー	宝山	Z-292
バリアボックス 20.7L	AS ONE	4-5606-01	大型容器
FemtoJet 4i	エッペンドルフ	5252000013	電子マイクロインジェクター
フェムトチップII.、インジェクションキャピラリー	エッペンドルフ	5242957000	ガラス注入キャピラリー
ハイパック 2440mL	AS ONE	5-068-25	ミドルサイズコンテナ
インキュベーター	パナソニック	MIR-554-PJ	37°用;Cインキュベーション。インキュベーター内で加湿する必要はありません。
KOD Fx Neo	Toyobo	KFX-101	ジェノタイピング用PCR酵素。粗雑なテンプレートからの増幅に最適化されています。
	エッペンドルフ	5242956003
マニピュレーター	ナリシゲ	MM-3
を保持するための	マグネットスタンド	成重	GJ-8
			。マイクロインジェクションには35倍以上の倍率で十分です
MultiNA	島津	MCE-202	マイクロチップ電気泳動システム
NiceTac	ニチバン	NW-5	スライドガラスに卵を乗せる両面テープ
ペイントブラシ(馬の毛)	ぺんtel	ZBS1-0
植物培養皿	SPL ライフサイエンス	310100	大型および中型容器の嵌合皿と水供給
プロテイナーゼK、組換え、PCRグレード Pichia pastoris	Roche	3115836001
SZX 12	オリンパス	SZX 12	マイクロインジェクションには35倍以上の倍率で十分です
タルカムパウダー	マルイシ	877113
テトラゴールド 成長	スペクトル ブランド		人工レギュラーフィッシュフード